牛子儒 王 洋 陶立元 鄭曉英 嚴(yán) 杰 李 蓉

北京大學(xué)第三醫(yī)院(100191)

80年代早期國(guó)外學(xué)者開始應(yīng)用冷凍解凍后人成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精-胚胎移植(IVF)并使患者成功受孕[1]。隨著輔助生殖技術(shù)的廣泛開展及細(xì)胞冷凍、低溫保存技術(shù)的不斷改進(jìn)，凍融卵母細(xì)胞的復(fù)蘇率、受精率和妊娠率都有了顯著提高。美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)也于2013年提出“人成熟卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)可以廣泛應(yīng)用于臨床”[2]。但目前卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)在我國(guó)尚未廣泛開展，僅限于取卵日男方獲取精子失敗而進(jìn)行的“應(yīng)急性卵母細(xì)胞冷凍”，對(duì)于可能影響卵細(xì)胞復(fù)蘇的因素尚不十分明確。年齡是影響女性生育力的重要因素[3]，隨著年齡的增加，卵細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量均顯著下降[4]。年齡對(duì)人成熟卵母細(xì)胞解凍復(fù)蘇效果的影響，以及不同年齡段人群冷凍卵母細(xì)胞復(fù)蘇效果的影響因素是否存在差異等相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本研究回顧性分析因男方原因行應(yīng)急性卵母細(xì)胞冷凍保存的臨床資料，探討不同年齡段女性卵母細(xì)胞解凍復(fù)蘇的影響因素，為臨床決策提供建議。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象與分組

回顧性分析2007年8月-2019年12月在本院實(shí)施IVF助孕，取卵日因男方獲取精子失敗而接受應(yīng)急性成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的不孕癥患者臨床資料。其中男方因素獲取精子失敗包括因突發(fā)疾病或意外事故不能到醫(yī)院取精、不能進(jìn)行手淫或手術(shù)[經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)(PESA)和顯微附睪精子抽吸術(shù)(MESA)]取精、未能獲得足夠的精子，以及其他意外精子收集失敗。排除女方因惡性腫瘤、卵巢儲(chǔ)備功能下降等因素而行生育力保存的患者。根據(jù)卵母細(xì)胞解凍后是否存活分為存活組(2003例)和未存活組(688例)，并按年齡分層為<35歲組(2297例)和≥35歲組(394例)。所有患者行成熟卵母細(xì)胞玻璃化凍融、胚胎培養(yǎng)和移植前均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1促排卵與卵母細(xì)胞玻璃化冷凍解凍均按照本院常規(guī)操作進(jìn)行[5]。 復(fù)蘇培養(yǎng)后，觀察卵母細(xì)胞膜完整、胞質(zhì)均勻有光澤者視為存活[6]。

1.2.2分析指標(biāo)包括臨床病史、內(nèi)分泌和胚胎實(shí)驗(yàn)室相關(guān)數(shù)據(jù)：女方年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、不孕年限、妊娠次數(shù)、生產(chǎn)次數(shù)、不孕類型(原發(fā)/繼發(fā)性不孕)、IVF助孕指征(男方因素，女方因素或雙方因素)、基礎(chǔ)性激素水平、竇卵泡數(shù)(AFC)、促性腺激素(Gn)應(yīng)用總劑量及時(shí)間，卵母細(xì)胞凍存時(shí)間和是否存在子宮內(nèi)膜異位癥(EM)等疾病[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般資料

共有251例不孕患者2691枚成熟卵母細(xì)胞納入本研究，卵母細(xì)胞解凍復(fù)蘇存活率為74.4%(2003/2691)，解凍存活組年齡(29.1±4.6歲)小于未存活組的年齡(30.2±5.0歲)(P<0.001)。

2.2 <35歲女性卵母細(xì)胞凍融復(fù)蘇效果的影響因素分析

解凍存活組的年齡、生產(chǎn)次數(shù)，基礎(chǔ)FSH水平和Gn用量均低于未存活組，而AFC高于未存活組(P<0.05)，且解凍存活組EM和卵巢低反應(yīng)的發(fā)生比例低于未存活組(均P<0.05)。見(jiàn)表1。將有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的變量納入logistic回歸模型，分析顯示，女方年齡大(OR=0.94，95%CI 0.91～0.97)、罹患EM(OR=0.68，95%CI0.49～0.95)為卵母細(xì)胞解凍復(fù)蘇的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而AFC多(OR=1.03，95%CI 1.01～1.04)為解凍復(fù)蘇的獨(dú)立保護(hù)因素。

2.3 ≥35歲組卵母細(xì)胞凍融復(fù)蘇影響因素分析

解凍存活組女方年齡、妊娠次數(shù)、基礎(chǔ)雌二醇(E2)和卵子凍存時(shí)間均低于未存活組，而不孕年限、生產(chǎn)次數(shù)和基礎(chǔ)促黃體生成素(LH)均高于未存活組，且解凍存活組EM和繼發(fā)不孕的發(fā)生比率低于未存活組(均P<0.05)。見(jiàn)表1。將有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的變量納入logistic回歸模型，分析顯示，基礎(chǔ)E2水平高(OR=0.98，95%CI 0.98～0.99)、凍存時(shí)間長(zhǎng)(OR=0.98，95%CI 0.97～0.99)、罹患EM(OR=0.15，95%CI 0.06～0.36)和繼發(fā)不孕(OR=0.22，95%CI 0.13～0.37)為解凍復(fù)蘇的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表1 不同年齡段卵母細(xì)胞解凍復(fù)蘇影響因素的單因素分析

3 討論

1999年，Kuleshova[8]報(bào)道了世界首例卵母細(xì)胞冷凍保存后成功妊娠分娩的病例，標(biāo)志著卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)的突破。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于凍融卵母細(xì)胞的研究主要集中在IVF結(jié)局影響因素的探究。一項(xiàng)納入10個(gè)研究2265個(gè)卵母細(xì)胞凍融周期的meta分析提示，隨著年齡的增長(zhǎng)，解凍卵母細(xì)胞后的活產(chǎn)率明顯下降[9]。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)有關(guān)卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后ICSI妊娠結(jié)局的研究也提示女方年齡及成熟卵數(shù)對(duì)卵母細(xì)胞解凍的妊娠結(jié)局有重要影響[10]。大多數(shù)研究表明，凍融卵母細(xì)胞周期與新鮮取卵周期的妊娠結(jié)局無(wú)明顯差異[11]。但凍融損傷可能會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞的細(xì)胞器、紡錘體、染色體和表觀遺傳學(xué)出現(xiàn)損傷或變化[12]。本文數(shù)據(jù)顯示，近1/4的卵母細(xì)胞解凍后可能無(wú)法存活，女方年齡、卵巢儲(chǔ)備功能、卵子凍存時(shí)間和罹患子宮內(nèi)膜異位癥等因素均會(huì)影響成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后的解凍復(fù)蘇效果。

年齡是導(dǎo)致女性生育能力下降的重要因素，卵母細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量均隨著年齡的增長(zhǎng)而降低。女性35歲之后卵巢儲(chǔ)備功能和卵母細(xì)胞質(zhì)量明顯下降，流產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[3]。這可能與衰老伴隨的分子生物學(xué)改變密不可分。衰老使女性生殖系統(tǒng)中的氧化磷酸化和腺苷三磷酸水平下降，輔酶Q10的利用率下降，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體功能受損[13]，引起卵母細(xì)胞質(zhì)量下降。此外，不同年齡女性的成熟卵母細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)存在顯著差異，這意味著非編碼轉(zhuǎn)錄組可通過(guò)調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄后翻譯機(jī)制，影響卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能[14]。本研究也提示女性年齡是影響卵母細(xì)胞解凍復(fù)蘇后是否存活的重要因素，年齡越大，卵母細(xì)胞解凍復(fù)蘇的成功率越低。

AFC是反應(yīng)卵巢儲(chǔ)備功能的重要指標(biāo)之一[15-16]，對(duì)IVF結(jié)局有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值。但受限于超聲儀器的分辨率、監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和時(shí)間的不統(tǒng)一以及無(wú)法辨識(shí)出閉鎖卵泡等因素[16]，AFC可能高估了對(duì)促排卵有反應(yīng)的真實(shí)卵泡數(shù)。本研究提示AFC是影響年齡<35歲的患者卵母細(xì)胞解凍復(fù)蘇效果的關(guān)鍵因素，這可能是由于AFC更能反應(yīng)年輕患者的卵巢儲(chǔ)備情況，間接體現(xiàn)了卵母細(xì)胞的質(zhì)量。而對(duì)于高齡女性，AFC普遍偏少，其反應(yīng)卵母細(xì)胞質(zhì)量的可行性隨之降低。

本研究提示，EM是唯一一個(gè)對(duì)兩個(gè)年齡段女性卵母細(xì)胞復(fù)蘇效果均有負(fù)面影響的關(guān)鍵因素。大量的研究已經(jīng)證實(shí)，EM是導(dǎo)致女性不孕的重要因素之一，它通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)P450芳香化酶的表達(dá)、增加活性氧生成等作用改變卵泡內(nèi)環(huán)境和顆粒細(xì)胞特征，通過(guò)減少皮質(zhì)顆粒和導(dǎo)致透明帶硬化，干擾受精、影響胚胎孵化和著床[17]。此外，EM還會(huì)造成卵細(xì)胞成熟障礙[18]、卵細(xì)胞質(zhì)量下降和基因缺陷發(fā)生率明顯增加[19]。患有EM者卵細(xì)胞凍融復(fù)蘇效果明顯下降可能與上述原因密切相關(guān)。后期可以對(duì)EM患者的卵母細(xì)胞進(jìn)行更全面的基礎(chǔ)分析，了解玻璃化冷凍過(guò)程對(duì)其的影響。

E2在調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟和胚胎著床等方面都起著關(guān)鍵作用，基礎(chǔ)E2水平是評(píng)價(jià)卵巢儲(chǔ)備功能的重要指標(biāo)，在卵巢儲(chǔ)備功能減退的患者中往往會(huì)先于卵泡刺激素(FSH)提前升高。隨著卵巢儲(chǔ)備功能的下降，卵泡期和黃體期的抑制素水平也明顯下降，削弱了對(duì)FSH的抑制作用，使得FSH峰提前出現(xiàn)，導(dǎo)致卵泡提前募集，甚至在月經(jīng)期出現(xiàn)直徑10mm以上的卵泡，升高的E2進(jìn)一步抑制FSH的分泌和釋放,出現(xiàn)月經(jīng)期基礎(chǔ)FSH水平正常但E2水平升高的現(xiàn)象。基礎(chǔ)E2升高(≥275.3pmol/L)往往預(yù)示著卵巢反應(yīng)不良、高周期取消率和低胚胎種植率[20]。本研究表明，≥35歲組，隨著基礎(chǔ)E2水平的上升，卵母細(xì)胞解凍復(fù)蘇的成功率明顯下降。對(duì)于這部分人群，可以通過(guò)基礎(chǔ)E2的水平預(yù)測(cè)卵母細(xì)胞解凍后復(fù)蘇成功率。

凍存時(shí)間是否影響成熟卵母細(xì)胞的解凍復(fù)蘇效果，不同的研究結(jié)果不一。Yan等[21]的研究提示，凍存時(shí)間越長(zhǎng)，卵母細(xì)胞的解凍復(fù)蘇率越低。而Stigliani等[22]的研究則表明冷凍本身會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞造成損傷，但凍存時(shí)間的長(zhǎng)短并不改變卵細(xì)胞的基因譜。本研究結(jié)果也提示，對(duì)年齡<35歲女性，凍存時(shí)間不影響卵母細(xì)胞的解凍復(fù)蘇；而對(duì)于年齡≥35歲女性，隨著凍存時(shí)間的延長(zhǎng)，卵細(xì)胞的解凍存活率明顯下降，這可能與高齡女性卵母細(xì)胞質(zhì)量下降、冷凍和解凍過(guò)程進(jìn)一步加速了卵母細(xì)胞的凋亡有關(guān)，但仍需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，以了解其分子水平的變化和機(jī)制。

綜上所述，年齡是影響人成熟卵母細(xì)胞解凍復(fù)蘇的關(guān)鍵因素，不同年齡段的女性，影響卵細(xì)胞凍融復(fù)蘇的因素略有不同。35歲之前，隨著年齡的增長(zhǎng)、AFC的減少和EM的發(fā)生，卵母細(xì)胞解凍失敗的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。35歲之后，基礎(chǔ)E2水平升高、凍存時(shí)間延長(zhǎng)和EM等因素均是卵母細(xì)胞解凍失敗的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素。