劉速速，李文凱，孫華*，周慶禮，于功明，馬強

(1.天津科技大學 食品科學與工程學院，天津 300457；2.齊魯工業(yè)大學 食品科學與工程學院，濟南 250353；3.上海海洋大學 食品學院，上海 201306)

近年來，由于化學抗氧化劑作為食品添加劑的不安全性，具有清除羥自由基、超氧陰離子等能力的抗氧化肽成為當前研究的熱點，這些自由基在人體正常生理代謝過程中會少量產(chǎn)生并處于動態(tài)平衡中，維持在一定水平。然而在年齡增長、身體受到創(chuàng)傷或在某些病理條件下，體內(nèi)自由基過剩就會引發(fā)人類的許多疾病，例如：癌癥、衰老、動脈硬化等[1]?？寡趸哪苡行У亟档腿梭w過剩的氧自由基水平，保護細胞和線粒體的正常結(jié)構(gòu)及功能，防止脂肪過氧化，并且?guī)椭鷻C體抵御疾病[2]。

元寶楓因其翅果形狀似中國古代的金元寶而得名[3]，屬于槭樹科、槭樹屬，落葉喬木，是我國特有的樹種。元寶楓種仁中含有豐富的化學成分，在張玉偉等的研究中元寶楓種仁70%乙醇提取物的化學成分鑒定出12種，大多為天然多酚類物質(zhì)、黃酮類化合物。在王性炎等的研究中，元寶楓籽油中富含有特殊生理功能和藥理作用的神經(jīng)酸。元寶楓籽本身也富含蛋白質(zhì)，且不含淀粉，這是植物種籽中少見的。據(jù)測定，元寶楓籽蛋白質(zhì)中含有8種人體必需的氨基酸，屬完全蛋白質(zhì)，是理想的蛋白質(zhì)資源，可作為制備食品蛋白的新資源[4-5]。元寶楓籽作為特種植物油脂新食品原料之一，含有較高含量的不飽和脂肪酸和其他多種微量元素，將其應(yīng)用于食品中能夠更加突出食品的風味與營養(yǎng)，賦予食品特殊的香味與口感，在一定程度上起到調(diào)味的作用；同時以元寶楓籽為原料制備的抗氧化肽可以制成調(diào)味品，能夠提升食品的風味，并且元寶楓籽抗氧化肽也為發(fā)酵調(diào)味品提供了一定的理論基礎(chǔ)。

本試驗以元寶楓籽為原料，制備具有生物活性的多肽。通過正交試驗設(shè)計，優(yōu)化水解條件，以獲得最佳的多肽得率。此外，通過體外清除自由基試驗研究了抗氧化肽的抗氧化活性[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

元寶楓：濰坊綠元生物科技有限公司提供；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶：均購自Novo公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：美國Sigma公司；石油醚、乙醇、鹽酸：購自成都市科龍化工試劑廠；其他化學藥品和試劑：均為分析級，購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

UV-1800PC型紫外分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；離心機 湖南湘儀實驗室儀器有限公司；電子分析天平 德國賽多利斯股份公司；恒溫水浴鍋 江蘇金壇市維誠實驗器材有限公司；pH計 上海智光儀器儀表有限公司；干燥箱 上海醫(yī)療器械五廠。

1.2 蛋白組分的制備和提取

將元寶楓種仁籽粕卷入濾紙筒中，濾紙筒上端不超過虹吸管上管口。用索氏抽提法提取分離油脂(抽提溶劑為石油醚，在溫度(85±2) ℃水浴中抽提3 h。將殘渣在破碎機中打碎，過60目篩后，再將殘渣置于研缽中研細后過篩，置于40 ℃恒溫烘箱中烘干，得到元寶楓種仁脫脂粉，即元寶楓籽粗蛋白。

1.3 蛋白酶的篩選

配制質(zhì)量分數(shù)為2%的元寶楓籽蛋白溶液，選用4種蛋白酶(見表1)，作為元寶楓籽蛋白酶解法制備抗氧化肽的備選酶[7-9]。分別調(diào)節(jié)至各自最適 pH、溫度下，分別添加15000 U/g的蛋白酶量，并在水解過程中不斷添加0.5 mol/L的堿液，用移液槍移取堿液，記錄數(shù)據(jù)，前1 h每10 min記錄一次 0.5 mol/L NaOH溶液用量，然后每0.5 h記錄一次直至水解過程結(jié)束，根據(jù)NaOH的最終用量得到水解度。酶解時間均為 4 h，隨后沸水浴加熱10 min使酶鈍化，樣品冷卻后在10000 r/min離心15 min，取出上清液，測定酶解物DPPH清除率[10]。

表1 4種酶水解的最佳反應(yīng)條件Table 1 The optimal reaction conditions for hydrolysis of four enzymes

1.4 單因素試驗

通過單因素試驗考察pH、加酶量、酶解時間、底物濃度等因素對樣品酶解度、產(chǎn)物DPPH清除率的影響。

1.5 正交試驗

采用正交試驗設(shè)計，考察pH、加酶量、酶解時間、底物濃度4個自變量對樣品水解度和產(chǎn)物清除DPPH自由基活性的影響。在初步單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇了自變量的取值范圍，獨立變量的編碼級別見表2[11]。每個試驗重復3次，見表3。所有試驗均按隨機順序進行。

表2 正交試驗因素及水平Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment

表3 正交試驗結(jié)果Table 3 The results of orthogonal test

1.6 不同分子量元寶楓籽肽的微濾分離處理

將酶解后的元寶楓籽蛋白溶液先過1.2 μm微濾膜，再過0.45 μm微濾膜[12]。將經(jīng)過微濾的元寶楓籽蛋白酶解液進行超濾分離。

1.7 多肽穩(wěn)定性的研究

對活性最高的組分進行穩(wěn)定性分析，考察了溫度、pH、NaCl濃度和葡萄糖濃度對穩(wěn)定性的影響。配制樣品濃度為5 mg/mL，分別測定其DPPH自由基清除率。

1.8 測定指標

蛋白質(zhì)在水解過程中被斷裂的肽鍵數(shù)占其總肽鍵數(shù)的百分比稱為水解度。本次試驗中采用pH-stat法對水解度進行測定,在水解過程中不斷添加0.5 mol/L的NaOH溶液，在前1 h中每間隔 10 min記錄一次0.5 mol/L NaOH溶液用量(mL)，然后每0.5 h記錄一次堿液添加量直至水解過程結(jié)束，根據(jù)NaOH的最終用量，得到水解度。水解度計算公式如下:

式(1)

式中：B為水解過程 0.5 mol/L NaOH的消耗量(mL)；Nb為水解所用NaOH的濃度(mol/L，此試驗中為0.5 mol/L)；Mp為參加水解的元寶楓籽蛋白質(zhì)量(g)；htot為單位質(zhì)量原料元寶楓籽蛋白中肽鍵的總數(shù)(mmol/g，試驗采用元寶楓籽蛋白為原料，根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸種類和百分含量計算htot= 8.232)。

α-元寶楓籽蛋白氨基的平均解離度按式(2)：

式(2)

式中：pH為酶解過程中反應(yīng)液的pH；pK為α-NH3+的解離常數(shù)(通常取數(shù)值7)。

DPPH清除率的測定：取不同質(zhì)量濃度的多肽液稀釋液2 mL，加入2 mL 0.1 mol/L DPPH無水乙醇溶液，混勻后在室溫避光反應(yīng)30 min，在 517 nm波長處測定吸光度，清除率計算見公式(3)：

式(3)

式中：Ac為用無水乙醇代替樣品液時的吸光度；Aj為加樣品用無水乙醇代替DPPH時的吸光度；Ai為加樣品與DPPH時的吸光度(DPPH的乙醇水溶液顏色為深紫色，當加入抗氧化物后，自由基被清除，DPPH溶液在517 nm處的吸光值減少，此時溶液的顏色將會從紫紅色褪至淡黃色)。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。所有試驗重復3次，對所得數(shù)據(jù)進行方差分析(ANOVA)，均數(shù)差異采用Duncan檢驗(p<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同種類的蛋白酶對制備元寶楓籽功能性肽的影響

蛋白酶種類的選擇是酶解試驗中最重要的因素之一，4種蛋白酶活力及其理論最佳水解條件見表4，在此控制水解時間均為4 h。

表4 不同蛋白酶理論最佳水解條件Table 4 The optimal theoretical hydrolysis conditions for different proteases

由表4可知，控制添加相同的酶量條件下，將不同的酶維持在其最適的水解條件。從酶的水解度看，4種蛋白酶水解能力由強到弱的順序依次為中性蛋白酶>堿性蛋白酶>木瓜蛋白酶>胰蛋白酶。比較酶解液DPPH清除率可知，用胰蛋白酶酶解得到的水解液DPPH清除率為38.845%，高于中性蛋白酶和木瓜蛋白酶等其他蛋白酶水解液的DPPH清除率。

已有研究證明蛋白水解度在小于14%時得到的水解液的抗氧化值較高，水解度較低時(6%～8%)得到的多肽抗氧化能力反而較強[13]。因此綜合水解度與抗氧化值的條件，選用胰蛋白酶作為元寶楓籽抗氧化肽制備的水解酶。

2.2 單因素試驗

2.2.1 pH值對水解度和DPPH自由基清除率的影響

由圖1可知，隨著pH值從7.5增加到7.8時，水解度和DPPH自由基清除活性增加。當pH值從8.4增加到8.7時，水解度下降；當pH值從7.8增加到8.7時，DPPH自由基清除活性下降。由于每個蛋白酶都有各自的最適pH值，當pH值高于或低于最適pH值時，蛋白酶可能發(fā)生變性或失活。因此，選擇pH值為7.8進行進一步的研究。

圖1 酶解pH對水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis pH values on hydrolysis degree and DPPH radical scavenging rate

2.2.2 加酶量對水解度和DPPH自由基清除率的影響

由圖2可知，隨著胰蛋白酶用量的增加，元寶楓蛋白的水解度和DPPH清除率不斷增加，當酶用量增加到一定程度后，水解度增加程度趨于平緩，但DPPH自由基清除率下降。胰蛋白酶用量在超過16000 U/g時，DPPH自由基清除率開始下降，且水解度的增幅也不是很明顯，僅為0.484%。因此，試驗較適酶用量為16000 U/g。

圖2 加酶量對水解度和DPPH清除率的影響Fig.2 Effect of enzyme additive amount on hydrolysis degree and DPPH radical scavenging rate

2.2.3 酶解時間對水解度和DPPH自由基清除率的影響

由圖3可知，在酶解時間為5～6 h時，水解度和DPPH清除率都在不斷上升且十分迅速。6 h時水解度和DPPH清除率分別上升到13.765%和35.748%。6 h之后DPPH清除率快速下降，在7 h后基本不變。水解度在 6 h后仍在上升，7 h后增幅不大，趨于平緩。這可能是因為隨著時間的延長，元寶楓籽蛋白的水解度也相應(yīng)增加，而7 h后由于底物蛋白已經(jīng)基本水解完全，因而水解度基本不變。但對于DPPH清除率，隨著水解的進行，抗氧化肽的含量增加，所以 5～6 h之間DPPH自由基清除率不斷升高。在6～7 h內(nèi)，DPPH清除率下降，在7 h后趨勢平緩。原因可能是隨著時間延長，元寶楓蛋白的水解程度增大，多肽進一步酶解成小肽和氨基酸，所以使得最終的水解產(chǎn)物DPPH清除能力也逐漸減弱[14]。因此，酶解的較適合作用時間為6 h。

圖3 酶解時間對水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on hydrolysis degree and DPPH radical scavenging rate

2.2.4 底物濃度對水解度和DPPH自由基清除率的影響

由圖4可知，隨著底物濃度的不斷加大，水解度的變化為先升高后逐漸降低，而DPPH自由基清除率的變化為先降低后趨于平緩。在底物濃度為4%時，DPPH自由基清除率達到最大值，而水解度與試驗中的最高水解度相比，下降了2.171%。由此現(xiàn)象分析可能為隨著溶液底物濃度的不斷增大，酶解液的溶液粘度也不斷增加，從而影響了蛋白酶擴散的同時水分活度也相應(yīng)降低，對水解反應(yīng)有一定的抑制作用。在蛋白水解過程的相關(guān)研究中，呂桂善等[15]發(fā)現(xiàn)蛋白酶的水解性與酶活性的抑制之間沒有相關(guān)性，因此也說明將水解度選取為檢測指標是不合適的，應(yīng)該將所得酶解物生物活性大小作為主要的抗氧化肽活性檢測指標。所以，在本次試驗中選取酶解物的DPPH自由基清除率作為主要的參考指標，綜合以上各因素考慮，選擇4%作為最佳底物濃度。

圖4 底物濃度對水解度和DPPH清除率的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on hydrolysis degree and DPPH radical scavenging rate

2.2.5 正交試驗結(jié)果

根據(jù)上一步的單因素試驗確定出各因素的最佳范圍，在此基礎(chǔ)上選擇4個因素對胰蛋白酶的酶解條件進行四因素三水平的正交試驗進一步優(yōu)化試驗方案[16]，正交試驗結(jié)果見表5。

表5 正交試驗結(jié)果Table 5 The orthogonal experiment results

由表5中極差R值可知，4個因素對酶解效果的影響程度順序為D pH>B 酶用量>A底物濃度>C酶解時間，酶解提取最佳組合條件為A1B1C1D1，即最佳酶解條件為：底物濃度2%、酶用量12000 U/g、酶解時間5 h、pH值7.5。根據(jù)此最佳工藝條件進行3次重復驗證試驗操作，實際測得的水解度平均值為46.2%，超過了此前理論最佳酶解條件下測得的DPPH清除率值 35.9%，因此下一步的酶解條件選取正交優(yōu)化后的。

2.3 超濾

2.3.1 各組分對DPPH自由基的清除率

采用超濾膜生物反應(yīng)器對水解產(chǎn)物在最佳條件下的上清液進行分離[17]。對微濾液進行超濾，分別用分子量為10，5，3 kDa的超濾膜進行分離，各組分對DPPH自由基的清除率見圖5。

圖5 超濾分級后各組分的DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH free radical scavenging rate of each component after ultrafiltration

由圖5可知，分子量<3 kDa的抗氧化活性最高，達到70.4%。純化前酶解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除活性為46.2%，明顯高于純化前酶解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除活性。組分1和組分3對DPPH自由基的清除活性相似，分別為62.7%和61.3%。組分2的DPPH自由基清除活性為55.4%，是超濾得到的組分中最低的，但仍比未純化前提高約9.2%，原因可能是超濾除去了大部分的纖維、礦物元素、鹽等，提高了多肽的純度。

2.3.2 抗氧化肽穩(wěn)定性的研究

2.3.2.1 溫度對DPPH自由基清除率的影響

由圖6可知，在20～60 ℃時DPPH自由基清除率變化不大；60～100 ℃時，DPPH自由基清除率下降，抗氧化活性與肽的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，這可能是由于加熱引起的多肽構(gòu)象變化。隨著溫度的逐漸升高，會破壞肽的二級結(jié)構(gòu)，導致抗氧化活性的喪失[18]。本試驗結(jié)果表明，在20～60 ℃之間，元寶楓籽抗氧化肽對DPPH自由基的清除活性保持穩(wěn)定。

圖6 不同溫度及時間下的DPPH清除率Fig.6 DPPH free radical scavenging rates at different temperatures and time

2.3.2.2 pH對DPPH自由基清除率的影響

由圖7可知，在pH為7條件下保存時，DPPH自由基清除率隨著時間的延長幾乎不變，無顯著差異；而在偏酸(pH 4)或者偏堿(pH 10)條件下，DPPH自由基清除率均呈現(xiàn)下降的趨勢，且在偏酸條件下，4 h時的DPPH自由基清除率降低幅度最大，而在偏堿條件下，5 h時的DPPH自由基清除率降低幅度最大。對于過酸(pH 1)或者過堿(pH 13)環(huán)境，元寶楓籽功能性肽的DPPH自由基清除率大幅度下降，但過堿條件下DPPH自由基清除率下降幅度更大。原因可能是元寶楓籽蛋白的酶解產(chǎn)物是應(yīng)用胰蛋白酶在pH為7.8的條件下制備的，酶解條件接近于中性pH偏高后，就會使得其抗氧化活性降低[19]。

圖7 不同pH及時間下的DPPH清除率Fig.7 DPPH free radical scavenging rates at different pH values and time

2.3.2.3 NaCl濃度對DPPH自由基清除率的影響

研究NaCl溶液濃度對抗氧化多肽穩(wěn)定性的影響是由于NaCl在食品加工生產(chǎn)過程中經(jīng)常被用到，因此將分子質(zhì)量小于3 kDa的元寶楓籽抗氧化肽溶于不同濃度的鹽溶液中，比較5 h內(nèi)DPPH自由基清除率的不同，試驗結(jié)果見圖8。

圖8 不同鹽濃度及時間下的DPPH清除率Fig.8 DPPH free radical scavenging rates at different salt content and time

由圖8可知，不同濃度NaCl溶液的加入對元寶楓籽抗氧化肽的DPPH自由基清除活性有較大影響。當NaCl濃度為0.2%和0.8%時，樣品溶液中DPPH自由基清除率較高。當NaCl濃度大于0.8%時，DPPH自由基清除率迅速下降。由此可見，元寶楓籽抗氧化肽對NaCl溶液具有不穩(wěn)定性，因此，在食品加工中進行脫鹽處理[20]。

2.3.2.4 葡萄糖濃度對DPPH自由基清除率的影響

由圖9可知，在元寶楓籽抗氧化肽中添加葡萄糖，隨著葡糖糖濃度的增加，其DPPH自由基清除率不斷下降，并且DPPH自由基清除率隨著時間的延長會產(chǎn)生波動，但幅度不明顯；當葡萄糖濃度升高到5%時，隨著時間的延長，元寶楓籽抗氧化肽的DPPH自由基清除率繼續(xù)降低。說明元寶楓籽抗氧化肽的抗氧化活性在葡萄糖濃度為1%～2%條件下保持穩(wěn)定，隨著葡萄糖濃度的升高會有不同程度的降低，當濃度達到5%時，DPPH自由基清除率降低更加明顯。本試驗測定的結(jié)果表明，1%～2%時，元寶楓籽抗氧化肽的DPPH自由基清除率無明顯變化，而隨著濃度的升高(>2%)，其抗氧化活性有所降低，而溫度繼續(xù)升高(>4%)，抗氧化活性明顯下降，且隨著時間的延長，其抗氧化活性降低更為迅速。

續(xù) 表

圖9 不同葡萄糖濃度及時間下的DPPH清除率Fig.9 DPPH free radical scavenging rates at different glucose content and time

3 結(jié)論

本文根據(jù)水解度和抗氧化值的條件，選用胰蛋白酶為水解酶，以元寶楓籽為原料，制備了元寶楓籽抗氧化肽。以正交試驗L9(34)為優(yōu)化工藝，以底物濃度2%、加酶量12000 U/g、酶解時間5 h、pH值7.5為優(yōu)化參數(shù)組合，DPPH自由基清除率為46.2%。對微濾后的溶液進行超濾，其分子量<3 kDa的抗氧化活性最高，達到70.4%?；钚宰罡?<3 kDa)的組分通過穩(wěn)定性試驗進一步分析。各參數(shù)的最佳組合為20～60 ℃，pH 7，鹽濃度0.2%或0.5%，葡萄糖濃度1%～2%。通過試驗證明，元寶楓籽具有天然的抗氧化能力，將其應(yīng)用在抗氧化食品領(lǐng)域中能夠開拓良好的食品市場。