程 景 張?jiān)獞c 王 曦 張丹丹 李 博 靳 光 王棟才 徐 芳 孫銳鋒 梁 圓 薛麗娜

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，太原 030032)

隨著人們生活質(zhì)量的提高，優(yōu)質(zhì)牛肉備受消費(fèi)者的青睞。晉南牛是我國古老而優(yōu)秀的黃牛品種，具有良好的肉用性能，是可向?qū)ｉT化肉牛品種方向選育的地方黃牛品種之一。肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat,IMF)是沉積在骨骼肌肌纖維和肌束間的脂肪組織，也稱為大理石花紋脂肪組織。IMF含量和分布決定了牛肉的大理石花紋的沉積[1]。作為衡量牛肉品質(zhì)的重要指標(biāo)，IMF含量和脂肪酸的組成是決定肉品質(zhì)的重要因素，IMF對(duì)肉的感官品質(zhì)和嫩度都有影響[2]，而不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA)和飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)的比例、UFA中脂肪酸的組成對(duì)改善肉的風(fēng)味、提高營養(yǎng)價(jià)值具有重要意義[3]。

固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding proteins,SREBPs)屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族，是膜結(jié)合蛋白，其主要通過促進(jìn)糖酵解和脂肪生成而在能量調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用[4]。哺乳動(dòng)物SREBPs基因包括SREBP1、SREBP2 2種。從NCBI上GenBank中的數(shù)據(jù)可知，在牛上，SREBP1基因定位于19號(hào)染色體，mRNA長度3 983，編碼1 146個(gè)氨基酸；SREBP2基因定位于5號(hào)染色體，mRNA長度5 194，編碼1 140個(gè)氨基酸。其中SREBP1基因主要激活脂肪酸合成，SREBP2基因則主要調(diào)控膽固醇代謝[5]。SREBP1基因的增加均可顯著促進(jìn)細(xì)胞中脂滴的形成[6]，且大量研究還表明，該基因與脂肪、膽固醇代謝紊亂等引起的諸多疾病和氧化應(yīng)激等密切相關(guān)[7-9]。研究SREBP1基因在脂肪代謝中的調(diào)控作用，對(duì)闡明肌內(nèi)脂肪形成、改善牛肉品質(zhì)具有重要意義。

SREBP1基因在脂肪形成中具有重要作用，且目前未見對(duì)晉南牛SREBP1基因表達(dá)規(guī)律的相關(guān)報(bào)道，因此，本研究以晉南牛為研究對(duì)象，分析檢測(cè)不同組織中SREBP1基因的表達(dá)規(guī)律并分析不同IMF含量個(gè)體SREBP1基因在背最長肌(longissimusdorsi,LP)、皮下脂肪(subcutaneous fat,SF)、腹腔脂肪(abdominal fat,AF)、胸腔脂肪(chest fat,CF)中的表達(dá)規(guī)律，為研究牛SREBP1基因在IMF沉積過程中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用12頭8月齡、體重為(264.00±30.49) kg的晉南牛，進(jìn)行分階段育肥。飼糧按《肉牛營養(yǎng)需要和飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》配制，飼養(yǎng)管理方式按照山西農(nóng)業(yè)大學(xué)(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)牛場(chǎng)日常飼養(yǎng)執(zhí)行，所有牛只飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致。試驗(yàn)牛散欄飼養(yǎng)，每日08：00和19：00各飼喂1次，自由采食，飲水充足。屠宰時(shí)體重為(615.17±43.40) kg，牛只采用上線屠宰，電擊后15 min內(nèi)進(jìn)行樣本采集。使用RNAnase清除劑(Solarbio,北京索萊寶科技有限公司)處理過的剪刀采集心臟、脾臟、腎臟、肝臟、LP、SF、AF、CF，每個(gè)部位3個(gè)重復(fù)，迅速投入凍存管并放入液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存，用于RNA提?。慌潘?4 h后，取第12～13肋間左側(cè)胴體LP，測(cè)定IMF含量后，選取IMF含量最高的3頭(IMF含量分別為11.50%、13.30%、12.10%)和最低的3頭(IMF含量分別為4.40%、4.50%、4.30%)，測(cè)定肉品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Total RNA的提取和cDNA的合成

采用百泰克(北京)試劑盒提取各組織中的Total RNA，經(jīng)NanoDrop-2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀(Thermo Fisher,德國)和電泳檢測(cè)純度和完整性后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)合成cDNA。

1.2.2SREBP1基因和內(nèi)參基因的設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank公布的牛SREBP1基因序列和β-微管蛋白(TUBB)基因序列，參照實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time-qPCR)引物設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用NCBI primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)設(shè)計(jì)引物。引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。引物信息見表1。

表1 引物信息

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以不同牛只、不同組織的cDNA為模板，以TUBB作為內(nèi)參基因開展實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)。反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 2 μL，F(xiàn)ormat Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，SYBR Premix PCR 10 μL，補(bǔ)充dd H2O至20 μL。使用Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Qiagen,德國)進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)條件：95 ℃變性1 min；60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；70～95 ℃熔解20 s，每0.5 ℃讀取1次熒光值，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)個(gè)體進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，陰性對(duì)照為無cDNA模板的樣品。

1.2.4 LP脂肪酸及氨基酸組成的測(cè)定

將采集的肌肉樣品密封-4 ℃保存，在24 h內(nèi)送至華測(cè)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司，測(cè)定脂肪酸37種、氨基酸16種。樣品經(jīng)研磨機(jī)低溫勻漿后備用，隨后對(duì)牛肉中的總脂肪酸和氨基酸組成進(jìn)行檢測(cè)分析。其中脂肪酸含量測(cè)定方法依照GB 5009.168《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測(cè)定》，使用GC-2010Plus氣相色譜儀(Shimadzu,日本)測(cè)定，測(cè)定方法為內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物為十一碳酸甘油三酯，色譜柱選用SP-2560氣相毛細(xì)管柱(Supelco,美國)，規(guī)格為100 m×0.25 mm×0.20 μm(長度×內(nèi)徑×膜厚)，固定相為聚二氰丙基硅氧烷；氨基酸含量測(cè)定方法依照GB 5009.124《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》，使用LA-8080全自動(dòng)氨基酸分析儀(Hitachi,日本)測(cè)定。為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)加送2個(gè)樣品的平行樣。

1.3 數(shù)據(jù)分析

目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法[10]計(jì)算，原始數(shù)據(jù)使用Excel 2019處理。使用SPSS 21.0的一般線性模型進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA,LSD)和Duncan氏多重比較，采用Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為差異顯著的判定標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01為差異極顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同IMF含量晉南牛生長性能、屠宰性能及肉品質(zhì)

由表2可知，HIF組平均日增重(0.76 kg)高于LIF組(0.73 kg)，但差異不顯著(P>0.05)；LIF組胴體重、屠宰率均顯著高于HIF組(P<0.05)。HIF組第12～13肋間LP的pH48 h、水分含量均小于LIF組(P>0.05)，滴水損失高于LIF組(P>0.05)；LIF組剪切力顯著高于HIF組(P<0.05)，LIF組IMF含量為4.40%，HIF組IMF含量為12.30%，兩者之間差異極顯著(P<0.01)。

表2 不同IMF含量晉南牛生長性能、屠宰性能和肉品質(zhì)

2.2 不同IMF含量晉南牛LP中脂肪酸組成

由表3可知，2組均未檢出C14∶0以下的脂肪酸。其中，HIF組中LP的總脂肪酸(TFA)含量為9.698%，LIF組的TFA含量為4.064%，兩者之間差異顯著(P<0.05)。HIF組中豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸含量均顯著或極顯著高于LIF組(P<0.05或P<0.01)；HIF組中芥酸含量也高于LIF組，但差異不顯著(P>0.05)；亞麻酸含量在2組基本相同，均為0.018%。

表3 不同IMF含量晉南牛背最長肌中脂肪酸組成

2.3 不同IMF含量晉南牛LP中氨基酸組成

由表4可知，苯丙氨酸含量在2組中基本相同，均為0.84%，除苯丙氨酸外，HIF組LP中其余所測(cè)氨基酸含量均低于LIF組中對(duì)應(yīng)氨基酸，差異均不顯著(P>0.05)；LIF組氨基酸總量高于HIF組，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 不同IMF含量晉南牛背最長肌中氨基酸組成

2.4 晉南牛SREBP1基因的組織表達(dá)譜分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SREBP1基因在晉南牛個(gè)體組織中的表達(dá)差異，SREBP1基因在所測(cè)組織中均有表達(dá)(圖1)，其中在LP中的相對(duì)表達(dá)量較高，且顯著高于其他組織(P<0.05)；在腎臟、肝臟和脂肪組織中次之；在心臟、脾臟中相對(duì)表達(dá)量均顯著低于其他組織(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 不同IMF含量晉南牛不同組織中SREBP1基因的表達(dá)水平

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)SREBP1基因在HIF組和LIF組中的表達(dá)水平(圖2)，結(jié)果顯示，在LP中，HIF組SREBP1基因相對(duì)表達(dá)量極顯著高于LIF組(P<0.01)；在SF中，HIF組SREBP1基因相對(duì)表達(dá)量略高于LIF組(P=0.052)；在SF和CF中，HIF組SREBP1基因相對(duì)表達(dá)量極顯著低于LIF組(P<0.01)。

2.6 不同組織中SREBP1基因表達(dá)水平與IMF含量的相關(guān)性

由表7可知，LP、SF中SREBP1基因相對(duì)表達(dá)量與IMF含量均呈正相關(guān)，其中LP中SREBP1基因相對(duì)表達(dá)量與IMF含量相關(guān)系數(shù)為0.987，呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；AF、CF中SREBP1基因相對(duì)表達(dá)量與IMF含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注**表示差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

3.1 不同IMF含量晉南牛屠宰性能及肉品質(zhì)

本研究中，LIF組IMF含量為4.40%，HIF組IMF含量為12.30%，王小梅等[11]測(cè)定紅安格斯牛、中國西門塔爾牛、草原紅牛、夏洛萊牛的LP IMF含量在5.01%～5.34%，張海波[12]測(cè)定20月齡西雜閹公牛的IMF含量為4.08%和4.54%，Ueda等[13]測(cè)定和牛脂肪含量從4.8%到39.0%不等，說明不同品種肉牛IMF含量相差較大，這與試驗(yàn)用牛年齡、品種等因素相關(guān)，且本試驗(yàn)結(jié)果顯示，相同飼養(yǎng)條件下晉南牛LP IMF含量差異也較大，說明同一品種不同個(gè)體之間脂肪的合成、分解代謝也可能大不相同[14-15]。HIF組屠宰率、水分含量、剪切力均低于LIF組，這和毛衍偉等[16]的研究一致。Ueda等[13]認(rèn)為牛肉水分含量與IMF含量呈負(fù)相關(guān)是因?yàn)橹咎娲怂?。多?shù)研究認(rèn)為，IMF含量提高，牛肉的剪切力降低[17-18]。本試驗(yàn)條件下，LIF組的IMF含量為4.45%，剪切力為63.40 N，HIF組的IMF含量為12.40%，剪切力為57.45 N。而Liang等[19]數(shù)據(jù)中，IMF含量為4.26%時(shí)，剪切力為50.62 N，IMF含量為11.52%時(shí)，剪切力為40.08 N，雖然剪切力在數(shù)據(jù)上差異較大，這可能與樣品前處理有關(guān)，但其趨勢(shì)相同，均隨著IMF含量的增加，剪切力降低。本試驗(yàn)委托當(dāng)?shù)嘏Ｈ饧庸て髽I(yè)屠宰，因企業(yè)對(duì)肉品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益等需求，工人在胴體處理時(shí)過度修剪脂肪，是導(dǎo)致HIF組的肉牛的屠宰率和胴體重低于LIF組的肉牛最可能的原因。

表7 晉南牛不同組織部位SREBP1基因相對(duì)

3.2 不同IMF含量晉南牛LP中脂肪酸、氨基酸組成

脂肪酸沉積過程實(shí)質(zhì)上是脂肪酸酯化為甘油三酯(TG)并沉積為體脂的過程。肉牛可從飼糧中攝取脂肪酸，通過小腸分解為游離脂肪酸，進(jìn)一步氧化或者形成TG并逐漸沉積到體內(nèi)[20-21]。也就是說如果機(jī)體內(nèi)脂肪沉積較多，則相應(yīng)的脂肪酸含量也高。本試驗(yàn)條件下，HIF組的TFA含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于LIF組，這與HIF組IMF含量高于LIF組有關(guān)。肌肉中氨基酸受動(dòng)物品種、年齡等因素的影響[22]，多數(shù)人認(rèn)為氨基酸和肉風(fēng)味相關(guān)，很少有氨基酸和IMF含量之間關(guān)系的研究。Ueda等[13]發(fā)現(xiàn)，幾乎所有氨基酸和IMF含量均呈顯著負(fù)相關(guān)，肌肉中脂肪沉積可能降低氨基酸含量，其原因是育肥后期肉牛大量積累脂肪，肌肉生長速度慢，蛋白質(zhì)合成和降解的速率降低。本研究中無論是所測(cè)氨基酸總量，還是各氨基酸含量(除苯丙氨酸含量基本相同外)，HIF組均低于LIF組，與上述結(jié)果一致。

3.3 晉南牛SREBP1基因的組織表達(dá)特性分析

本研究表明，SREBP1基因在晉南牛不同組織中廣泛表達(dá)，且有明顯的組織差異性。人類的研究上發(fā)現(xiàn)，SREBP1基因在脂肪組織和肌肉組織中表達(dá)量較為豐富，首先在棕色脂肪組織中表達(dá)，其次是肝臟、白色脂肪組織和腎臟[23]。本試驗(yàn)條件下，晉南牛SREBP1基因的組織表達(dá)譜與人類基本一致，在LP和脂肪組織、肝臟相對(duì)表達(dá)量較高，隨之是腎臟，而在心肌和脾臟中相對(duì)表達(dá)量低。但本研究中SREBP1基因在晉南牛背最長肌中的相對(duì)表達(dá)量最高，與黃胥萊等[24]的研究不一致，這可能是因?yàn)長P中脂肪沉積明顯，而取樣方法與部位的不同導(dǎo)致樣品中脂肪組織含量的不同而影響測(cè)定結(jié)果。

3.4 不同IMF含量晉南牛LP、脂肪組織中SREBP1基因相對(duì)表達(dá)量及其與IMF含量的相關(guān)性

IMF沉積是脂肪酸合成與分解的綜合反映，受到脂肪酸合成關(guān)鍵基因和脂肪酸分解關(guān)鍵基因的調(diào)控。多項(xiàng)研究表明，SREBP1基因與機(jī)體脂肪生成基因的調(diào)節(jié)有很重要的相關(guān)性，SREBP1可以直接激活脂肪酸、膽固醇、TG以及磷脂的生物合成，脂肪代謝過程中的多個(gè)基因的表達(dá)[25-26]。官久強(qiáng)等[27]經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)犏牛組IMF含量高于牦牛組，而LP中SREBP1基因的相對(duì)表達(dá)量犏牛組也高于牦牛組。這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。不同水平IMF含量晉南牛牛群，SF中SREBP1基因相對(duì)表達(dá)量HIF組略高于LIF組，AF、CF中SREBP1基因相對(duì)表達(dá)量均為LIF組高于HIF組，這可能是因?yàn)椴煌课坏闹窘M織具有特異性的基因表達(dá)模式[28]，也可能是因?yàn)镮MF含量高的個(gè)體，脂肪在內(nèi)臟生成已經(jīng)很少，主要在肌肉和皮下，其他原因還有待繼續(xù)深入研究與探討。

金世杰等[29]證明肌肉組織中SREBP1基因表達(dá)在12～20月齡期間與IMF含量具有正相關(guān)性。徐麗[30]對(duì)SREBP1基因過表達(dá)可增加牛胎兒骨骼肌成纖維細(xì)胞內(nèi)脂肪的合成，本研究中SREBP1基因在LP中的相對(duì)表達(dá)量與IMF含量呈極顯著正相關(guān)，與上述報(bào)道一致。這說明通過SREBP1基因表達(dá)對(duì)脂肪沉積有正向調(diào)控作用，對(duì)IMF的沉積有一定的積極作用，與SREBP1基因的生理作用一致。

4 結(jié) 論

晉南牛SREBP1基因在所測(cè)組織中均有表達(dá)，且不同個(gè)體所測(cè)組織中的表達(dá)規(guī)律基本相同，均以LP中相對(duì)表達(dá)量最高，脂肪組織中也相對(duì)豐富；不同IMF含量晉南牛SREBP1基因表達(dá)模式不同，LP中HIF組較高，而AF、CF中LIF組高；SREBP1基因正向調(diào)控LP中IMF沉積，可作為影響晉南牛IMF含量的候選基因。