喬新月 高炳南 任雨龍 李金庫 陳 妍 崔一喆 王秋菊

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319)

冷應(yīng)激給北方或寒區(qū)的畜牧業(yè)帶來了巨大損失，常導(dǎo)致畜禽幼仔免疫力及抗病能力下降，甚至死亡[1]。腸道是維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的先天性屏障。許多環(huán)境和生物應(yīng)激源，包括輻射、熱應(yīng)激、脂多糖、各種藥物和活性氧均可對腸上皮造成損害[2]。王雪潔等[3]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激可影響家禽的腸道結(jié)構(gòu)，干擾腸道微微生態(tài)的平衡，抑制腸道免疫功能，破壞腸黏膜完整性，從而使家禽的生長和健康受到影響。研究表明，冷應(yīng)激可引起雞腸道免疫功能的改變，急性和慢性冷應(yīng)激可導(dǎo)致肉雞小腸中白細胞介素(IL)-2、γ-干擾素(IFN-γ)、IL-4、IL-17和轉(zhuǎn)化生長因子-β4(TGF-β4)mRNA表達量隨冷刺激時間的延長呈先升高后降低的趨勢[4]。冷應(yīng)激會促使體內(nèi)許多生物活性分子參與到機體的調(diào)節(jié)中。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)是一種快速誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥、細胞增殖和分化、免疫反應(yīng)和基因誘導(dǎo)中有廣泛的作用[5]。NF-κB家族中的轉(zhuǎn)錄因子在細胞的激活、生存和增殖中扮演著關(guān)鍵角色。它的異?；顒涌赡軐?dǎo)致癌癥、免疫缺陷或自身免疫性疾病[6]。Ye等[7]研究表明小鼠NF-κB亞基p50缺失可改善冷應(yīng)激誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、巨噬細胞炎性蛋白-2(MIP-2)和細胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達，從而減少中性粒細胞的積聚和對胃黏膜的損傷。p65通過磷酸化、泛素化等作用對NF-κB進行轉(zhuǎn)錄激活，在炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[8]。研究表明，TNF-α、p65表達量升高可導(dǎo)致結(jié)腸通透性增加，進而導(dǎo)致過度炎癥免疫反應(yīng)的發(fā)生[9]。腸道堿性磷酸酶(IAP)是一種經(jīng)糖基磷脂酰肌醇鍵錨定于腸上皮細胞頂膜上的糖蛋白，在腸黏膜屏障的維護中發(fā)揮著重要作用，包括調(diào)節(jié)十二指腸表面pH、解除脂多糖和游離核苷酸的毒性、抑制腸道炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)腸道菌群等[10]。Ferencz等[11]研究發(fā)現(xiàn)小腸組織中存在的垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽-38(PACAP-38)在預(yù)防腸冷保存損傷中具有關(guān)鍵作用，冷應(yīng)激會破壞PACAP-38缺陷小鼠的黏膜、黏膜下層和隱窩。近年來，冷刺激對腸道影響的研究較多，但急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸NF-κB/IAP信號通路的研究鮮有報道。為了進一步探究冷刺激對斷奶仔豬腸道的影響機制，本研究采用人工氣候室，從腸道形態(tài)觀察入手，研究不同冷刺激時間對斷奶仔豬十二指腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，并檢測十二指腸NF-κB/IAP信號通路關(guān)鍵蛋白p65、核轉(zhuǎn)錄因子抑制蛋白(IκB)、磷酸化IκB(p-IκB)及IAP的表達情況，旨在從分子層面探討急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸損傷的機制，并探究急性冷刺激下NF-κB/IAP信號通路對十二指腸的保護作用，為早期檢測和防治北方寒冷地區(qū)仔豬冷刺激腸道疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

選取16頭體況相近、健康的30日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬，隨機分成4組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。按照《國家實驗動物飼養(yǎng)管理條例》，在人工智能氣候室內(nèi)預(yù)飼7 d，常規(guī)飼養(yǎng)管理，正常飼喂，正常飲水。

1.1.2 主要試劑

RIPA裂解液(強，P0013B)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010S)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒(P0012A)、SDS-PAGE 5X蛋白上樣緩沖液(P0015)均購自碧云天公司。β-肌動蛋白(β-actin)免疫印跡所用的一抗鼠抗單克隆抗體(1∶15 000，60008-1-Ig)、NF-κB p65免疫印跡所用的一抗兔抗單克隆抗體(1∶2 000，10745-1-AP)以及IκB-α(1∶2 000，51066-1-AP)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(1∶10 000，SA00001-1)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶10 000，SA00001-2)均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。p-IκBα(1∶1 000，#2859)購自CST(Cell Signaling Technology)公司。IAP(1∶3 000，ab97532)購自Abcam公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 冷刺激試驗

4組分別為對照組、急性冷刺激2 h組、急性冷刺激6 h組和急性冷刺激12 h組。采用人工氣候室內(nèi)模擬冬季寒冷氣候，3個急性冷刺激組斷奶仔豬在溫度為(4±2) ℃的人工氣候室中分別飼養(yǎng)2、6、12 h，而對照組斷奶仔豬飼養(yǎng)于溫度為(24±2) ℃的環(huán)境中，相對濕度維持在40%～50%。

1.2.2 切片制作及測定

分別在冷刺激0(對照組)、2、6、12 h后將斷奶仔豬在室溫中屠宰，取十二指腸中段，生理鹽水沖洗后，固定于4%甲醛固定液中，制作石蠟切片并進行蘇木精-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察腸組織病理變化，采用圖像分析系統(tǒng)觀測腸道絨毛高度和隱窩深度。

1.2.3 Western-blot法檢測十二指腸NF-κB/IAP信號通路關(guān)鍵蛋白表達情況

屠宰后取十二指腸，用冰生理鹽水沖洗干凈，并在十二指腸中段取5 cm樣品裝于1.5 mL離心管中，液氮凍存。液氮速凍后-80 ℃低溫冰箱保存。將十二指腸組織解凍后，用裂解液提取總蛋白，用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，100 ℃煮10 min。SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃一抗過夜，次日TBST沖洗膜3次，每次10 min，二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，l×TBST沖洗膜3次，顯色液顯色。用ChemiDoc XRS(伯樂)成像系統(tǒng)成像，測定樣品灰度值，Image Lab分析目標條帶的灰度值，并計算目的蛋白的相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，結(jié)果用平均值±標準差表示，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸組織結(jié)構(gòu)的影響

從圖1可見，對照組仔豬十二指腸組織結(jié)構(gòu)完整，絨毛排列緊密，急性冷刺激組腸絨毛出現(xiàn)斷裂和少數(shù)上皮細胞變性脫落現(xiàn)象，腸絨毛排列稀疏。表1顯示，3個急性冷刺激組十二指腸絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度均發(fā)生了變化。與對照組相比，急性冷刺激2和6 h后，斷奶仔豬十二指腸絨毛高度降低，差異不顯著(P>0.05)；急性冷刺激12 h后，斷奶仔豬十二指腸絨毛高度顯著降低(P<0.05)。與對照組相比，急性冷刺激2、6和12 h后十二指腸隱窩深度及絨毛高度/隱窩深度均下降，但差異不顯著(P>0.05)。

圖1 各組十二指腸組織結(jié)構(gòu)

表1 急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸黏膜形態(tài)的影響

2.2 急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸中NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白表達的影響

如圖2所示，與對照組相比，急性冷刺激2 h時十二指腸中p65相對表達量升高，但差異不顯著(P>0.05)；急性冷刺激6 h時十二指腸中p65相對表達量基本恢復(fù)到冷刺激前(對照組)水平。急性冷刺激12 h時，十二指腸中p65相對表達量與對照組和急性冷刺激6 h時相比顯著升高(P<0.05)。與對照組相比，急性冷刺激2和6 h時十二指腸中IκB相對表達量有增加的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)；急性冷刺激12 h時十二指腸中IκB相對表達量與對照組和急性冷刺激2和6 h時相比極顯著增加(P<0.01)。急性冷刺激2和6 h時十二指腸中p-IκB相對表達量與對照組相比略有增加，差異不顯著(P>0.05)；急性冷刺激12 h時十二指腸中p-IκB相對表達量與對照組相比極顯著增加(P<0.01)。上述結(jié)果表明急性冷刺激能夠影響斷奶仔豬十二指腸NF-κB信號通路的活化，促進通路蛋白的表達。

數(shù)據(jù)標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。

2.3 急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸中IAP表達的影響

如圖3所示，與對照組相比，急性冷刺激2、6和12 h時，十二指腸中IAP相對表達量極顯著升高(P<0.01)。與急性冷刺激2 h時相比，急性冷刺激6和12 h時十二指腸中IAP相對表達量極顯著降低(P<0.01)。與急性冷刺激6 h時相比，急性冷刺激12 h時十二指腸中IAP相對表達量略有升高，差異不顯著(P>0.05)。

圖3 急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸IAP表達的影響

3 討 論

3.1 急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸組織結(jié)構(gòu)的影響

越來越多的流行病學(xué)證據(jù)表明，異常的環(huán)境溫度可增加動物的死亡風(fēng)險[12]。過強刺激會使機體產(chǎn)生免疫功能改變、胃腸潰瘍等病理現(xiàn)象[13]。有研究表明，長期冷刺激會促使雛雞的十二指腸和腺胃充血，同時經(jīng)常遭受冷刺激也會導(dǎo)致胃腸道潰瘍等病癥[14]。在急性冷刺激對腸道組織結(jié)構(gòu)影響的研究中，高靜雯等[15]研究表明，冷應(yīng)激可導(dǎo)致綿羊空腸、回腸和十二指腸的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)的變化，主要表現(xiàn)為回腸絨毛變短變粗。強冷應(yīng)激會抑制綿羊機體抗炎癥反應(yīng)及免疫機能的調(diào)節(jié)。在本研究中發(fā)現(xiàn)斷奶仔豬十二指腸絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度均受到了急性冷刺激不同程度的影響。與對照組相比，急性冷刺激6和12 h時，斷奶仔豬十二指腸絨毛高度變短，隱窩深度變淺，且急性冷刺激12 h時斷奶仔豬十二指腸絨毛高度顯著降低，說明急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的損傷。呂建偉等[16]將小鼠長期置于低溫條件下，結(jié)果表明冷刺激會降低其十二指腸腸壁和腸道組織截面積，但顯著增加了絨毛高度。計紅等[17]研究表明，急性冷刺激12 h對大鼠腎臟、胃壁黏膜均有損傷，但十二指腸組織結(jié)構(gòu)沒有明顯變化。上述研究與本試驗研究結(jié)果不完全一致，可能是由于動物種屬不同所致。

3.2 急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸NF-κB信號通路的影響

家畜應(yīng)激與免疫調(diào)節(jié)之間的平衡對家畜健康和生產(chǎn)力具有重要影響[18]。NF-κB是細胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是細胞應(yīng)激應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)者。NF-κB被激活后與IκB解離并易位入核，結(jié)合靶基因增強子/啟動子上的κB位點，從而調(diào)控靶基因的表達[19]。Shi等[20]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠冷暴露2 h后，NF-κB被激活，p65的磷酸化也被激活。Lian等[21]研究表明，妊娠期冷應(yīng)激可誘發(fā)胎盤細胞凋亡，并激活胎盤熱休克蛋白70(HSP70)/Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB信號通路，進而影響胎兒胎盤的功能和發(fā)育。產(chǎn)前冷應(yīng)激可促進妊娠母鼠肝臟中p65、HSP70的表達，進而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[22]。Fu等[23]研究表明，急性和慢性冷應(yīng)激均可引起鵪鶉十二指腸、空腸和回腸的炎癥反應(yīng)，在急性和慢性冷應(yīng)激下空腸、回腸和十二指腸的NF-κBmRNA表達量升高，TNF-α mRNA表達量降低。本試驗結(jié)果顯示，在斷奶仔豬十二指腸中，急性冷刺激2 h時，p65、IκB及p-IκB相對表達量與對照組相比略有升高，說明急性冷刺激2 h對斷奶仔豬十二指腸造成了一定損傷，十二指腸產(chǎn)生了炎癥；急性冷刺激6 h時，p65相對表達量基本恢復(fù)到冷刺激前水平，說明急性冷刺激使仔豬腸道產(chǎn)生炎癥反應(yīng)后，機體通過激活全身炎癥反應(yīng)和內(nèi)部的抗炎效應(yīng)來防止過度的炎癥反應(yīng)，機體通過自身免疫調(diào)節(jié)使炎癥反應(yīng)有所恢復(fù)；與對照組和急性冷刺激6 h時相比，急性冷刺激12 h時p65、IκB及p-IκB相對表達量均顯著升高。由此可以推斷，急性冷刺激激活NF-κB信號通路，并通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路對腸道造成一定損傷，之后機體通過自身免疫調(diào)節(jié)使炎癥反應(yīng)有所恢復(fù)，繼續(xù)延長冷刺激時間，則急性冷刺激又重新對十二指腸產(chǎn)生損傷，表明在急性冷刺激時，斷奶仔豬的免疫機能調(diào)節(jié)及抗炎癥反應(yīng)等功能均受到抑制。據(jù)報道，冷應(yīng)激與免疫系統(tǒng)及補體系統(tǒng)有關(guān)，可導(dǎo)致局部和全身的損傷[24]。

3.3 急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸IAP信號通路的影響

IAP在調(diào)節(jié)十二指腸表面pH、腸道內(nèi)細菌脂多糖(LPS)解毒、減少體內(nèi)LPS毒性、控制腸道炎癥、防止體內(nèi)細菌跨黏膜通道等方面均具有關(guān)鍵作用[25]。研究表明壞死性小腸結(jié)腸炎與IAP的表達和活性降低有關(guān)。IAP是一種內(nèi)源性蛋白，已被證明能滅活LPS，最近已成功地作為一種輔助治療成人膿毒癥的藥物[26]。Rentea等[27]研究表明，早期腸內(nèi)補充IAP可減輕壞死性小腸結(jié)腸炎相關(guān)性腸道損傷，有助于維持腸上皮屏障功能。早期斷奶仔豬腸道容易受到感染，發(fā)生腹瀉，造成生長遲緩，部分原因可能是空腸黏膜IAP的保護作用和功能減弱所致[28]。本試驗結(jié)果顯示，急性冷刺激能夠極顯著提高十二指腸中IAP的表達，并且，與急性冷刺激2 h時相比，急性冷刺激6和12 h時十二指腸中IAP相對表達量極顯著降低。IAP是斷奶仔豬腸道健康的促進因子，機體會通過提高IAP的表達進行自身的炎癥調(diào)節(jié)。與急性冷刺激6 h時相比，急性冷刺激12 h時十二指腸中IAP相對表達量略有升高。由此可以推斷急性冷刺激6 h時機體自身對損傷進行了一定的調(diào)節(jié)，急性冷刺激12 h時又重新對十二指腸產(chǎn)生了損傷。

4 結(jié) 論

急性冷刺激造成了斷奶仔豬十二指腸黏膜結(jié)構(gòu)的損傷，使絨毛高度變短，隱窩深度變淺，這是引起斷奶仔豬消化吸收功能障礙的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)；急性冷刺激使斷奶仔豬十二指腸中NF-κB/IAP信號通路被激活，上調(diào)了p65、IκB、p-IκB和IAP的表達，進而導(dǎo)致斷奶仔豬十二指腸產(chǎn)生一定的炎癥反應(yīng)。