魯慧杰 張 瑩 田志梅 容 庭 劉志昌 鄧 盾 馬現(xiàn)永，2*

(1.廣東省農業(yè)科學院動物科學研究所，畜禽育種國家重點實驗室，農業(yè)農村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣東畜禽肉品質量安全控制與評定工程技術研究中心，廣州 510640；2.嶺南現(xiàn)代農業(yè)科學與技術廣東省實驗室茂名分中心，茂名 525000)

腸道系統(tǒng)具有機體最大的黏膜表面，由能夠持續(xù)自我更新的單層腸上皮細胞構成，是腸道微環(huán)境和黏膜免疫系統(tǒng)之間的屏障，一定程度上保護機體免受腸道內有毒物質和外界環(huán)境的傷害[1]。腸黏膜屏障通過腸上皮細胞感受和響應外界刺激，是機體抵御潛在有害微生物和抗原的第一道防線，也是機體應激狀態(tài)下最早和最易受到氧化損傷的位點[1-3]。動物生長中面臨的飲食、藥物、病原體、環(huán)境變化等應激因素會引起腸道氧化應激，刺激腸上皮細胞和免疫細胞產生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)和促炎癥介質，破壞腸上皮穩(wěn)定，導致腸黏膜屏障受損，引發(fā)吸收障礙、炎癥性腸病、消化系統(tǒng)退行性疾病甚至是癌癥[4-5]。

研究表明，斷奶、高溫、運輸、病原菌、營養(yǎng)缺乏、飼料污染等諸多應激因素導致動物腸道ROS過度積累，引起腸上皮細胞損傷，腸道通透性增加，破壞腸上皮屏障功能，引發(fā)吸收障礙、腹瀉等炎癥性腸病和腸道應激綜合征[6-8]。由斷奶引起的氧化應激反應會延緩仔豬生長，增加胃腸道系統(tǒng)對疾病的易感性，降低仔豬腸道消化酶活性，破壞緊密連接蛋白，損害腸道免疫系統(tǒng)和黏膜屏障功能，導致“斷奶后應激綜合征”[9-10]。Smith等[11]認為仔豬早期斷奶可能會對胃腸道系統(tǒng)產生長期影響，造成腸道黏膜屏障持續(xù)性損傷和永久性缺陷。Yu等[12]研究表明，高溫應激導致豬小腸上皮細胞脫落，暴露腸黏膜固有層，改變空腸基因表達模式；超微結構顯示空腸微絨毛變短、細胞線粒體腫脹、腸上皮細胞緊密連接破壞等。在這些生理過程中，腸上皮細胞具有獨特的代謝特性，這些特性由線粒體活性的變化反映出來。線粒體功能是決定細胞命運以及協(xié)調細胞代謝、免疫力、應激反應和細胞凋亡的關鍵因素，許多細胞特異性應激反應是響應線粒體功能障礙而引起的[13]。因此，建立穩(wěn)定的腸上皮細胞氧化損傷模型，闡明氧化損傷對線粒體功能的影響，對于研究動物腸上皮細胞氧化損傷的響應機制、尋找調控氧化損傷的關鍵靶點、測試具有抗氧化活性的藥物具有十分重要的意義。

本研究使用廣泛報道的自由基引發(fā)劑2，2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH)作為氧化應激模型的自由基來源。AAPH是一種水溶性偶氮小分子化合物，可以通過誘導細胞氧化損傷引起各種類型的病理變化[14]。AAPH在37 ℃下以已知且恒定的速率持續(xù)分解生成1摩爾氮自由基和2摩爾碳自由基，其中碳自由基可以結合生成穩(wěn)定的產物，也可以與分子氧反應生成過氧自由基(ROO·)[14-15]。其他常用的自由引發(fā)劑如過氧化氫(H2O2)的濃度和穩(wěn)定性具有不可預測性，因其在過渡金屬存在的條件下能夠自發(fā)的或者由超氧化物歧化酶(SOD)介導的歧化作用轉化為極端活躍的羥基自由基(HO·)，極易被細胞培養(yǎng)液中存在的抗氧化劑淬滅[15]。因此，這些特性使AAPH相比H2O2而言是更為穩(wěn)定可靠的自由基來源，更適用于抗氧化作用相關的研究[15-16]。目前，AAPH已被廣泛用作自由基引發(fā)劑，用于研究紅細胞、血漿、全血、Hela細胞、各種組織、胚胎甚至動物個體的氧化應激[17]。豬腸上皮細胞(IPEC-J2細胞)來源于初生仔豬空腸的未轉化的豬腸上皮細胞系，保留了豬腸上皮的特性，是研究豬腸道宿主與外界因子相互作用的良好模型[18-20]。本試驗以IPEC-J2細胞為對象，研究AAPH誘導的氧化應激對IPEC-J2細胞活力及線粒體相關功能的影響，旨在建立一種穩(wěn)定的IPEC-J2細胞氧化損傷模型，有助于研究腸上皮細胞氧化損傷的響應機制和關鍵作用靶點，為生產應用中開發(fā)安全、高效的飼用抗氧化劑提供可靠的模型和潛在作用靶點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

AAPH購于美國Sigma-Aldrich公司；DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH=7.2)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(0.25%)和雙抗(青霉素-鏈霉素)購于美國Thermo Fisher公司；動物基因組DNA快速抽提試劑盒、ROS檢測試劑盒、BeyoClickTMEdU-488細胞增殖檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；iTap Universal SYBR Green Supermix定量預混液購于美國Bio-Rad公司；細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)、細胞增殖-毒性檢測測試劑盒購自上海東仁化學科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

IPEC-J2細胞在含有10% FBS和1%雙抗(青霉素-鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至85%～90%時進行細胞鋪板或傳代，鋪板前吸取10 μL細胞懸液于細胞計數(shù)板中計數(shù)。

1.3 指標檢測

1.3.1 細胞活力

將細胞懸液接種在96孔板中，密度為2×104個/孔，邊緣孔加入等體積的PBS，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察細胞生長狀態(tài)，用含有不同濃度AAPH的培養(yǎng)基處理細胞，每個處理8個重復。前期預試驗處理時間為0、4、8和24 h，后續(xù)正式試驗處理時間為24 h。

處理結束后，更換含有CCK-8溶液的DMEM完全培養(yǎng)基(DMEM∶CCK-8溶液=9∶1)，CO2恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育1 h，酶標儀450 nm吸光度(OD)讀數(shù)。

1.3.2 細胞增殖

細胞計數(shù)后，將細胞懸液接種在24孔板中，密度為2.5×105個/孔，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。更換新鮮的用含有不同濃度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的細胞培養(yǎng)基處理細胞24 h，每個處理6個重復。處理結束后，采用BeyoClickTMEdU-488細胞增殖檢測試劑盒檢測IPEC-J2細胞增殖情況，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3 總ROS含量

采用ROS檢測試劑盒測定總ROS含量。細胞計數(shù)后，將細胞懸液接種在96孔板(黑色透明底)中，密度為2×104個/孔，邊緣孔加入等體積的PBS，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。更換新鮮的用含有不同濃度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的細胞培養(yǎng)基處理細胞24 h，每個處理10個重復。處理結束后加入無血清DMEM稀釋2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)(終濃度為10 μmol/L)，37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。用無血清細胞培養(yǎng)基洗滌細胞3次，充分去除游離的DCFH-DA，多功能酶標儀測定熒光強度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。

1.3.4 線粒體膜電位

利用熒光探針JC-1檢測AAPH對線粒體膜電位的影響。用含有不同濃度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的細胞培養(yǎng)基處理細胞24 h后，DMEM洗滌細胞1次，加入JC-1探針(終濃度為5 μmol/L)，細胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20～30 min。孵育結束后用DMEM洗滌細胞2次，加入新鮮的細胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.5 線粒體DNA(mtDNA)拷貝數(shù)

細胞計數(shù)后，將細胞懸液接種在48孔板中，密度為5×104個/孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。更換新鮮的用含有不同濃度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的細胞培養(yǎng)基處理細胞24 h，每個處理8個重復。利用基因組DNA提取試劑盒提取細胞總DNA，熒光定量PCR檢測細胞mtDNA拷貝數(shù)。本試驗分別選取mtDNA編碼的基因細胞色素C氧化酶亞基1(COX1)、ATP合酶亞基6(ATPase6)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞基2(ND2)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞基3(ND3)用于定量分析，以保守的單拷貝核基因胰高血糖素(GCG)作為內參基因，定量細胞中mtDNA拷貝數(shù)。相關基因引物序列見表1。

表1 相關基因的引物序列

1.3.6 線粒體功能相關基因mRNA表達水平

細胞計數(shù)后，將細胞懸液接種在12孔板中，密度為5×105個/孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。更換新鮮的用含有不同濃度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的細胞培養(yǎng)基處理細胞24 h后收集細胞提取RNA，每個處理6個重復。

根據(jù)Trizol試劑(美國Invitrogen公司)說明書抽提細胞總RNA，NanoDrop測定RNA濃度。根據(jù)反轉錄試劑盒M-MLV Reverse Transcriptase Kit(美國Invitrogen公司)說明書合成cDNA模板。利用熒光定量PCR檢測相關基因[線粒體轉錄因子A(TFAM)、線粒體轉錄因子B1(TFB1M)、線粒體轉錄因子B2(TFB2M)、解耦連蛋白1(UCP1)、解耦連蛋白2(UCP2)、解耦連蛋白3(UCP3)]mRNA的表達情況，根據(jù)geNorm分析方法從β-肌動蛋白(β-actin)、18S rRNA、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、β2微球蛋白(B2M)、次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶1(HPRT1)、核糖體蛋白L4(RPL4)和TATA結合蛋白(TBP)中選擇最為適當?shù)?個基因作為本項目中定量結果分析的內參基因。相關基因引物序列見表1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey多重比較，數(shù)據(jù)用平均值±標準誤(mean±SE)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同濃度AAPH對IPEC-J2細胞活力的影響

由圖1-A可以看出，與對照組(0 mmol/L AAPH處理)相比，當處理時間為4和8 h時，較低濃度(30、50、100 mmol/L)的AAPH處理對IPEC-J2細胞活力沒有顯著影響(P>0.05)；200 mmol/L AAPH處理8 h顯著降低IPEC-J2細胞活力(P<0.05)；400 mmol/L AAPH處理4和8 h均顯著降低IPEC-J2細胞活力(P<0.05)；當處理時間為24 h時，不同濃度(30、50、100、200、400 mmol/L)的AAPH處理均顯著降低IPEC-J2細胞活力(P<0.05)。

由圖1-B可以看出，與對照組相比，26 mmol/L AAPH處理24 h時，IPEC-J2細胞活力顯著升高(P<0.05)；28 mmol/L AAPH處理24 h時對IPEC-J2細胞活力沒有顯著影響(P>0.05；30 mmol/L AAPH處理24 h時，IPEC-J2細胞活力在40%～70%，顯著降低(P<0.05)；32、34、36和38 mmol/L AAPH處理24 h時，細胞活力均低于50%，顯著降低(P<0.05)。因此，后續(xù)研究中AAPH的處理時間為24 h，處理濃度為0、30、32和34 mmol/L。由以上結果可知，低濃度AAPH和(或)短時間處理，IPEC-J2細胞活力不受影響或一定程度上增加；而當AAPH濃度超過一定濃度閾值后，IPEC-J2細胞活力呈現(xiàn)劑量依賴性下降趨勢，且與對照組相比均顯著降低。

***表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。數(shù)據(jù)柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.2 不同濃度AAPH對IPEC-J2細胞增殖的影響

由圖2-A可以看出，與對照組相比，不同濃度AAPH處理IPEC-J2細胞后，視野內增殖細胞[5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷(EdU)染色]數(shù)量明顯減少。由圖2-B可以看出，在6個隨機選擇的區(qū)域中計算細胞增殖的數(shù)量，不同濃度的AAPH處理均顯著抑制IPEC-J2細胞增殖(P<0.05)。

圖2 不同濃度AAPH對IPEC-J2細胞增殖的影響

2.3 不同濃度AAPH對IPEC-J2細胞線粒體功能的影響

不同濃度AAPH處理IPEC-J2細胞后，JC-1染色檢測線粒體膜電位的變化，紅色熒光的喪失和胞質中綠色熒光的增加表示線粒體膜電位的破壞。由圖3-A可以看出，未經處理的IPEC-J2細胞顯示線粒體極化良好，顯示為紅色熒光點狀染色，而用不同濃度AAPH處理的IPEC-J2細胞染色逐漸被擴散綠色熒光取代，表明線粒體膜電位降低[21]。

A：線粒體膜電位；B：活性氧生成。

此外，由圖3-B可以看出，與對照組相比，不同濃度AAPH處理IPEC-J2細胞后，總ROS含量顯著增加(P<0.05)，且與AAPH濃度成正比。

2.4 不同濃度AAPH對IPEC-J2細胞mtDNA拷貝數(shù)的影響

試驗選取了4個線粒體基因(COX1、ATPase6、ND2和ND3)，檢測不同濃度AAPH處理對IPEC-J2細胞mtDNA拷貝數(shù)的影響。由圖4可以看出，與對照組相比，不同濃度AAPH處理后IPEC-J2細胞mtDNA拷貝數(shù)均顯著降低(P<0.05)，且呈現(xiàn)出劑量依賴效應。

圖4 不同濃度AAPH對IPEC-J2細胞mtDNA拷貝數(shù)的影響

2.5 不同濃度AAPH對IPEC-J2細胞線粒體生物合成相關基因mRNA表達的影響

由圖5可以看出，不同濃度AAPH處理IPEC-J2細胞后，顯著抑制了線粒體轉錄因子TFAM、TFB1M和TFB2M的mRNA表達水平(P<0.05)，其中TFB1M的mRNA表達水平下降趨勢較小。此外，不同濃度AAPH處理IPEC-J2細胞后，顯著抑制了UCP1和UCP3的mRNA表達水平(P<0.05)，而對UCP2的mRNA表達水平沒有顯著影響(P>0.05)。

圖5 不同濃度AAPH對IPEC-J2細胞線粒體生物合成相關基因mRNA表達的影響

3 討 論

腸上皮是一個多細胞界面，是腸道微環(huán)境和黏膜免疫系統(tǒng)之間的屏障，同時支持營養(yǎng)素、水和廢物的矢量運輸[22]。已有的研究表明，腸上皮功能受損與腸道和全身性許多疾病狀態(tài)相關，受損的上皮可能在特定的胃腸道疾病中具有致病作用[22]。在生理或病理過程中，腸上皮細胞最早感受和響應外界刺激，在應激狀態(tài)下最易受到氧化損傷[1-3]。腸上皮細胞具有獨特的代謝特性，這由線粒體活性的變化反映出來。線粒體功能已成為決定細胞命運以及協(xié)調細胞代謝、免疫力、應激反應和細胞凋亡的關鍵因素，線粒體功能的改變與炎性腸病、結直腸癌等疾病的生理和病理過程密切相關[23]。因此，本研究采用自由基引發(fā)劑AAPH刺激IPEC-J2細胞，檢測線粒體功能相關指標變化，建立腸上皮細胞氧化損傷模型。

本研究結果顯示，不同濃度(30、32、34 mmol/L)AAPH長時間刺激導致IPEC-J2細胞活力顯著下降。值得注意的是，低濃度AAPH和(或)短時間刺激在一定程度上提高了細胞活力，這一現(xiàn)象可能與ROS在細胞命運中的雙重作用有關。已有的證據(jù)表明，短暫、低濃度的ROS爆發(fā)在生理上是有益的，而持續(xù)的高ROS含量則與病理進程有關[24]。為了進一步驗證AAPH誘導的氧化應激對細胞增殖的影響，試驗通過熒光標記物EdU檢測了細胞增殖的情況，結果表明不同濃度AAPH處理均顯著抑制IPEC-J2細胞增殖。

線粒體作為ROS產生的主要場所，極易受到壓力和應激引起的氧化損傷，線粒體應激導致線粒體ROS(mROS)產生改變或線粒體膜電位喪失，從而引起不同的應激信號[24]。研究表明，細胞暴露在應激或風險因子(低氧、高糖、高膽固醇、感染、化學致癌物、電離輻射等)中會引起線粒體膜電位崩潰，導致線粒體產生過量的ROS[25-26]。本試驗結果顯示，不同濃度AAPH處理的IPEC-J2細胞線粒體膜電位降低，細胞中總ROS含量顯著增加。類似的，在人角質形成細胞(HaCaT)中，AAPH處理顯著增加細胞內ROS含量，降低線粒體膜電位[15,27]。

在許多損害呼吸鏈的病理條件下，mROS的產生顯著增強，mtDNA位于呼吸鏈附近，對氧化損傷的敏感性高于核DNA(nDNA)，因而它比nDNA受到的氧化損傷更大[28]。在持續(xù)的氧化應激條件下，可能最終導致mtDNA耗竭，因此mtDNA是線粒體功能障礙的生物標記之一[29-30]。本研究的結果也表明，不同濃度AAPH處理均導致IPEC-J2細胞中mtDNA拷貝數(shù)顯著降低。有趣的是，癌細胞中mtDNA拷貝數(shù)的變化是異常調節(jié)的，與氧化應激增加有關，但可能顯示增加或減少，具體取決于癌癥類型、組織和疾病階段[29]。

線粒體的含量對細胞功能至關重要，取決于線粒體生物發(fā)生與線粒體之間的平衡，在細胞中受到嚴格調節(jié)[26]。新的線粒體形成受多種轉錄因子調控，包括TFAM和線粒體轉錄因子B(TFBMs)[26]。TFAM轉錄的上調通常與mtDNA拷貝數(shù)的增加同時出現(xiàn)，這表明TFAM將核轉錄反應與mtDNA拷貝數(shù)聯(lián)系起來，從而協(xié)調了2個基因組之間的線粒體生物發(fā)生[31]。類似地，本試驗結果也顯示，不同濃度AAPH處理均顯著抑制TFAM和TFBMs的表達，與此同時mtDNA拷貝數(shù)顯著降低。

此外，線粒體定位蛋白家族中的解偶聯(lián)蛋白(UCPs)參與ROS產生的控制，UCPs通常會限制mROS的產生進而保護細胞免受氧化應激[26]。在內皮細胞(EC)中，UCP1過表達抑制mROS的產生，并且人主動脈EC中UCP2的過表達阻斷了脂肪酸誘導的mROS的產生[32-33]。UCP2上調也可改善高血糖引起的內皮功能障礙[26,34]。Cadenas等[35]發(fā)現(xiàn)，心臟中表達的UCP1同源物UCP2和UCP3通過減少ROS的產生來保護線粒體的氧化損傷。肌細胞中適度的UCP3過表達抑制了ROS的產生并增加了脂肪酸的氧化[36]。本試驗結果顯示，AAPH處理顯著抑制IPEC-J2細胞中UCP1和UCP3的表達，對UCP2的表達沒有顯著影響。值得注意的是，與UCP1和UCP3不同，UCP2在AAPH誘導下的表達水平略有上升。此前也有報道顯示患有慢性高血糖癥的病人中UCP2的表達增加以及UCP3的表達減少可能會導致葡萄糖刺激的胰島素分泌受損，表明UCP2和UCP3在調節(jié)β細胞功能中可能具有不同的作用[37]。這些結果提示我們UCP2在腸上皮細胞氧化應激響應中可能具有不同的調控機制和作用。

本研究揭示了ROS介導的線粒體應激可能是IPEC-J2細胞響應氧化損傷的潛在機制之一(圖6)。通過一系列試驗評估IPEC-J2細胞氧化損傷，建立了AAPH誘導的腸上皮細胞氧化應激模型，為進一步深入研究氧化應激對動物腸道健康影響提供了方便且穩(wěn)定的體外模型，為開發(fā)安全、高效的飼用抗氧化劑提供了潛在的作用靶點。

AAPH：2，2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽 2,2-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride；ROS：活性氧 reactive oxygen species；mROS：線粒體活性氧 mitochondrion reactive oxygen species；mtDNA：線粒體DNA mitochondrion DNA；ΔΨm：線粒體膜電位 mitochondrial membrane potential；TFAM：線粒體轉錄因子A mitochondrial transcription factor A：TFBMs：線粒體轉錄因子B mitochondrial transcription factor B；UCP1/3：解偶聯(lián)蛋白 uncoupling protein 1/3?！荷仙?increase；↓：下降 decrease。

4 結 論

① 在AAPH誘導的氧化應激中，IPEC-J2細胞活力下降，細胞增殖受到抑制，細胞內ROS含量升高，細胞線粒體膜電位降低，mtDNA拷貝數(shù)降低，線粒體生物合成相關基因表達受到抑制。

② 綜合考慮各項指標，可采用30 mmol/L AAPH刺激IPEC-J2細胞24 h建立豬腸上皮細胞氧化損傷模型。