周苗苗 劉桂芹 劉文強(qiáng) 朱明霞 王長法

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院毛驢高效繁育與生態(tài)飼養(yǎng)研究院，聊城 252000)

蛋白質(zhì)是動物必不可少的營養(yǎng)元素，飼糧蛋白質(zhì)在動物體內(nèi)水解為氨基酸(amino acids,AA)或小肽后被腸道吸收。其中，小肽(二肽和三肽)是動物攝取蛋白質(zhì)的主要形式[1]。小肽的吸收利用在動物營養(yǎng)物質(zhì)代謝和動物健康方面有重要意義。腸道小肽的吸收主要依賴小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(oligopeptide transporter 1,PepT1)。PepT1是一種低親和力、高容量的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于質(zhì)子偶聯(lián)寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體(proton-coupled oligopeptide transporter,POT)家族，在質(zhì)子電化學(xué)梯度的驅(qū)動下，能跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)寡肽和肽類藥物[2-4]。PepT1主要在小腸中表達(dá)，此外，在大腸[5-6]、瓣胃和瘤胃[7]、腎臟和肝臟[5,8]、胰腺[9]、性腺[5,10]中亦有表達(dá)。PepT1可以轉(zhuǎn)運(yùn)數(shù)千種寡肽和多種肽結(jié)構(gòu)類似藥物，如氨基頭孢菌素、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑以及抗病毒和抗腫瘤藥物[11-12]。PepT1的表達(dá)和功能已在人類[13-14]、兔[8,15]、大鼠[16]、小鼠[17]、豬[18]、雞[19]、牛[20-21]、綿羊[22]、牦牛[23]、斑馬魚[10]、大西洋鱈魚[24]、大西洋鮭魚[25]和雙髻鯊[9]等多種動物中進(jìn)行了研究。眾多研究表明，PepT1在物種間高度保守，PepT1蛋白由大約708個AA殘基組成，有12個跨膜區(qū)(transmembrane domains,TMD)，且在TMD 9和TMD 10之間有1個大的細(xì)胞外環(huán)[13,16-18,21-22]。目前關(guān)于PepT1功能的研究主要集中在擬肽類藥物轉(zhuǎn)運(yùn)以及胃腸道生理病理學(xué)等方面[2,11-12,26]。此外，PepT1的生物活性受底物、激素、年齡和生理條件等多種因素的調(diào)節(jié)[6,27-28]。PepT1在動物的生長和代謝中起著重要的生理作用。然而，PepT1在驢中的表達(dá)和功能研究還未見報道。因此，本試驗擬研究驢(Equusasinus)PepT1(ePepT1)基因的克隆、序列分析及組織表達(dá)，以期為進(jìn)一步研究驢的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 總RNA的提取和全長cDNA克隆

表1 試驗中所用引物

表2 PCR反應(yīng)體系

1.2 ePepT1的AA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

用ORF Finder推導(dǎo)AA序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)；利用計算機(jī)pI/Mw工具(ExPASy Proteomics Server; https://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測ePepT1蛋白的分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)(theoretical isoelectric point, pI)；利用在線軟件(http://scratch. proteomics. ics. uci. edu/)預(yù)測ePepT1蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；利用生物序列分析(Lyngby TMHMM Server; http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測ePepT1的跨膜區(qū)；利用NetNglyc和NetPhos服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/; http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測潛在的N糖基化、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)位點(diǎn)的AA序列；利用MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[29]。

1.3 實時熒光定量PCR

1.4 統(tǒng)計分析

本研究所有數(shù)據(jù)用SAS 9.2進(jìn)行分析，多組數(shù)據(jù)間采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)用柱狀圖表示，誤差線為標(biāo)準(zhǔn)差。當(dāng)P<0.05時認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ePepT1的AA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR特異性擴(kuò)增ePepT1基因，然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測并切膠回收。目的基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后可見一條約2 000 bp大小的條帶(圖1)。經(jīng)測序驗證，成功擴(kuò)增ePepT1基因。序列分析表明，ePepT1的開放閱讀框為2 124 bp，可編碼707個AA殘基組成的多肽鏈，該蛋白分子質(zhì)量為78.6 ku，等電點(diǎn)為7.52。ePepT1的AA序列與馬(99.15%)、羊駝(86.58%)、山羊(86.28%)、牛(86.14%)、綿羊(85.43%)、豬(84.60%)、人類(83.47%)、狗(83.36%)、小鼠(83.36%)和大鼠(82.82%)的PepT1的AA序列高度保守。對ePepT1蛋白進(jìn)行預(yù)測得出，二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋(Hh)占32.39%，β-折疊(Ee)占27.58%，β-轉(zhuǎn)角(Tt)占9.76%，無規(guī)則卷曲(Cc)占30.27%。親水性和疏水性分析預(yù)測ePepT1有11個潛在的TMD，且在TMD 9和TMD 10之間有1個大的細(xì)胞外環(huán)(圖2)。如圖3所示，ePepT1的AA序列中有5個胞外N-糖基化位點(diǎn)(Asn50、Asn438、Asn508、Asn530、Asn541)，5個胞外PKC作用位點(diǎn)(Ser8、Ser249、Ser252、Thr356、Ser357)和3個PKA作用位點(diǎn)(Ser8、Ser29、Ser275)(圖3)。根據(jù)不同動物PepT1的AA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖4所示。

1：DL15 000標(biāo)記物; 2和3：ePepT1擴(kuò)增產(chǎn)物。

橫軸：氨基酸序數(shù)；縱軸：疏水系數(shù)。

N-glyc:N糖基化位點(diǎn) glycosylation site；PKA:蛋白激酶A protein kinase A;PKC：蛋白激酶C protein kinase C。

圖4 基于不同動物PepT1的氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 ePepT1基因的組織表達(dá)

以GAPDH做內(nèi)參基因，分別檢測了ePepT1基因在驢腎臟、脾臟、心臟、肝臟、肺臟、胃、十二指腸、空腸、回腸組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，ePepT1在組織中廣泛表達(dá)，其在腸道(十二指腸、空腸和回腸)和肺臟中的相對表達(dá)量較高，顯著高于腎臟、脾臟、胃、心臟、肝臟(P<0.05，圖5)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

PepT1在從細(xì)菌到人類的不同物種中高度保守[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，ePepT1 cDNA開放閱讀框為2 124 bp，可以編碼由707個AA殘基組成、分子質(zhì)量為78.6 ku的多肽鏈。ePepT1蛋白大小與馬、綿羊和牛(707個AA殘基)[21-22]相同，但比人類和豬(708個AA殘基)[13,18]、小鼠(709個AA殘基)[17]以及大鼠(710個AA殘基)[16]小。疏水性分析預(yù)測ePepT1有11個潛在的TMD，這與奧奈達(dá)希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)(TMD 14)[32]和其他哺乳動物如人和牛(TMD 12)不同[13,21]。同其他物種一樣，ePepT1蛋白在TMD 9和TMD 10之間有1個大的細(xì)胞外環(huán)。此外，ePepT1蛋白TMD 9和TMD 10之間的胞外環(huán)上有5個推測的N-糖基化位點(diǎn)(Asn50、Asn438、Asn508、Asn530、Asn541)。N-糖基化對寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)、穩(wěn)定性和底物轉(zhuǎn)運(yùn)至關(guān)重要[33-35]。Chan等[34]研究結(jié)果顯示，人PepT1的TMD 9和TMD 10之間的胞外環(huán)中所有的天冬酰胺殘基(asparagine, Asn)都可以被N-糖基化修飾，且N-糖基化位點(diǎn)的突變可以降低PepT1對甘氨酰肌氨酸(Gly-Sar)轉(zhuǎn)運(yùn)的Vmax值。Wang等[35]研究亦發(fā)現(xiàn)牛PepT2的轉(zhuǎn)運(yùn)功能受N-糖基化的影響。此外，ePepT1蛋白還具有5個胞外PKC作用位點(diǎn)(Ser8、Ser249、Ser252、Thr356、Ser357)和3個PKA作用位點(diǎn)(Ser8、Ser29、Ser275)。據(jù)報道，PKA和PKC可以通過調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(GLUT2)和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PepT1來改變營養(yǎng)素的攝取[36]。其他研究亦證明小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能受PKC磷酸化的調(diào)控[22,37-38]。這些磷酸化位點(diǎn)可能在PKC和PKA調(diào)節(jié)ePepT1的轉(zhuǎn)運(yùn)功能中發(fā)揮重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)PepT1主要在腸道中表達(dá)，其組織分布規(guī)律不同于PepT2(主要在腎臟中表達(dá))[39]。眾多研究表明，PepT1在動物消化道中廣泛表達(dá)，且在十二指腸、空腸和回腸中表達(dá)量最高[5-6,9,24]。此外，PepT1的表達(dá)受生理狀態(tài)，如發(fā)育時期、營養(yǎng)狀況和疾病狀態(tài)等多種因素的調(diào)控[6,28,40-41]。很多研究發(fā)現(xiàn)，5/6腎臟切除、小肽、甲狀腺激素等均可增加PepT1的基因豐度[5,27]。本試驗中，ePepT1基因在驢腎臟、脾臟、心臟、肝臟、肺臟、胃、十二指腸、空腸、回腸組織中均有表達(dá)，且在腸道(十二指腸、空腸和回腸)中的相對表達(dá)量顯著高于其他組織，其組織表達(dá)規(guī)律與以往研究結(jié)果一致。PepT1在動物體內(nèi)的組織分布與其生理功能相適應(yīng)，PepT1主要在消化道小肽結(jié)合氨基酸的攝取中發(fā)揮重要作用[7,18,21]。畜禽可通過調(diào)節(jié)PepT1的表達(dá)來改變機(jī)體對小肽的攝取，以滿足不同生長階段對營養(yǎng)物質(zhì)的需求。本研究結(jié)果提示，ePepT1在驢腸道小肽類營養(yǎng)物質(zhì)的吸收中發(fā)揮重要生理作用。ePepT1的表達(dá)調(diào)控及其在驢營養(yǎng)物質(zhì)代謝中的具體作用仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

① 本試驗成功擴(kuò)增出ePepT1基因，序列分析表明ePepT1的開放閱讀框為2 124 bp，可編碼707個AA殘基組成的多肽鏈。

② 研究證實ePepT1基因在驢各組織中普遍表達(dá)，且在十二指腸、空腸和回腸中高表達(dá)。