郭志強 胡海強 謝曉紅 鄺良德 李叢艷 雷 岷 鄭 潔 楊 銳 李明暉*

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院，動物遺傳育種四川重點實驗室，成都 610066；2.西南大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶 400715)

銅是動物生長發(fā)育不可缺少的微量元素之一，具有促進(jìn)動物生長，參與機體造血，影響免疫器官發(fā)育、免疫和抗氧化功能發(fā)揮等多種功能。大量研究表明，在動物實際生產(chǎn)中添加高劑量的銅可以獲得明顯的促生長效果，但過量的銅進(jìn)入體內(nèi)不易被動物體吸收，會隨糞便排出體外，污染環(huán)境，并且銅還會在動物組織中沉積，在人類食用后影響身體健康[1-2]。而檸檬酸銅與硫酸銅相比具有生物學(xué)效價高、易被動物機體吸收、利用率高等優(yōu)勢，并能有效地減少銅的排放量和殘留量，保護生態(tài)環(huán)境[3]。李凡等[4]研究顯示，飼糧中添加60 mg/kg硫酸銅能夠顯著提高生長獺兔的平均日增重和平均日采食量。Peng等[5]研究發(fā)現(xiàn)，30～60 mg/kg檸檬酸銅可以顯著提高仔豬的生長性能，降低銅在體內(nèi)的殘留，提高仔豬抗氧化功能，降低盲腸大腸桿菌數(shù)量，增加乳酸桿菌數(shù)量。Yan等[6]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加20 mg/kg檸檬酸銅組仔豬的平均日增重、平均日采食量和料重比與飼糧中添加180 mg/kg硫酸銅組無顯著差異，但是檸檬酸銅可以提高仔豬骨髓抗菌肽的表達(dá)量，顯著降低仔豬腹瀉率。檸檬酸銅是我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2019年批準(zhǔn)的新型飼料添加劑，目前關(guān)于飼糧中添加檸檬酸銅的研究主要集中在仔豬上，而關(guān)于檸檬酸銅在肉兔飼糧中的應(yīng)用研究鮮見報道。因此，本試驗以新西蘭兔為研究對象，研究飼糧中添加檸檬酸銅對其生長性能、小腸黏膜發(fā)育和血清生化指標(biāo)的影響，比較硫酸銅和檸檬酸銅的作用效果，為檸檬酸銅在肉兔飼糧中的科學(xué)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

檸檬酸銅，市售，銅含量在34.5%～36.7%；硫酸銅，市售，銅含量≥25.1%。

1.2 試驗設(shè)計

選擇28日齡斷奶、體重相近的新西蘭肉兔420只，隨機分為5組，每組14個重復(fù)，每個重復(fù)6只(公母各占1/2)。5組肉兔分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0(對照組)、10、20 mg/kg(以銅計)檸檬酸銅以及20、150 mg/kg(以銅計)硫酸銅的試驗飼糧，各組飼糧實測銅含量依次為4.6、15.1、24.6、24.7和148.4 mg/kg。預(yù)試期7 d，正試期42 d。

1.3 基礎(chǔ)飼糧與飼養(yǎng)管理

基礎(chǔ)飼糧配方參照谷子林等[7]推薦的營養(yǎng)水平和結(jié)合本地飼料資源設(shè)計，制成顆粒飼料(顆粒直徑3 mm，長度6～8 mm)?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗前對兔舍進(jìn)行徹底沖洗和嚴(yán)格消毒，試驗期間飼養(yǎng)管理和免疫程序采用常規(guī)方法，自由采食、自由飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.4 樣品采集

在正試期結(jié)束當(dāng)天，選擇體重與該組平均體重接近的6只兔(公母各占1/2)，經(jīng)耳緣動脈采血5 mL，采血后靜置10 min，待血液凝固后，經(jīng)3 000 r/min離心20 min，然后分離血清并分裝于1.5 mL的EP管中，放置在-80 ℃冰箱中冷凍保存，用于血清生化指標(biāo)的檢測。將采完血的肉兔進(jìn)行屠宰，取十二指腸、空腸和回腸中段3 cm長的組織樣品，用生理鹽水沖洗干凈并迅速固定于10%福爾馬林緩沖液中24 h，用于測定小腸黏膜發(fā)育指標(biāo)。

1.5 測定指標(biāo)和方法

1.5.1 生長性能

于正試期開始和結(jié)束當(dāng)天晨飼前空腹稱重，計算凈增重、平均日增重；準(zhǔn)確記錄試驗兔的喂料量和余料量，計算平均日采食量；根據(jù)試驗兔的平均日采食量和平均日增重，計算料重比；記錄試驗期間發(fā)生過腹瀉的兔的只數(shù)和死亡兔只數(shù)，計算腹瀉率和死亡率。

腹瀉率(%)=(腹瀉兔只數(shù)/試驗兔總只數(shù))×100；
死亡率(%)=(死亡兔只數(shù)/試驗兔總只數(shù))×100。

1.5.2 小腸黏膜發(fā)育指標(biāo)

固定的組織樣品經(jīng)洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋等處理后切片(5 μm)，將切片置于載玻片上，蘇木精-伊紅染色，封片。選擇完整且走向良好的絨毛測量絨毛高度和隱窩深度，絨毛高度是從絨毛頂端到絨毛隱窩交界處的距離，隱窩深度定義為相鄰絨毛間的內(nèi)陷深度。用Nikon Eclipse TS100顯微鏡和NIS-ELEMENT F3.2成像軟件對切片進(jìn)行組織學(xué)觀察并拍照。使用Imageproplus 5.1圖像分析軟件分析每個樣品的絨毛高度和隱窩深度，每個樣品測量10次，獲得每個指標(biāo)的平均值，用于統(tǒng)計分析。

1.5.3 血清生化指標(biāo)

血清胰島素(Ins)、生長激素(GH)、類胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)含量和銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、銅藍(lán)蛋白(CP)活性均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒檢測，根據(jù)說明書要求進(jìn)行操作。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2016進(jìn)行簡單處理后，采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和卡方分析，并采用Duncan氏法多重比較檢驗組間差異顯著性，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，以P<0.05為差異顯著，以P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬酸銅對肉兔生長性能的影響

由表2可知，飼糧中添加檸檬酸銅和硫酸銅均可提高肉兔的生長性能、降低腹瀉率和死亡率。其中，20 mg/kg檸檬酸銅組和150 mg/kg硫酸銅組的平均日增重顯著高于對照組(P<0.05)，料重比、死亡率和腹瀉率顯著低于對照組(P<0.05)，且20 mg/kg檸檬酸銅組和150 mg/kg硫酸銅組之間各生長性能指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05)。

表2 檸檬酸銅對肉兔生長性能的影響

2.2 檸檬酸銅對肉兔小腸黏膜發(fā)育的影響

由表3可知，飼糧中添加檸檬酸銅和硫酸銅均可以提高肉兔小腸各段絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度，且隨著銅添加量的增加絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度呈提高趨勢。其中，20 mg/kg檸檬酸銅組和150 mg/kg硫酸銅組肉兔小腸各段絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度均顯著高于對照組(P<0.05)，但20 mg/kg檸檬酸銅組和150 mg/kg硫酸銅組之間上述指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)。飼糧中添加檸檬酸銅和硫酸銅均有降低肉兔小腸各段隱窩深度的趨勢，隨著銅添加量的增加降低趨勢更明顯，其中以150 mg/kg硫酸銅組小腸各段隱窩深度最小，但各組之間差異均不顯著(P>0.05)。

表3 檸檬酸銅對肉兔小腸黏膜發(fā)育的影響

2.3 檸檬酸銅對肉兔血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知，飼糧中添加檸檬酸銅和硫酸銅對肉兔血清中胰島素樣生長因子-Ⅰ含量均無顯著影響(P>0.05)，但可顯著提高血清中銅超氧化物歧化酶、銅藍(lán)蛋白活性和胰島素、生長激素含量(P<0.05)，并均以150 mg/kg硫酸銅組最高，但其血清中銅超氧化物歧化酶、銅藍(lán)蛋白活性和生長激素含量與20 mg/kg檸檬酸銅組差異不顯著(P>0.05)。

表4 檸檬酸銅對肉兔血清生化指標(biāo)的影響

3 討 論

3.1 檸檬酸銅對肉兔生長性能的影響

眾多研究表明，有機銅、螯合銅等有機銅源在飼糧中的添加效果顯著優(yōu)于無機銅源硫酸銅[3,8-10]。本試驗結(jié)果表明，20 mg/kg檸檬酸銅組和150 mg/kg硫酸銅組在平均日采食量、平均日增重和料重比上均差異不顯著，且20 mg/kg檸檬酸銅組的料重比更低，低劑量檸檬酸銅和高劑量硫酸銅在促進(jìn)肉兔生長方面的效果相當(dāng)，這可能與檸檬酸銅吸收利用率較高[8]有關(guān)。晏家友等[8]研究了飼糧中添加20 mg/kg不同銅源的銅對肉兔生產(chǎn)性能的影響，研究結(jié)果顯示檸檬酸銅組的平均日增重和料重比顯著優(yōu)于同劑量硫酸銅組，與本試驗結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)，銅在抵抗外來病原、增加機體免疫力、提高采食量和生產(chǎn)性能等方面發(fā)揮重要作用[3]。本試驗中20 mg/kg檸檬酸銅組肉兔腹瀉率和死亡率顯著降低，其可能原因：1)眾多研究表明，高銅可以降低腹瀉，本試驗中檸檬酸銅的吸收率顯著高于硫酸銅，20 mg/kg檸檬酸銅在體內(nèi)本吸收的銅量相當(dāng)于150 mg/kg硫酸銅，在機體內(nèi)可能發(fā)揮了高銅作用[1]；2)檸檬酸銅在體內(nèi)分解出檸檬酸，研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸可以酸化腸道，降低腹瀉[11]；3)研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸銅可以顯著降低盲腸大腸桿菌書量，提高乳酸桿菌數(shù)量[5]，而大腸桿菌是肉兔腹瀉的最重要致病菌，乳酸菌是肉兔盲腸最重要的有益菌；4)還可能與血清溶菌酶含量提高相關(guān)，Yan等[6]研究發(fā)現(xiàn)飼糧添加檸檬酸銅可提高斷奶仔豬血清溶菌酶含量。

3.2 檸檬酸銅對肉兔小腸黏膜發(fā)育的影響

研究表明，斷奶后飼糧中的銅是保證動物腸道發(fā)育和生長的必要條件之一，高銅具有改善腸道微觀形態(tài)等方面的作用[9-10,12]。本試驗結(jié)果顯示，飼糧中添加20 mg/kg檸檬酸銅可以顯著提高肉兔小腸各段絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度，且20 mg/kg檸檬酸銅組與150 mg/kg硫酸銅組無顯著差異，這表明在飼糧中添加20 mg/kg檸檬酸銅可以有效增大腸道吸收面積，提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率，且與高劑量硫酸銅效果相當(dāng)。低劑量檸檬酸銅能夠提高小腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度，可能與檸檬酸銅的銅生物利用率較高和檸檬酸所起到的酸化劑作用高度相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸具有提高腸道黏膜發(fā)育的作用[11,13]。盡管飼糧中添加檸檬酸銅對小腸各段隱窩深度無顯著影響，但隨著飼糧中檸檬酸銅添加量的增加小腸各段隱窩深度變淺趨勢更加明顯。

3.3 檸檬酸銅對肉兔血清生化指標(biāo)的影響

動物體內(nèi)存在多種含銅酶，銅超氧化物歧化酶和銅藍(lán)蛋白是體內(nèi)重要的含銅酶，體內(nèi)銅含量變化可導(dǎo)致含銅酶活性的變化[14]。Hawk等[15]報道，動物體內(nèi)如果出現(xiàn)銅缺乏，則會導(dǎo)致超氧化物歧化酶活性降低，引起機體組織損傷。王艷華[16]研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬飼糧中添加240 mg/kg的硫酸銅可以顯著提高肝臟中超氧化物歧化酶活性。本試驗中20 mg/kg檸檬酸銅與150 mg/kg硫酸銅有相同的提高銅超氧化物歧化酶和銅藍(lán)蛋白活性的作用，可能與檸檬酸的酸化作用有關(guān)，具體作用機制有待進(jìn)一步研究。胰島素、生長激素和胰島素樣生長因子-Ⅰ含量在一定范圍內(nèi)升高時，可加速葡萄糖的利用，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，提高營養(yǎng)代謝和生長發(fā)育速度。吳金節(jié)等[17]研究發(fā)現(xiàn)，高銅可以顯著提高斷奶仔豬血清中生長激素和胰島素含量。馬德磊[12]的試驗結(jié)果表明80和160 mg/kg銅可以顯著提高生長肉兔血清中胰島素和生長激素含量，但對血清中胰島素樣生長因子-Ⅰ含量無顯著影響，上述試驗結(jié)果與本試驗結(jié)果類似，飼糧中添加20 mg/kg檸檬酸銅可顯著提高肉兔血清中胰島素和生長激素含量，低劑量的檸檬酸銅與高劑量的硫酸銅作用效果相似，這可能與檸檬酸可以增加胰高血糖素樣2和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白mRNA表達(dá)相關(guān)。

4 結(jié) 論

本試驗條件下，飼糧中添加20 mg/kg檸檬酸銅可以顯著提高肉兔的生長速度，降低腹瀉率和死亡率，增強腸道發(fā)育，提高血清含銅酶活性和生長激素、胰島素含量，其作用效果與150 mg/kg硫酸銅相當(dāng)。