金瑤瑤 徐 彬 王琳燚 孫全友 席燕燕 袁艷枝 王改利 付 趁 李紹鈺*

(1.河南農業(yè)大學動物科技學院，鄭州 450002；2.河南省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450002)

飼料全面禁抗對肉仔雞生長速度和腸道健康造成挑戰(zhàn)，因此尋找一種綠色安全的飼料添加劑來代替抗生素成為大勢所趨。青蒿為一年生草本植物，其被廣泛種植于世界各地。青蒿中的主要有效成分為倍半萜類、氨基酸、多酚以及黃酮類等，這些有效成分使得青蒿具有抗菌、抗炎及抗瘧疾等作用[1-2]。然而，植物細胞壁的存在使得青蒿中有效成分的釋放存在阻礙，而使用纖維素酶和果膠酶處理，可以促進植物中有效成分的釋放[3]。研究發(fā)現，在熱應激肉仔雞飼糧中添加酶處理的青蒿，可以提高肉仔雞采食量，增強其抗氧化能力，緩解熱應激對肉仔雞造成的損傷[4]；在肉仔雞飼糧中添加青蒿粉和青蒿精油，可在一定程度上減少肉仔雞盲腸中腸桿菌科細菌的數量，并使乳酸菌數量得到相應地增加[5]。地衣芽孢桿菌為兼氧革蘭氏陽性菌，具有較強的抗逆性，在腸道中可通過與有害菌競爭定植位點，促進有益菌定植，起到改善腸道健康的作用。在肉仔雞飼糧中添加地衣芽孢桿菌，可顯著提升平均日增重，降低盲腸中致病菌的數量，顯著提高乳桿菌屬的豐度，改善腸道內環(huán)境[6]。目前，酶解青蒿對肉仔雞的影響主要集中于生長性能，其對腸道菌群方面的影響報道較少，并且酶解青蒿與地衣芽孢桿菌聯(lián)合應用對生長性能以及腸道菌群的影響更是鮮有報道。因此，本試驗通過在肉仔雞飼糧中單獨添加酶解青蒿或與地衣芽孢桿菌聯(lián)用，利用高通量測序技術探討其對肉仔雞腸道菌群的影響，進而觀察對生長性能的作用，以期為酶解青蒿在肉仔雞生產中的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青蒿產于重慶，收割于生長盛期至花蕾期，使用纖維素酶和果膠酶對其進行處理，酶解青蒿主要活性成分為青蒿素、多酚和黃酮類化合物。抗生素主要成分為維吉尼霉素，含量為50%。地衣芽孢桿菌活菌總數量為2×1010CFU/g。

1.2 試驗設計

選用初始體重相近的1日齡科寶(Cobb)肉仔雞480只，隨機分為4組，每組6個重復，每個重復20只。對照組飼喂基礎飼糧，抗生素組、試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組分別飼喂在基礎飼糧中添加20 mg/kg抗生素、1 g/kg酶解青蒿以及1 g/kg酶解青蒿+200 mg/kg地衣芽孢桿菌的飼糧?；A飼糧參照中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準NY/T 33—2004《雞飼養(yǎng)標準》進行配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗在河南大用實業(yè)有限公司進行，采用3層籠養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)20只雞，試驗期42 d。試驗期間雞只自由采食和飲水；試驗第1周溫度保持在32～34 ℃，然后每周逐漸降低2～3 ℃，直至降為23 ℃并保持不變；按常規(guī)免疫程序進行接種。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 生長性能的測定

在42日齡，以重復為單位對試驗雞進行稱重，稱重前肉雞禁食12 h，同時詳細記錄試驗期間各重復耗料量，計算平均日采食量、平均日增重和料重比。

1.4.2 盲腸菌群的測定

在42日齡，每組隨機選取3只接近平均體重的肉仔雞進行屠宰，收集盲腸內容物于無菌凍存管中，置于液氮中保存，用于菌群測定。

用FastDNA Spin Kit for Soil(MP公司，美國)試劑盒對盲腸內容物進行DNA抽提，用Nanodrop 2000對DNA濃度和純度進行檢測，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測進行DNA提取質量。

1.5 數據處理與分析

生長性能數據采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，若差異顯著，則用Duncan氏法進行多重比較，以P<0.05為差異顯著性判斷標準，結果以平均值±標準差表示。

盲腸菌群原始測序序列使用Trimmomatic軟件質控，FLASH軟件進行拼接。對優(yōu)化后的序列根據97%的相似度進行操作分類單元(OTU)聚類，并且對每個樣本在各個水平的菌群組成進行統(tǒng)計。試驗結果在I-Sanger云平臺進行分析。

2 結果與分析

2.1 酶解青蒿聯(lián)合地衣芽孢桿菌對肉仔雞生長性能的影響

由表2可知，與對照組相比，試驗Ⅱ組肉仔雞平均日增重和42日齡終末體重顯著提高(P<0.05)，抗生素組和試驗Ⅰ組上述指標有提高趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。各組之間肉仔雞平均日采食量和料重比無顯著差異(P>0.05)。

表2 酶解青蒿聯(lián)合地衣芽孢桿菌對肉仔雞生長性能的影響

2.2 酶解青蒿聯(lián)合地衣芽孢桿菌對肉仔雞盲腸菌群的影響

2.2.1 序列及OTU統(tǒng)計

本次試驗采用高通量測序的方法對各組肉仔雞盲腸菌群進行了測序分析，最終獲得667 924條有效序列，平均長度414.61 bp。對獲得的有效序列按照97%相似性進行OTU聚類分析，得到所有樣本平均聚類的OTU數目為828。同時，采用隨機抽樣的方法，從獲得的樣本中隨機抽取一定數量的序列，進行稀釋曲線的繪制，得到圖1。在該曲線中，當測序量達到一定的深度，則曲線趨于平坦，由此可得出本次測序樣本深度充分，數據量合理。

2.2.2 alpha多樣性分析

由表3可知，各組肉仔雞盲腸菌群測序覆蓋度達到99.77%以上?？股亟M和各試驗組肉仔雞盲腸菌群Ace指數和Chao1指數與對照組相比均有提高的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)；抗生素組和各試驗組肉仔雞盲腸菌群Shannon指數顯著高于對照組(P<0.05)，且Simpson指數顯著低于對照組(P<0.05)。這說明在肉仔雞飼糧中添加酶解青蒿和地衣芽孢桿菌有助于提高肉仔雞盲腸菌群豐富度和多樣性。

表3 酶解青蒿聯(lián)合地衣芽孢桿菌對肉仔雞盲腸菌群多樣性的影響

2.2.3 beta多樣性分析

圖2為各組肉仔雞盲腸菌群組成的主坐標分析(PCoA)圖。結果顯示，抗生素組和各試驗組在主效應1(PC1)上與對照組有較為明顯的組間區(qū)分，說明抗生素組和試驗組的菌群組成更為相似。

圖2 PCoA圖

2.2.4 盲腸菌群組成

從門水平分析，各組肉仔雞盲腸菌群組成見圖3和表4。由圖3可知，各組肉仔雞盲腸菌群中，厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和軟壁菌門(Tenericutes)為優(yōu)勢菌門，其總的相對豐度占96.7%～99.2%。由表4可知，與對照組相比，抗生素組和各試驗組肉仔雞盲腸菌群中厚壁菌門相對豐度顯著提高(P<0.05)，軟壁菌門相對豐度有降低趨勢，但差異不顯著(P>0.05)；與對照組相比，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組肉仔雞盲腸菌群中擬桿菌門相對豐度顯著降低(P<0.05)。上述結果說明，在飼糧中添加酶解青蒿和地衣芽孢桿菌改變了肉仔雞盲腸在門水平上的菌群組成。

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Tenericutes：軟壁菌門；Proteobacteria：變形菌門；Cyanobacteria：藍藻菌門；Others：其他。

表4 肉仔雞盲腸優(yōu)勢菌群在門水平上的相對豐度

從屬水平分析，各組肉仔雞盲腸菌群組成見圖4和表5。由圖4可知，各組肉仔雞盲腸菌群中菌屬的相對豐度不同，其中相對豐度大于2%的菌屬有19種。對照組相對豐度較高的菌屬為擬桿菌屬(Bacteroides，58.11%)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium，10.23%)和另枝菌屬(Alistipes，6.92%)，抗生素組相對豐度較高的菌屬為擬桿菌屬(20.45%)、另枝菌屬(8.02%)和糞桿菌屬(Faecalibacterium，7.37%)，試驗Ⅰ組相對豐度較高的菌屬為糞桿菌屬(15.46%)、巴恩斯氏菌屬(Barnesiella，9.20%)和未明確梭菌科相關菌屬(norank_f_Clostridiales_vadinBB60_group，7.98%)，試驗Ⅱ組相對豐度較高的菌屬為糞桿菌屬(15.11%)、瘤胃球菌科UCG-014菌屬(Ruminococcaceae_UCG-014，13.57%)、擬桿菌屬(11.99%)。由表5可知，與對照組相比，抗生素組和各試驗組肉仔雞盲腸菌群中擬桿菌屬相對豐度顯著降低(P<0.05)，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組糞桿菌屬相對豐度顯著提高(P<0.05)，抗生素組、試驗Ⅰ組瘤胃球菌科UCG-014菌屬相對豐度有提高趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，試驗Ⅱ組瘤胃球菌科UCG-014菌屬相對豐度顯著提高(P<0.05)，試驗Ⅰ組未明確梭菌科相關菌屬相對豐度顯著提高(P<0.05)，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組考拉桿菌屬相對豐度顯著降低(P<0.05)。

Bacteroides:擬桿菌屬；Faecalibacterium:糞桿菌屬；Alistipes:另枝菌屬；Ruminococcaceae_UCG-014:瘤胃球菌科UCG-014菌屬；norank_f_Clostridiales_vadinBB60_group:未明確梭菌科相關菌屬；Phascolarctobacterium:考拉桿菌屬；unclassified_f_Ruminococcaceae:未分類的瘤胃球菌科菌屬；Barnesiella:巴恩斯氏菌屬；[Ruminococcus]_torques_group:瘤胃球菌屬扭鏈群；Parabacteroides:副桿狀菌屬；unclassified_f_Lachnospiraceae:未分類毛螺旋菌科相關菌屬；norank_f_norank_o_Mollicutes_RF39:norank_f_norank_o_柔膜菌綱RF39菌屬；[Eubacterium]_coprostanoligenes_group:產糞甾醇真細菌群菌屬；Butyricicoccus:丁酸球菌屬；Ruminococcaceae_UCG-005:瘤胃球菌科UCG-005菌屬；Rikenella:理研菌屬；norank_f_Flavobacteriaceae:未明確黃桿菌科菌屬；Christensenellaceae_R-7_group:克里斯滕菌科R-7群菌屬；Ruminococcus 1:瘤胃球菌屬1；Others:其他。

表5 肉仔雞盲腸優(yōu)勢菌群在屬水平上的相對豐度

3 討 論

3.1 酶解青蒿聯(lián)合地衣芽孢桿菌對肉仔雞生長性能的影響

青蒿具有抗球蟲、抗氧化、改善腸道黏膜形態(tài)和提高腸道消化酶等作用，從而為肉仔雞的健康生長提供保障。酶解青蒿是由纖維素酶和果膠酶對青蒿進行處理得到的，經過酶處理可以使青蒿中有效成分得到更高效地釋放。地衣芽孢桿菌為兼性厭氧菌，在腸道內定植后可迅速消耗掉腸道中的游離氧，為腸道中的有益菌提供適宜生長的環(huán)境，并且其本身在腸道中定植后還可產生許多淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等消化酶[7]，此外，地衣芽孢桿菌也能刺激腸道免疫細胞的生長，從而提高腸道對致病菌的抑制作用[8]。熱應激條件下，肉仔雞飼糧中添加0.005%青蒿油和1%青蒿粉混合物，可顯著提高肉仔雞平均日采食量，減少大腸桿菌以及葡萄球菌的數量，增加乳酸桿菌的數量[9]；加入酶解青蒿，可提高熱應激狀態(tài)下肉仔雞空腸中脂肪酶、胰蛋白酶的活性，提高空腸絨毛高度與絨隱比(絨毛高度/隱窩深度)，改善熱應激狀態(tài)下肉仔雞的腸道形態(tài)[10]。而在肉雞飼糧中單獨添加地衣芽孢桿菌時，發(fā)現其不僅能提高壞死性腸炎肉仔雞生長性能，并且可以調節(jié)壞死性腸炎所帶來的腸道菌群的改變[11]。本試驗中，飼糧添加抗生素和單獨添加酶解青蒿有提高肉仔雞平均日增重和終末體重的趨勢，酶解青蒿聯(lián)合地衣芽孢桿菌添加則顯著提高肉仔雞1～42日齡平均日增重和終末體重?？股鼐S吉尼霉素可能通過抑制革蘭氏陽性有害菌，延長飼糧在腸道中的停留時間，從而提高營養(yǎng)物質的吸收[12]。本試驗單獨添加酶解青蒿對肉仔雞生長性能的影響與Wan等[13]的研究結果相似，酶解青蒿聯(lián)合地衣芽孢桿菌對生長性能的影響優(yōu)于單獨添加酶解青蒿，初步推測其可能原因一方面是酶解青蒿改善了腸道形態(tài)，擴大了小腸對營養(yǎng)物質消化吸收表面積，并且其活性成分抑制了腸道中的有害菌；另一方面是地衣芽孢桿菌在腸道內定植后可產生有利于消化的酶和短鏈脂肪酸，從而提高飼糧的消化吸收率，并且促進有益菌群的增殖。因此，本試驗結果表明，飼糧單獨添加酶解青蒿或與地衣芽孢桿菌聯(lián)用對肉仔雞生長性能的改善效果不亞于抗生素。

3.2 酶解青蒿聯(lián)合地衣芽孢桿菌對肉仔雞盲腸菌群多樣性和豐富度的影響

腸道是動物機體重要的消化器官，也是機體中最大的細菌庫，腸道的生物屏障主要由腸道中的菌群構成，菌群的數量和結構對宿主的消化和健康起到重要的作用[14]。腸道菌群分析中，Ace指數和Chao1指數越大反映腸道菌群的豐富度越高，Shannon指數越大、Simpson指數越小則反映腸道菌群的多樣性越高，且腸道菌群多樣性通常與菌群的穩(wěn)定性和抵抗致病菌感染的能力呈正相關[15]。余怡然[16]研究表明，給MRL/lpr小鼠灌胃0.24 g/mL青蒿水劑，與模型小鼠相比，青蒿組小鼠腸道菌群Shannon指數和Simpson指數顯著提高，表明灌胃青蒿水劑可以提高試驗小鼠腸道菌群多樣性和豐富度。袁慧坤[17]研究表明，在北京鴨的飼糧中添加地衣芽孢桿菌，可使北京鴨腸道菌群多樣性得到提高，與對照組相比，地衣芽孢桿菌添加組腸道菌群Chao1指數和Shannon指數均有增加的趨勢。在本試驗中，抗生素組和各試驗組肉仔雞盲腸菌群Shannon指數顯著高于對照組，并且Simpson指數顯著低于對照組，表明抗生素組和試驗組的腸道菌群多樣性高于對照組；同時，對照組的Ace指數和Chao1指數也低于抗生素組和試驗組，表明抗生素組和試驗組腸道菌群豐富度高于對照組。引起試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組肉仔雞腸道菌群多樣性和豐富度提高的原因，可能是由于飼糧中加入的酶解青蒿中的有效活性成分如多酚、黃酮等物質具有提高腸道菌群數量以及調節(jié)菌群多樣性等作用[18]；同時，地衣芽孢桿菌可通過消耗腸道游離氧促進厭氧有益菌增殖，從而提高腸道菌群多樣性和豐富度，進而起到改善腸道微生態(tài)平衡的作用[19]。因此，本試驗結果說明，飼糧單獨添加酶解青蒿或與地衣芽孢桿菌聯(lián)用均可提高肉仔雞腸道菌群的多樣性和豐富度。

3.3 酶解青蒿聯(lián)合地衣芽孢桿菌對肉仔雞盲腸菌群組間差異的影響

由PCoA圖可知，各組腸道菌群具有不同的腸道區(qū)系，但是抗生素組和試驗組腸道菌群組間差異較小。從本試驗的腸道菌群組成以及組間差異分析可知，飼糧單獨添加酶解青蒿或與地衣芽孢桿菌聯(lián)用增加了肉仔雞腸道菌群中分解纖維素以及產生丁酸等有益菌的數量，使腸道菌群向有益健康的方向發(fā)展，從而促進肉仔雞的生長。酶解青蒿主要是通過其活性成分中的青蒿素抑制革蘭氏陰性菌如大腸桿菌的蛋白質合成、破壞細菌細胞壁以及干擾細菌藥物外排基因表達來達到抑菌效果[20]。地衣芽孢桿菌則主要是通過生物奪氧使腸道達到厭氧環(huán)境，促進有益菌的生長。維吉尼霉素主要作用于革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌的核糖體，從而阻止細菌蛋白質的合成，并且由于其不能通過革蘭氏陰性菌的細胞膜，所以其對革蘭氏陰性菌沒有影響[21]。因此，本試驗在飼糧中添加抗生素、酶解青蒿以及酶解青蒿聯(lián)合地衣芽孢桿菌會對肉仔雞腸道菌群區(qū)系產生不同的影響，但都是抑制了不同種屬的有害菌，使腸道菌群往健康方向發(fā)展。

3.4 酶解青蒿聯(lián)合地衣芽孢桿菌對肉仔雞盲腸菌群組成的影響

研究表明，在門水平上，腸道菌群主要由厚壁菌門(35%～80%)和擬桿菌門(17%～60%)組成[22]。當腸道中的厚壁菌門相對豐度得到提升時，有利于機體吸收食物中的熱量[23]，厚壁菌門相對豐度的提高還可以促進微生物菌群對纖維素的分解[24]，并且其產生的短鏈脂肪酸有利于維持機體腸道健康[25]。張亞楠等[26]對不同產蛋水平的蛋雞腸道菌群進行分析表明，在門水平上，不論產蛋量高或產蛋量低的組，4種優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門，而且厚壁菌門的相對豐度在所有組別中占絕對優(yōu)勢地位。在本試驗中，厚壁菌門和擬桿菌門為各組的優(yōu)勢菌門，并且與對照組相比，抗生素組和各試驗組厚壁菌門相對豐度顯著提高，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組擬桿菌門相對豐度顯著降低，這表明添加抗生素、酶解青蒿以及酶解青蒿聯(lián)合地衣芽孢桿菌改變了肉仔雞腸道菌群結構。Turnbaugh等[27]研究發(fā)現，體型較為瘦小的小鼠其腸道中的擬桿菌門相對豐度相對較高，而腸道中富集厚壁菌門的小鼠則較肥胖。由此提示本研究中試驗組肉仔雞生長性能的提高可能是通過調整厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度的比例而實現的。

本試驗中，在屬水平上，對照組和抗生素組的優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬，該屬細菌能幫助宿主分解多糖，并且可以產生丁酸鹽，從而提高宿主免疫力，有利于調節(jié)腸道免疫系統(tǒng)[28-29]；試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組的優(yōu)勢菌屬為糞桿菌屬和瘤胃球菌科UCG-014菌屬，該類菌屬被認為是腸道健康象征標志的最重要菌群之一，其可以分泌抗炎物質(水楊酸)和抗炎分子，協(xié)助抵御外來入侵病菌，同時可以減輕腸道炎癥保護腸道健康[30-31]，同時該菌屬也能夠產生丁酸，而丁酸又可以有效地促進雞空腸、盲腸防御素9、防御素14和放線菌素B1基因的變達，抑制異原微生物如沙門氏菌的侵襲[32]。在本試驗中，飼糧添加抗生素降低了肉仔雞盲腸中有害菌屬的相對豐度，提高了腸道的免疫能力，并且其優(yōu)勢菌屬擬桿菌屬能夠促進營養(yǎng)物質的消化吸收，進而提高生長性能。試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組單獨添加酶解青蒿或與地衣芽孢桿菌聯(lián)用均對肉仔雞盲腸中糞桿菌屬和瘤胃球菌科UCG-014菌屬相對豐度具有提升作用，且聯(lián)合作用對瘤胃球菌科UCG-014菌屬相對豐度的提升效果更好，其原因可能是酶解青蒿中的有效活性成分青蒿素、多酚類物質降低了擬桿菌屬的相對豐度，并且為糞桿菌屬和瘤胃球菌科UCG-014菌屬等菌屬提供了底物，從而促進其在腸道中的生長繁殖[33]。在試驗Ⅱ組中，酶解青蒿和地衣芽孢桿菌聯(lián)合添加對瘤胃球菌科UCG-014菌屬的增殖產生協(xié)同效應，其一方面原因可能是地衣芽孢桿菌在腸道內定植后消耗活性氧，并通過分泌活性物質抑制有害菌群，促進有益菌增殖；另一方面可能為酶解青蒿的加入為瘤胃球菌科UCG-014菌屬提供了底物，加強了其在腸道內的增殖效果。此外，增殖后的這些有益菌屬又可促進腸道中葡萄糖的代謝以及纖維的吸收，從而提高肉仔雞體重。

因此，本研究結果說明，單獨添加酶解青蒿或與地衣芽孢桿菌聯(lián)用能使腸道中厚壁菌門、糞桿菌屬和瘤胃球菌科UCG-014菌屬相對豐度顯著提高，這些菌群的增加有助于機體對營養(yǎng)物質的吸收，有利于維持腸道健康，從而提高肉仔雞生長性能。

4 結 論

① 飼糧單獨添加酶解青蒿對肉仔雞生長性能具有一定的提升作用，其與地衣芽孢桿菌聯(lián)用對生長性能的促進效果更佳。

② 酶解青蒿單獨添加或與地衣芽孢桿菌聯(lián)用均能改善肉仔雞腸道菌群結構，提高腸道菌群多樣性，提高盲腸中厚壁菌門與擬桿菌門相對豐度的比例，維持腸道健康。