王 鵬 黎育穎 田軍權(quán) 蘇文璇 尹 杰 印遇龍 姚 康*

(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，長沙 410025；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128)

氧化應(yīng)激在畜牧生產(chǎn)中極其常見。仔豬出生過程和斷奶、病毒細(xì)菌、飼料抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和霉變以及飼養(yǎng)密度過高等，都會在一定程度上引起機(jī)體氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激一般分為急性氧化應(yīng)激和慢性氧化應(yīng)激，其中慢性氧化應(yīng)激刺激強(qiáng)度弱、刺激時間長、頻率高，更加常見和多發(fā)[1-2]。D-半乳糖主要來源于動物乳汁中的乳糖，可引起慢性氧化應(yīng)激和輕度炎癥。例如，D-半乳糖易與體內(nèi)、體外蛋白質(zhì)和肽中的游離氨基酸反應(yīng)，形成高級糖基化終產(chǎn)物[3]，從而提高活性氧的產(chǎn)生量，降低線粒體呼吸復(fù)合的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致慢性氧化應(yīng)激損傷[4-5]。研究表明，D-半乳糖在小鼠中引起認(rèn)知障礙、神經(jīng)毒性、肝臟疾病以及慢性腎臟損傷[6-7]。鳥氨酸-α-酮戊二酸(ornithine-α-ketoglutarate，OKG)是一種營養(yǎng)鹽，由2分子的鳥氨酸(ornithine，Orn)和1分子的α-酮戊二酸(alpha-ketoglutarate，AKG)組成，由于其具有治療和合成代謝特性[8-9]，已經(jīng)使用了多個世紀(jì)，主要作用包括增加骨礦物質(zhì)密度[10]、治愈燒傷和創(chuàng)傷[11]和抗骨骼應(yīng)激[12]。OKG還是體內(nèi)脯氨酸、精氨酸和谷氨酰胺前體[13]。研究表明，相較于鳥氨酸和α-酮戊二酸的單獨(dú)添加，添加OKG能更有效地誘導(dǎo)胰島素和生長激素分泌[14]，并且還能提高能量代謝中丙酮酸的利用[15]。本課題組前期研究結(jié)果表明，飼糧中添加D-半乳糖顯著抑制仔豬生長，增加血清丙二醛含量，降低血清超氧化物歧化酶活性，造成仔豬慢性氧化應(yīng)激，添加的0.5%OKG可顯著提高仔豬末重、平均日采食量與血清谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸和支鏈氨基酸含量，改變腸道微生物區(qū)系，緩解D-半乳糖所造成的慢性氧化應(yīng)激[16]。因此，本試驗(yàn)通過在斷奶仔豬飼糧中添加D-半乳糖建立慢性氧化應(yīng)激模型，在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究OKG對由D-半乳糖導(dǎo)致的慢性氧化應(yīng)激仔豬生長性能、臟器指數(shù)、腸道形態(tài)以及血清生化指標(biāo)的影響，旨在完善OKG緩解D-半乳糖刺激斷奶仔豬產(chǎn)生慢性氧化應(yīng)激的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取28日齡的健康“長×大”二元雜交斷奶閹公豬40頭，平均體重為(7.68±0.56) kg，按體重相近原則隨機(jī)分為5組，分別為對照組(基礎(chǔ)飼糧)、模型組(基礎(chǔ)飼糧+5 g/kg BWD-半乳糖)、SOKG組(基礎(chǔ)飼糧+5 g/kg BWD-半乳糖+0.5%OKG)、MOKG組(基礎(chǔ)飼糧+5 g/kg BWD-半乳糖+1.0%OKG)和LOKG組(基礎(chǔ)飼糧+5 g/kg BWD-半乳糖+2.0%OKG)，每組8個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。試驗(yàn)期為28 d，試驗(yàn)結(jié)束后測定仔豬生長性能、臟器指數(shù)、腸道形態(tài)以及血清生化指標(biāo)?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)于湖南省永州市某豬場進(jìn)行。試驗(yàn)期間豬舍為全封閉式，屋頂以排氣扇通風(fēng)，漏縫塑料材質(zhì)底面，不銹鋼可調(diào)式料槽，乳頭式飲水器，不定期對豬舍進(jìn)行衛(wèi)生清潔以及消毒。試驗(yàn)豬按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)分組飼養(yǎng)，自由飲水和采食，采用粉料飼喂。

1.3 指標(biāo)測定及方法

1.3.1 生長性能

在試驗(yàn)期間，記錄每頭仔豬每天的采食量。在試驗(yàn)期的第1天和第28天對仔豬進(jìn)行空腹稱重。根據(jù)記錄的采食量和體重?cái)?shù)據(jù)，計(jì)算每只仔豬的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

ADG=(末重-初重)/試驗(yàn)天數(shù)；
ADFI=耗料量/試驗(yàn)天數(shù)；
F/G=ADFI/ADG。

1.3.2 臟器指數(shù)

仔豬飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，于豬舍內(nèi)禁食12 h，運(yùn)至屠宰地點(diǎn)，稱取體重，人工解剖取出內(nèi)臟，分別稱取肝臟、脾臟和腎臟的重量，最后按照公式[臟器指數(shù)(%)=(器官重量/體重)×100]計(jì)算臟器指數(shù)。

1.3.3 腸道形態(tài)

仔豬飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，取空腸、回腸腸段各約2 cm，于10%中性福爾馬林溶液中固定，再經(jīng)常規(guī)水洗、浸蠟、包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察，選取6個走向延伸良好的視野，用Magic Images Advanced 3.2軟件測量絨毛高度(villi height，VH)、絨毛寬度(villi width，VW)和隱窩深度(crypt depth，CD)，并計(jì)算出絨毛高度與隱窩深度的比值(V/C)。

1.3.4 血清生化指標(biāo)

仔豬飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，空腹采集前腔靜脈血液10 mL，3 000 r/min、4 ℃下離心10 min，分離血清后于-20 ℃凍存。采用全自動血液生化分析儀測定血清總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、尿素氮(urea nitrogen，UN)、葡萄糖(glucose，GLU)、血氨(blood ammonia，NH3L)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)和免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)含量以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先于Excel 2016軟件記錄，同時進(jìn)行歸納整理，接著采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析和Turkey多重比較檢驗(yàn)組間的差異顯著性，以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)值結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 OKG對由D-半乳糖導(dǎo)致的慢性氧化應(yīng)激仔豬生長性能的影響

由表2可知，模型組末重、ADG和ADFI與對照組相比顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)/G則顯著增加(P<0.05)。SOKG組末重、ADG與模型組相比顯著增加，F(xiàn)/G則顯著降低(P<0.05)；MOKG組F/G與模型組相比顯著降低(P<0.05)；LOKG組各生長性能指標(biāo)與模型組相比均沒有顯著變化(P>0.05)。

表2 OKG對由D-半乳糖導(dǎo)致的慢性氧化應(yīng)激仔豬生長性能的影響

2.2 OKG對由D-半乳糖導(dǎo)致的慢性氧化應(yīng)激仔豬臟器指數(shù)的影響

由圖1可知，各組肝臟指數(shù)無顯著差異(P>0.05)；對照組、模型組、SOKG組以及LOKG組間脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)無顯著差異(P>0.05)，但MOKG組脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)相較于對照組和模型組顯著升高(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。

2.3 OKG對由D-半乳糖導(dǎo)致的慢性氧化應(yīng)激仔豬腸道形態(tài)的影響

由圖2和表3可知，對照組空腸絨毛高度與模型組以及3個OKG組均沒有顯著差異(P>0.05)，但SOKG組空腸絨毛高度顯著高于模型組(P<0.05)；模型組和SOKG組空腸隱窩深度較對照組顯著降低(P<0.05)，MOKG組和LOKG組空腸隱窩深度則較對照組沒有顯著差異(P>0.05)；對照組空腸絨毛高度與隱窩深度的比值與模型組以及3個OKG組均沒有顯著差異(P>0.05)，但LOKG組空腸絨毛高度與隱窩深度的比值相較于MOKG組顯著升高(P<0.05)；模型組空腸絨毛寬度較對照組顯著降低(P<0.05)，3個OKG組的空腸絨毛寬度與對照組沒有顯著差異(P>0.05)。3個OKG組回腸絨毛高度顯著低于對照組(P<0.05)；3個OKG組回腸隱窩深度與對照組和模型組均沒有顯著差異(P>0.05)，但MOKG組和LOKG組回腸隱窩深度顯著低于SOKG組(P<0.05)；SOKG組回腸空腸絨毛高度和隱窩深度的比值顯著低于對照組(P<0.05)。

表3 OKG對由D-半乳糖導(dǎo)致的慢性氧化應(yīng)激仔豬腸道形態(tài)的影響

2.4 OKG對由D-半乳糖導(dǎo)致的慢性氧化應(yīng)激仔豬血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知，MOKG組血清TP含量與對照組相比顯著增加(P<0.05)；模型組血清ALP活性與對照組相比顯著降低(P<0.05)，而SOKG組血清ALP活性與模型組相比顯著增加(P<0.05)；MOKG組血清IgG含量與對照組相比顯著增加(P<0.05)；MOKG組和LOKG組血清IgM含量與對照組和模型組相比顯著增加(P<0.05)。

圖2 仔豬腸道形態(tài)

表4 OKG對由D-半乳糖導(dǎo)致的慢性氧化應(yīng)激仔豬血清生化指標(biāo)的影響

3 討 論

3.1 OKG對由D-半乳糖導(dǎo)致的慢性氧化應(yīng)激仔豬生長性能的影響

D-半乳糖是一種營養(yǎng)物質(zhì)和還原單糖，它與蛋白質(zhì)中的游離氨基酸反應(yīng)生成活性氧簇(ROS)，從而引起慢性氧化應(yīng)激[5]。而越來越多的證據(jù)表明，OKG在氧化應(yīng)激、燒傷、損傷和新陳代謝中具有正向的調(diào)節(jié)作用[9,17-19]。從體重結(jié)果上來看，模型組添加D-半乳糖后末重顯著降低，而在應(yīng)激狀態(tài)下添加0.5% OKG可以顯著逆轉(zhuǎn)末重的降低，這與我們之前的試驗(yàn)結(jié)果[16]一致，同時也與OKG對腫瘤大鼠[20]和D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠的作用相似[21]，說明OKG可以緩解仔豬因D-半乳糖造成的生長抑制。

3.2 OKG對由D-半乳糖導(dǎo)致的慢性氧化應(yīng)激仔豬臟器指數(shù)的影響

臟器指數(shù)是內(nèi)臟器官的相對重量，是反映臟器是否中毒以及臟器功能強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[22]。有研究表明，D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老型大鼠肝臟結(jié)構(gòu)遭到破壞，肝功能減退[23]；另外，D-半乳糖可導(dǎo)致小鼠慢性腎臟損傷[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，正常仔豬和D-半乳糖應(yīng)激仔豬肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)無顯著差異，說明D-半乳糖在仔豬上造成的應(yīng)激還不至于顯著損傷內(nèi)臟。在D-半乳糖應(yīng)激狀態(tài)下，飼糧中添加0.5%、1.0%和2.0%OKG對仔豬肝臟指數(shù)均無顯著影響，添加0.5%、2.0%OKG對仔豬脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)也無顯著影響，但添加1.0%OKG使得仔豬脾臟指數(shù)以及腎臟指數(shù)顯著升高，這與我們前期的研究得出的1.0%OKG可提高仔豬末重來緩解D-半乳糖所造成的慢性氧化應(yīng)激的結(jié)果[16]相符，這在一定程度上說明1.0%OKG可以促進(jìn)仔豬脾臟和腎臟的生長。

3.3 OKG對由D-半乳糖導(dǎo)致的慢性氧化應(yīng)激仔豬腸道形態(tài)的影響

營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)胃初步消化后，主要通過小腸消化吸收[24]，所以小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)可以直接反映動物機(jī)體的健康狀況以及對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收能力的強(qiáng)弱。小腸絨毛越高，隱窩越淺，絨毛高度與隱窩深度的比值越大，說明吸收面積越大，功能越好。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在D-半乳糖應(yīng)激狀態(tài)下，飼糧中添加0.5%OKG的仔豬空腸絨毛高度顯著提升，飼糧中添加1.0%和2.0%OKG的仔豬回腸隱窩深度降低。這在一定程度上說明OKG能夠改善應(yīng)激仔豬的腸道黏膜損傷，從而提高仔豬腸道在應(yīng)激狀態(tài)下的吸收功能。但飼糧中添加0.5%OKG的仔豬回腸絨毛高度與隱窩深度的比值顯著低于正常仔豬，加上在D-半乳糖應(yīng)激下的仔豬回腸絨毛高度與隱窩深度的比值低于正常仔豬，可能是因?yàn)閯┝坎蛔阋赃_(dá)到影響D-半乳糖導(dǎo)致慢性氧化應(yīng)激下仔豬的回腸的吸收功能，建議進(jìn)一步細(xì)化飼糧中OKG的添加量，研究其對D-半乳糖導(dǎo)致慢性氧化應(yīng)激仔豬回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。

3.4 OKG對由D-半乳糖導(dǎo)致的慢性氧化應(yīng)激仔豬血清生化指標(biāo)的影響

血清TP含量與豬的消化吸收以及免疫力有關(guān)；ALB是血漿中最主要的蛋白質(zhì)，用于維持機(jī)體營養(yǎng)與滲透壓；血清ALT活性可反映肝臟是否受到損害；血清AST活性可反映心臟和肝臟是否正常運(yùn)行，高AST活性與心肌梗死、干細(xì)胞損傷、肌營養(yǎng)不良以及皮肌炎有關(guān)；ALP參與脂肪代謝，其活性可反映機(jī)體生長性能；血清UN含量升高主要在于腎臟功能出現(xiàn)故障；血清GLU是機(jī)體能量的重要來源，為各種組織、臟器的正常運(yùn)作提供動力；血清IgG、IgM是機(jī)體抗感染免疫過程中重要物質(zhì)基礎(chǔ)；血清NH3L含量是反映機(jī)體肝臟功能的指標(biāo)。

研究表明AKG可促進(jìn)體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，誘導(dǎo)胰島素和生長激素的分泌[25]，而OKG相較于鳥氨酸和AKG的單獨(dú)添加，其能更有效地誘導(dǎo)胰島素和生長激素分泌[14]。另外，D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老型小鼠血清IgG、IgM含量降低[26]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加1.0%OKG可使應(yīng)激仔豬血清TP含量顯著高于正常仔豬，原因可能在于OKG在體內(nèi)分解為AKG，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。飼糧中添加0.5%OKG可使應(yīng)激仔豬血清ALP活性顯著增加，而D-半乳糖刺激仔豬血清ALP活性降低，ALP活性高低與機(jī)體生長性能相關(guān)，說明OKG可能通過促進(jìn)肝臟功能的發(fā)揮，進(jìn)而提高仔豬在應(yīng)激狀態(tài)下的生長性能。飼糧中添加1.0%OKG可使應(yīng)激仔豬血清IgG、IgM含量顯著增加，添加2.0%OKG可使應(yīng)激仔豬血清IgM含量顯著增加，D-半乳糖刺激仔豬血清IgG、IgM含量相較于正常仔豬有一定程度上的提升，原因可能在于，仔豬受到D-半乳糖刺激，機(jī)體免疫系統(tǒng)迅速產(chǎn)生免疫應(yīng)答，漿細(xì)胞分泌大量IgG和IgM進(jìn)行防御抵抗，而OKG可能改善腸道應(yīng)激損傷，促進(jìn)腸道營養(yǎng)吸收，機(jī)體產(chǎn)生的能量也就更多，進(jìn)而產(chǎn)生更多的IgG和IgM。建議開展后續(xù)試驗(yàn)，進(jìn)一步細(xì)化飼糧中OKG的添加量，以確定緩解仔豬慢性氧化應(yīng)激的最優(yōu)值。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加D-半乳糖顯著抑制仔豬生長，而添加0.5%OKG可以減輕D-半乳糖所造成的生長抑制。

② 飼糧中添加1.0%OKG可顯著增加慢性氧化應(yīng)激仔豬脾臟和腎臟的重量。

③ 飼糧中添加0.5%OKG可顯著提升慢性氧化應(yīng)激仔豬空腸絨毛高度，添加1.0%和2.0%OKG可降低回腸隱窩深度。

④ 飼糧中添加0.5%OKG可顯著增加慢性氧化應(yīng)激仔豬血清ALP活性，添加1.0%OKG可顯著增加血清TP、IgG、IgM含量，添加2.0%OKG可顯著增加血清IgM含量。

⑤ 綜合上述結(jié)果可知，OKG可以減輕D-半乳糖導(dǎo)致的仔豬生長抑制，通過促進(jìn)脾臟和腎臟生長，改善小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高血清TP、IgG和IgM含量與ALP活性，從而緩解D-半乳糖造成的仔豬慢性氧化應(yīng)激。同時，綜合各項(xiàng)指標(biāo)可以確定0.5%OKG對于緩解D-半乳糖導(dǎo)致的仔豬慢性氧化應(yīng)激具有較好的效果。