謝文文 劉振華 張得香 王修啟

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東省動(dòng)物營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州 510642)

腸上皮由大量重復(fù)的隱窩-絨毛軸單元組成，其更新和再生依賴于腸道干細(xì)胞(intestinal stem cell，ISC)持續(xù)的增殖和分化[1-2]。ISC位于隱窩基底部，受隱窩及其周邊細(xì)胞組成的生態(tài)位提供的包括表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)在內(nèi)的多種信號(hào)的調(diào)控[3-4]。此外，腸內(nèi)營養(yǎng)素，包括谷氨酸(glutamate，Glu)和谷氨酰胺(glutamine，Gln)等功能性營養(yǎng)素，也可通表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)加速ISC分裂，從而促進(jìn)腸上皮發(fā)育，改善腸道健康[5-7]。隨著類腸團(tuán)培養(yǎng)技術(shù)的建立，ISC生態(tài)位成分和功能被深入剖析。借助重組菌表達(dá)EGF等生長因子，可能為新型飼料添加劑的開發(fā)和畜禽生產(chǎn)效率的提升提供新思路。

1 EGF信號(hào)與ISC生態(tài)位

ISC生態(tài)位由隱窩中的潘氏細(xì)胞、鄰近隱窩的腸間質(zhì)細(xì)胞和上皮下成纖維細(xì)胞等組成[8]。這些細(xì)胞不僅在隱窩基底部產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)蛋白以固定ISC，而且通過提供EGF、Wnt、Notch和骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)等信號(hào)協(xié)同調(diào)節(jié)ISC的增殖和分化過程[9-11]。將ISC或含有干細(xì)胞的隱窩放在含有EGF、R-spondin 1(Wnt信號(hào)增強(qiáng)劑)和Noggin(BMP抑制劑)等生長因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)(模擬體內(nèi)ISC生態(tài)位)，或與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的條件下，均能形成具有類似腸上皮結(jié)構(gòu)的類腸團(tuán)[10]。ISC和潘氏細(xì)胞定植在類腸團(tuán)隱窩狀出芽頂部，而ISC的子細(xì)胞——短暫擴(kuò)增細(xì)胞(transient amplifying cell，TA細(xì)胞)則延伸匯入由腸吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞等組成的類似腸絨毛的中央空腔中[12-13]。

ISC生態(tài)位中EGF主要由潘氏細(xì)胞產(chǎn)生，此外，上皮下成纖維細(xì)胞衍生的胞外囊泡(extracellular vesicles，EV)也能傳遞EGF[14-15]。EGF通過與ISC膜上受體EGFR結(jié)合，激活其下游的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，從而刺激ISC增殖，抑制其凋亡[16-19]。

2 ISC生態(tài)位中EGF信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)

EGF對(duì)ISC的調(diào)控作用主要是通過與EGFR相互作用實(shí)現(xiàn)的[20]。當(dāng)EGF與跨膜EGFR的胞外區(qū)結(jié)合后，導(dǎo)致后者構(gòu)象改變，形成催化活性不對(duì)稱的受體二聚體[16,21-23]。此時(shí)，EGFR胞內(nèi)區(qū)C末端的3個(gè)酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，誘導(dǎo)受體酪氨酸激酶活化，從而使得耦聯(lián)酪氨酸磷酸化的接頭蛋白質(zhì)SHC(含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì))和生長因子受體結(jié)合蛋白質(zhì)2(growth factor receptor-bound protein 2，GRB2)在受體周圍聚集。隨后，一種雙特異性鳥苷酸交換因子(son of sevenless，SOS)與GRB2結(jié)合，激活錨定在膜上的小GTP結(jié)合蛋白(RAS)，進(jìn)而誘導(dǎo)絲/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase，RAF)活化；最終通過絲裂原活化蛋白激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)，促使其轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子ETS樣蛋白質(zhì)1(ETS-like 1 transcription factor，Elk-1)和原癌基因c-fos等轉(zhuǎn)錄因子的活化[24-28]，提高基因表達(dá)水平。同時(shí)，具有磷酸化酪氨酸殘基的EGFR可募集磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidy-linositol 3-kinases，PI3K)的調(diào)節(jié)亞基p85，直接激活PI3K的催化亞單位p110，或通過RAS與p110結(jié)合而使后者激活。被活化的p110磷酸化磷酸肌醇(inositol phosphate，PI)肌糖環(huán)上的D3位點(diǎn)，從而將底物磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate，PIP2)轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸(phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate，PIP3)[26,29]。PIP3作為第二信使，與3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide dependent kinase 1，PDK1)和蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)結(jié)合，促使PDK1磷酸化Akt蛋白308位的絲氨酸殘基位點(diǎn)，引起Akt的活化。被活化的Akt通過磷酸化作用抑制其下游靶蛋白——結(jié)節(jié)性硬化1/2(tuberous sclerosis 1/2，TSC1/2)和糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)等，從而激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)和Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路(圖1)，促進(jìn)ISC增殖分化[26-27,30]。

3 EGF信號(hào)調(diào)控ISC增殖和分化

EGF信號(hào)主要在隱窩區(qū)和TA細(xì)胞區(qū)中表達(dá)，其信號(hào)強(qiáng)度沿小腸隱窩絨毛軸向上衰減[31]。EGF信號(hào)促進(jìn)ISC有絲分裂，并通過調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)誘導(dǎo)ISC向潘氏細(xì)胞分化，而潘氏細(xì)胞又會(huì)分泌EGF促進(jìn)ISC自更新、增殖和分化，由此形成一種正反饋機(jī)制。研究表明，EGFR基因缺失或用其抑制劑Tyrphostin處理小鼠會(huì)顯著抑制ISC增殖和隱窩分裂[32]；相反，在應(yīng)激條件下，EGFR的激活有助于損傷后的ISC再生和隱窩分裂，從而加速傷口愈合和屏障功能重建[33-36]。體外試驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，阻斷類腸團(tuán)中的EGF信號(hào)會(huì)導(dǎo)致具有增殖分化活性的ISC進(jìn)入靜息狀態(tài)，類腸團(tuán)停止生長；一旦恢復(fù)EGF信號(hào)，ISC重新進(jìn)入增殖狀態(tài)，驅(qū)動(dòng)類腸團(tuán)形成隱窩樣芽狀結(jié)構(gòu)[27]。此外，EGF信號(hào)還能激活mTORC1，誘導(dǎo)吸收型細(xì)胞和分泌型細(xì)胞的終末成熟[37-38]。Chen等[39]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶應(yīng)激會(huì)激活促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(coforticotrophin-releasing factor，CRF)，促使ISC向未成熟杯狀細(xì)胞和腸吸收細(xì)胞分化，而斷奶后EGF的缺乏則抑制了杯狀細(xì)胞成熟因子的表達(dá)，導(dǎo)致杯狀細(xì)胞處于未成熟狀態(tài)。成熟的杯狀細(xì)胞可分泌三葉因子3(trefoil factor 3，TFF3)，其與膜上Nogo結(jié)合蛋白2(Nogo-interaction protein 2，LINGO2)結(jié)合，釋放EGFR，增強(qiáng)了EGF信號(hào)傳導(dǎo)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)ISC再生[40]。同樣，具有保護(hù)分化細(xì)胞穩(wěn)定作用的腸上皮細(xì)胞硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)耗竭會(huì)引起細(xì)胞死亡，這一過程會(huì)反饋調(diào)節(jié)EGF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)ISC的增殖和分化，以維持完整的腸上皮結(jié)構(gòu)[41]。Ye等[42]將間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)镮SC樣細(xì)胞，這些細(xì)胞再經(jīng)EGF誘導(dǎo)后可分化為腸上皮細(xì)胞，進(jìn)而緩解葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。

然而，不同情況下，EGFR介導(dǎo)下游信號(hào)不盡相同。Xiang等[43]在果蠅上的研究證實(shí)，PI3K/雷帕霉素靶蛋白(TOR)信號(hào)對(duì)于腸道穩(wěn)態(tài)是必需的，但是當(dāng)腸道上皮損傷后，EGFR/RAS/MEK信號(hào)會(huì)以一種獨(dú)立于PI3K/TOR信號(hào)的機(jī)制觸發(fā)果蠅ISC產(chǎn)生中間過渡型細(xì)胞(enteroblasts，EBs；哺乳動(dòng)物中又稱TA細(xì)胞)以及腸上皮細(xì)胞(enterocytes，ECs)，從而修復(fù)腸道損傷。Zhang等[44]進(jìn)一步揭示細(xì)胞分裂周期蛋白42(cell division control 42，Cdc42)與EGFR結(jié)合是EGF刺激受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用所必需的，并且能促進(jìn)MEK下游的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在小鼠ISC中高表達(dá)Cdc42變異體2能促進(jìn)損傷后的腸道再生，提示上調(diào)Cdc42/EGFR/MAPK信號(hào)能夠啟動(dòng)對(duì)腸上皮的保護(hù)性應(yīng)答。而在小鼠急性炎癥過程中，ISC中PI3K/Akt信號(hào)下調(diào)導(dǎo)致β-catenin水平降低，隱窩細(xì)胞增殖受限[45]。這些結(jié)果說明，應(yīng)激狀態(tài)下會(huì)存在不同的EGF信號(hào)應(yīng)答機(jī)制以驅(qū)動(dòng)ISC有絲分裂。

EGF：表皮生長因子 epidermal growth factor；EGFR：表皮生長因子受體 epidermal growth factor receptor；GRB2：生長因子受體結(jié)合蛋白質(zhì)2 growth factor receptor-bound protein 2；SOS：鳥苷酸交換因子 son of sevenless；RAS：小GTP結(jié)合蛋白 small GTP binding protein；RAF：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 serine/threonine protein kinase；MEK：絲裂原活化蛋白激酶的激酶 mitogen-activated protein kinase kinase；ERK1/2：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2 extracellular regulated protein kinases 1/2；Elk1：轉(zhuǎn)錄激活因子ETS樣蛋白質(zhì)1 ETS-like 1 transcription factor；c-fos：原癌基因c-fos；p85：PI3K的調(diào)節(jié)亞基 regulatory subunit of PI3K；p110：PI3K的催化亞基 catalytic subunit of PI3K；PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶 phosphatidy-linositol 3-kinases；PIP2：磷脂酰肌醇4,5-二磷酸 phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate；PIP3：磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸 phosphatidylinositol(3,4,5)-trisphosphate；PDK1：3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1 3-phosphoinositide dependent kinase 1；Akt：蛋白激酶B protein kinase B；TSC1/2：結(jié)節(jié)性硬化1/2 tuberous sclerosis 1/2；GSK3β：糖原合酶激酶 3β glycogen synthase kinase 3β；mTORC1：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1 mammalian target of rapamycin complex 1；β-catenin：β-連環(huán)蛋白；+4 cell：+4位干細(xì)胞；Paneth cell：潘氏細(xì)胞；crypt base columnar cell：隱窩基部柱狀細(xì)胞；transit amplifying cell：短暫擴(kuò)增細(xì)胞；goblet cell：杯狀細(xì)胞；myofibroblast：肌成纖維細(xì)胞；Noggin：BMP抑制劑 BMP inhibitor。箭頭表示激活，圓點(diǎn)表示抑制 the arrow indicates activation and the dot indicates inhibition。

4 EGF信號(hào)調(diào)節(jié)腸上皮結(jié)構(gòu)和功能完整性

4.1 EGF促進(jìn)腸上皮發(fā)育

EGF能促進(jìn)腸細(xì)胞增殖分化，改善腸道結(jié)構(gòu)。研究表明，飼糧中添加200 μg/kg EGF，14 d時(shí)能顯著提高斷奶仔豬小腸中段絨毛高度和隱窩深度[46-47]。Cheung等[48]給19～21日齡斷奶小鼠連續(xù)灌胃50 μg/kg BW的EGF 9 d，發(fā)現(xiàn)不僅十二指腸、空腸和回腸絨毛高度顯著增加，而且增殖細(xì)胞標(biāo)志物——增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)陽性細(xì)胞比例明顯上升。Wang等[49-50]同樣發(fā)現(xiàn)，21日齡斷奶仔豬連續(xù)采食含60 μg/kg BW EGF的飼糧21 d或在大鼠飲食中添加50 g/kg BW的EGF 15 d，均顯著增加了小腸總蛋白、DNA和RNA含量，促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的增殖。EGF還可通過“母子一體化”促進(jìn)胎兒腸道發(fā)育。Cellini等[51]在母兔妊娠期的第24天，利用微滲透泵連續(xù)7 d往羊膜注入300 μg/kg EGF，發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)發(fā)育遲緩胎兒的小腸絨毛高度和5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)陽性小腸隱窩細(xì)胞均接近正常胎兒的水平。此外，飼糧中添加200 μg/kg BW的EGF還能增加斷奶仔豬小腸杯狀細(xì)胞數(shù)和內(nèi)分泌細(xì)胞數(shù)量，提高溶菌酶mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，提示EGF促進(jìn)ISC向分泌型腸細(xì)胞分化[52]。

EGF主要通過提高消化酶的活性及營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腸上皮對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。大量研究表明，EGF能增強(qiáng)仔豬小腸(尤其是空腸)乳糖酶、蔗糖酶、麥芽糖酶、堿性磷酸酶的mRNA表達(dá)[53-55]。同時(shí)，EGF還能促進(jìn)腸上皮細(xì)胞對(duì)葡萄糖和氨基酸的吸收。Xu等[56]和王定越[57]研究表明，灌服1.8 μg/mL的EGF 100 mL顯著提高了仔豬小腸鈉/葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(sodium/glucose cotransporter 1，SGLT1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(glucose transporter 2，GLUT2)和寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(peptide transporter 1，PEPT1)的表達(dá)。黃騫等[58]用100 μg/L EGF處理Caco-2細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)腸腔內(nèi)Gln、丙氨酸(alanine，Ala)、絲氨酸(serine，Ser)和半胱氨酸(cysteine，Cys)等中性氨基酸的Na+-依賴性中性氨基酸載體丙氨酸-絲氨酸-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體2(alanine-serine-cysteine transporter 2，ASCT2)的mRNA表達(dá)水平、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平和轉(zhuǎn)運(yùn)活性均顯著提高(表1)。

續(xù)表1項(xiàng)目Items劑量和處理時(shí)間Dosage and treatment time主要作用和功能Main role and functionCaco-2細(xì)胞Caco-2 cells100 μg/L EGF(8 h)轉(zhuǎn)運(yùn)腸腔內(nèi)谷氨酰胺、丙氨酸、絲氨酸和半胱氨酸等中性氨基酸的Na+-依賴性中性氨基酸載體丙氨酸-絲氨酸-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體2(ASCT2)的mRNA表達(dá)水平、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平和轉(zhuǎn)運(yùn)活性均顯著提高[57]

EGF具有增強(qiáng)腸道屏障的功能。EGF不僅能通過促進(jìn)杯狀細(xì)胞成熟、分泌黏蛋白形成化學(xué)屏障、誘導(dǎo)潘氏細(xì)胞生成、分泌防御素和抗菌肽等形成免疫屏障，還能提高腸上皮緊密連接蛋白的表達(dá)，建立完善的物理屏障[59-61]。研究表明，EGF能上調(diào)結(jié)腸炎大鼠回腸中封閉蛋白-3(claudin-3)和咬合蛋白(occludin)的蛋白表達(dá)[62]。同時(shí)，EGF體外預(yù)處理Caco-2細(xì)胞可通過提高occludin、閉合小環(huán)蛋白-1(zonula occludens protein-1，ZO-1)、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)和β-catenin的表達(dá)和分布，逆轉(zhuǎn)乙醛引起的單層細(xì)胞跨膜電阻值降低和菊糖通透性增加，且該過程依賴ERK1/2的活性，而不依賴于MAPK的活性[63]。

4.2 EGFR整合氨基酸信號(hào)促進(jìn)隱窩-絨毛軸更新

腸腔中的營養(yǎng)素與腸細(xì)胞密切接觸，并通過EGF信號(hào)調(diào)節(jié)ISC功能，維持腸上皮的完整性[64]。Glu及與Glu代謝有關(guān)的Gln被認(rèn)為是小腸黏膜的主要能量來源，研究表明，飼糧來源98%的Glu和66%的Gln在腸道被分解代謝。它們不僅為黏膜提供能量，也是細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸物質(zhì)等合成的前體和促進(jìn)劑，對(duì)維持黏膜的正常形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用[65]。Glu缺乏顯著抑制腸上皮細(xì)胞增殖和腸上皮發(fā)育。Deng等[66]發(fā)現(xiàn)，在果蠅飼糧中添加Glu可提高ISC活性。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，胞外Glu通過EGFR/MEK/ERK和胰島素受體(IR)/PI3K/Akt通路激活mTORC1信號(hào)，增加仔豬ISC活性，促進(jìn)隱窩-絨毛軸更新[5,67]。雖然，分子對(duì)接預(yù)測EGFR可能是胞外Glu的潛在感應(yīng)體，然而Glu如何激活EGFR還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。與Glu作用類似，在培養(yǎng)基中加入Gln能激活mTORC1信號(hào)通路，促進(jìn)類腸團(tuán)出芽，而Gln缺乏會(huì)導(dǎo)致類腸團(tuán)萎縮，增殖細(xì)胞數(shù)量減少[68]。Momcilovic等[69]研究發(fā)現(xiàn)，Gln通過EGFR依賴的方式防止乙醛誘導(dǎo)的小鼠腸道損傷，該過程需要EGFR的胞外配體結(jié)合域，然而Gln與EGFR的結(jié)合同樣需要進(jìn)一步證實(shí)。

5 小結(jié)與展望

EGF信號(hào)是ISC生態(tài)位網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，其通過調(diào)控ISC增殖和分化驅(qū)動(dòng)腸上皮細(xì)胞更新和再生。外源供給EGF或靶向EGF信號(hào)的營養(yǎng)素可能是調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道健康的一個(gè)新策略。然而，目前對(duì)EGF信號(hào)的研究多集中在細(xì)胞水平及果蠅和小鼠等少數(shù)幾種模式生物上。在家畜，尤其是家禽上的研究較少，而且各生長因子和營養(yǎng)素缺少精準(zhǔn)的劑量學(xué)和互作效應(yīng)的研究，EGF信號(hào)如何整合所有信息，并將信息有序傳遞至各細(xì)胞器尚不清楚。因此，如何將現(xiàn)有的研究成果應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)以及醫(yī)療和保健仍需進(jìn)一步探討。借助類腸團(tuán)，并結(jié)合成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)/成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白9(Cas9)基因編輯、微流控和顯微注射等技術(shù)，充分解析EGF信號(hào)及其與其他信號(hào)協(xié)同調(diào)控ISC增殖和分化的機(jī)制，將有助于構(gòu)建基于EGF信號(hào)的傳導(dǎo)體系，或是逐步實(shí)現(xiàn)其應(yīng)用的前景。