李海枝,王曙賓,郭珊珊,于有強(qiáng),劉義鳳,潘聰,吳逸民,周志橋,夏凱*,李雅麗*

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京,100015)2(功能主食創(chuàng)制與慢病營(yíng)養(yǎng)干預(yù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,100015)3(漢義生物科技(北京)有限公司,北京,100020)

氧化應(yīng)激一般是指細(xì)胞暴露于高濃度氧分子或氧的化學(xué)衍生物而引起的細(xì)胞損傷[1]。此時(shí)氧自由基通過(guò)與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)以及DNA等生物大分子相互作用,引發(fā)DNA片段斷裂、蛋白質(zhì)功能缺陷以及各種毒性物聚集,同時(shí)使機(jī)體的氧化防御系統(tǒng)出現(xiàn)變化,最終導(dǎo)致如糖尿病、炎癥以及癌癥等疾病的發(fā)生[2-3]。因此,建立氧化應(yīng)激模型對(duì)研究以及篩選抗氧化藥物以及功能性食品都至關(guān)重要[4-6]?，F(xiàn)階段,利用H2O2建立氧化應(yīng)激模型最為廣泛[7-9]。而偶氮二異丁基二鹽酸鹽(azodiisobutyl decarbonate,AAPH)是一種小分子偶氮引發(fā)劑,也可誘導(dǎo)過(guò)氧自由基的生成,進(jìn)而應(yīng)用于氧化應(yīng)激模型的構(gòu)建[10-11]。

火麻仁是一種優(yōu)良的膳食性蛋白質(zhì)來(lái)源[12-13],其主要是以麻仁球蛋白和麻仁白蛋白的形式存在。麻仁蛋白中不含有寡聚糖、胰蛋白酶抑制劑等抗?fàn)I養(yǎng)因子,不會(huì)造成蛋白質(zhì)吸收障礙、反胃等不適癥狀,因此火麻仁蛋白是良好的易消化蛋白的來(lái)源。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)火麻仁具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血栓、改善記憶以及抗疲勞等作用,其火麻仁油以及提取物均具有抗氧化和抗衰老的作用[14-17]。因此,利用火麻仁蛋白開(kāi)發(fā)研究食品、藥品、保健產(chǎn)品將具有很廣闊的發(fā)展前景。

本研究為提高火麻仁蛋白的吸收特性以及風(fēng)味,對(duì)火麻仁蛋白進(jìn)行發(fā)酵,之后利用AAPH誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型探究發(fā)酵火麻仁蛋白粉的抗氧化能力,旨在從細(xì)胞活力、細(xì)胞形態(tài)、抗氧化酶活力以及胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平等方面綜合評(píng)價(jià)該物質(zhì),從而為火麻仁功能性食品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HepG2細(xì)胞,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；火麻仁蛋白粉,遼寧俏牌生物科技有限公司；DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS),中科邁晨科技有限公司；新生牛血清,美國(guó)Gibco；AAPH,Sigma公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒、2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)、胰蛋白酶、RIPA裂解液,碧云天生物技術(shù)研究所；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒,南京建成生物工程研究所；TransZol Up裂解液、RNA提取試劑盒,北京全式金生物。

1.2 儀器與設(shè)備

生物安全柜,濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；CO2培養(yǎng)箱,松下公司；CKX41型倒置生物顯微鏡,奧林巴斯公司；分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司；Spectra Max酶標(biāo)儀(i3),MD公司；手持細(xì)胞計(jì)數(shù)器,密理博中國(guó)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵火麻仁蛋白粉制備工藝[18-19]

得到的發(fā)酵火麻仁蛋白粉用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 發(fā)酵火麻仁蛋白粉蛋白質(zhì)含量測(cè)定

參照GB/T 23530—2009《酵母抽提物》進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 HepG2細(xì)胞的體外培養(yǎng)

HepG2為貼壁細(xì)胞,可將其培養(yǎng)于含有10%新生牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中溫育,取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型構(gòu)建[20]

1.3.4.1 AAPH的CCK-8細(xì)胞毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)

取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加100 μL細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度為1.5×105個(gè)/mL,37 ℃培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液,用PBS清洗1次,每孔加入100、200、400、600、800 μmol/L等5個(gè)不同濃度的AAPH 100 μL,以無(wú)AAPH的相同培養(yǎng)基孵育細(xì)胞為對(duì)照,培養(yǎng)24 h后每孔加CCK-8溶液于37 ℃避光孵育2 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。

1.3.4.2 氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的構(gòu)建

選取對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)顯著影響的AAPH濃度誘導(dǎo)氧化應(yīng)激細(xì)胞模型,各組細(xì)胞加樣處理24 h后,小心棄去培養(yǎng)液,用PBS清洗,加入25 μmol/L的DCFH-DA,避光條件下作用30 min,吸出DCFH-DA用PBS清洗,后加入200 μL的PBS。用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞在490 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光下熒光物質(zhì)2′,7′-二氯熒光素(2′,7′-Dichlorofluorescein，DCF)在535 nm波長(zhǎng)下的發(fā)射光。

1.3.5 發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的預(yù)保護(hù)作用

分別選取10、30、50、100、200 μg/mL等5個(gè)不同濃度的發(fā)酵火麻仁蛋白粉樣品研究其對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響,實(shí)驗(yàn)方法同1.3.4.1。

在建立的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上觀察發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞產(chǎn)生的預(yù)保護(hù)作用。

將細(xì)胞以2×105個(gè)/mL濃度接種于6孔板,待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后,用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞,加入不同的處理液。對(duì)照組為無(wú)酚紅的純培養(yǎng)基；模型組為添加AAPH組；試驗(yàn)組為將AAPH與發(fā)酵火麻仁蛋白粉溶液混合(發(fā)酵火麻仁蛋白粉終質(zhì)量濃度10～30 mg/mL)。細(xì)胞上樣后37 ℃孵育24 h,測(cè)定各組的SOD、ROS、MDA、GSH-Px。SOD、MDA、GSH-Px測(cè)定方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)[23-24]；ROS測(cè)定方法同1.3.4.2。

1.3.6 發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)HepG2細(xì)胞抗氧化相關(guān)基因的影響

細(xì)胞處理過(guò)程同1.3.4.2。清洗樣品處理后的細(xì)胞,每10 cm2生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞中加入1 mL的TransZol Up,采用全式金總RNA提取試劑盒提取,得到細(xì)胞總RNA后,根據(jù)試劑盒配制體系。

基因定量分析采用全式金TransScript Probe One-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒。PCR反應(yīng)條件為：45 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s,94 ℃ 5 s；60 ℃ 1 min,循環(huán)40次；PCR擴(kuò)增完畢后,對(duì)其進(jìn)行半定量分析。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

采用2-△△CT計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)量,具體如下：

△CT=△CT(目的基因)-△CT(內(nèi)參基因)；

△△CT=△CT(待測(cè)樣本)-△CT(校準(zhǔn)樣本)；

相對(duì)表達(dá)量=2-△△CT

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵火麻仁蛋白粉蛋白質(zhì)含量

根據(jù)國(guó)標(biāo)法檢測(cè)得到發(fā)酵火麻仁蛋白粉蛋白質(zhì)含量為79%。

2.2 HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型

2.2.1 AAPH對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

如圖1所示,由于AAPH對(duì)細(xì)胞具有一定的損傷作用,隨著AAPH濃度的增加,細(xì)胞存活率逐漸下降。當(dāng)AAPH濃度達(dá)到800 μmol/L時(shí)顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)(P<0.05),因此選擇AAPH濃度100～600 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同AAPH濃度對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響

2.2.2 AAPH對(duì)HepG2細(xì)胞ROS的影響

細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS會(huì)損害細(xì)胞,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)還原氧化穩(wěn)態(tài)的改變,發(fā)生氧化應(yīng)激現(xiàn)象,進(jìn)而對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷[21-22]。因此,細(xì)胞內(nèi)ROS可以直接反映細(xì)胞氧化損傷的程度。各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)處理后所檢測(cè)到的細(xì)胞內(nèi)ROS水平如圖2所示。處理24 h后,AAPH濃度越高ROS含量也越高,在800 μmol/L時(shí)同對(duì)照相比,差異顯著(P<0.05)。結(jié)合AAPH對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響,AAPH造模濃度最終選擇600 μmol/L。

圖2 不同AAPH濃度對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

2.3 發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)模型細(xì)胞抗氧化活性的影響

2.3.1 發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

圖3為發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)HepG2細(xì)胞毒性的影響,在質(zhì)量濃度為10～30 mg/mL時(shí),發(fā)酵火麻仁蛋白均不影響HepG2細(xì)胞的活力。因此,可選取10～30 μg/mL中的任意濃度用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?？紤]到發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的調(diào)節(jié)作用可能與劑量有關(guān),因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)各組均選擇低劑量(10 mg/mL)、中劑量(20 mg/mL)和高劑量(30 mg/mL)3種濃度。

圖3 不同濃度發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響

2.3.2 發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)HepG2細(xì)胞ROS的影響

各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)處理后所檢測(cè)到的細(xì)胞內(nèi)ROS水平如圖4所示。與對(duì)照組相比,模型組胞內(nèi)熒光值顯著升高(P<0.05),約為對(duì)照組的1.25倍。說(shuō)明AAPH可有效提高胞內(nèi)ROS水平。與模型組相比,發(fā)酵火麻仁蛋白粉組細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著降低,且隨著濃度的增加,細(xì)胞內(nèi)ROS含量也逐漸下降,表明發(fā)酵火麻仁蛋白粉能顯著降低胞內(nèi)ROS水平(P<0.05)。

圖4 發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

2.3.3 發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)HepG2細(xì)胞SOD的影響

SOD是機(jī)體抗氧化的主要酶類之一,SOD活力也是判定化合物抗氧化能力的指標(biāo)之一[23]。由圖5可知,HepG2細(xì)胞在經(jīng)AAPH作用后,細(xì)胞內(nèi)SOD活力顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。與模型組細(xì)胞相比,發(fā)酵火麻仁蛋白粉能夠顯著提高SOD活力,這說(shuō)明AAPH的造模液能降低HepG2細(xì)胞SOD活力,使細(xì)胞清除自由基能力下降,最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷；而發(fā)酵火麻仁蛋白粉能夠顯著提高模型細(xì)胞SOD的活力,對(duì)維持機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的氧化和抗氧化平衡非常重要,可清除氧自由基,減輕組織細(xì)胞的過(guò)氧化損傷,且數(shù)據(jù)表明,發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)提高SOD活力具有濃度依賴性。

圖5 發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)SOD的影響

2.3.4 發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)HepG2細(xì)胞MDA的影響

當(dāng)機(jī)體受到有害刺激或抵御惡劣環(huán)境時(shí)所產(chǎn)生的ROS攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸,從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。因而,細(xì)胞內(nèi)MDA含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度,進(jìn)而間接反映細(xì)胞氧化損傷程度[24],發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)模型細(xì)胞中MDA含量的影響如圖6所示。與對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞內(nèi)MDA的含量顯著升高(P<0.05),表明模型組細(xì)胞產(chǎn)生大量的MDA。與模型組相比,樣品組細(xì)胞內(nèi)MDA的含量顯著下降,說(shuō)明發(fā)酵火麻仁蛋白粉能夠保護(hù)細(xì)胞抵御氧化損傷。

圖6 發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)MDA的影響

2.3.5 發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)HepG2細(xì)胞GSH-Px的影響

GSH-Px活力能間接反映機(jī)體的氧化應(yīng)激水平,同時(shí)也可以判斷化合物的抗氧化能力。發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)氧化應(yīng)激HepG2細(xì)胞中GSH-Px活力的影響如圖7所示。與對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞內(nèi)GSH-Px的活力顯著下降(P<0.05),說(shuō)明AAPH降低細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活力,致使細(xì)胞的抗氧化能力下降,甚至導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷。樣品組在質(zhì)量濃度為20和30 mg/mL時(shí)細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活力顯著高于模型組,說(shuō)明發(fā)酵火麻仁蛋白粉能夠通過(guò)提高GSH-Px活力保護(hù)HepG2細(xì)胞抵御氧化損傷。

圖7 不同濃度發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH-Px的影響

2.4 氧化應(yīng)激相關(guān)mRNA的表達(dá)情況

研究表明,機(jī)體內(nèi)氧化還原水平失衡是眾多疾病的病理生理基礎(chǔ),因此內(nèi)源性抗氧化信號(hào)通路Keap1-Nrf2在研究機(jī)體應(yīng)對(duì)各種外來(lái)?yè)p傷的防御中起著非常重要的作用[25-26]。Nrf2是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,通過(guò)與ARE結(jié)合調(diào)節(jié)多種抗氧化基因的表達(dá),抵抗氧化應(yīng)激從而對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。Nrf2-ARE通路的下游抗氧化酶包括HO-1、NQO1等,動(dòng)物及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均證實(shí),提高Nrf2-ARE通路活性,增加HO-1的表達(dá),可清除氧化物質(zhì),對(duì)抗氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷[27]。圖8為發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)HepG2細(xì)胞中Nrf2、HO-1以及NQO1的mRNA表達(dá)量的影響。與正常組相比,模型組的Nrf2、HO-1以及NQO1的mRNA均顯著降低,樣品組劑量依賴性顯著增高Nrf2、HO-1以及NQO1的mRNA表達(dá)量,說(shuō)明發(fā)酵火麻仁蛋白粉能夠激活Nrf2通路達(dá)到抗氧化效果。

圖8 發(fā)酵火麻仁蛋白粉對(duì)HepG2細(xì)胞中Nrf2,HO-1以及NQO1 mRNA表達(dá)量的影響

3 結(jié)論

本研究在利用AAPH誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞損傷模型中證實(shí),發(fā)酵火麻仁蛋白粉能夠通過(guò)增加SOD、GSH-Px的活力,降低胞內(nèi)ROS、MDA水平進(jìn)而改善細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài),且與發(fā)酵火麻仁蛋白粉濃度呈現(xiàn)出很好的相關(guān)性,具有很強(qiáng)的抗氧化作用。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了發(fā)酵火麻仁蛋白粉抗氧化酶基因的表達(dá),證明了發(fā)酵火麻仁蛋白粉能夠激活Nrf2通路進(jìn)而減輕AAPH誘導(dǎo)的HepG2氧化應(yīng)激損傷作用。

本研究在細(xì)胞層次對(duì)發(fā)酵火麻仁蛋白粉進(jìn)行探究,證實(shí)了其是一種優(yōu)良的抗氧化物質(zhì),為研究預(yù)防與抗氧化相關(guān)疾病的功能性食品提供理論基礎(chǔ),同時(shí)也為火麻仁蛋白的開(kāi)發(fā)利用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。