張翼麟,謝勇,易川虎,劉雄,*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715) 2(食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心(西南大學(xué)),重慶,400715)3(昌都君親農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司,西藏 昌都,854000)

代謝綜合征是一組代謝紊亂癥候群,包括高血糖、肥胖、II型糖尿病等。近年來,全球肥胖人數(shù)呈指數(shù)級增長,代謝綜合征也在全球范圍內(nèi)越來越流行[1-2],通過調(diào)節(jié)飲食來預(yù)防相關(guān)疾病已經(jīng)逐漸成為一種重要的方法。全谷物(whole grain,WG)食物能通過其中各種生物活性成分的協(xié)同作用[3],如膳食纖維、抗性淀粉、多酚、植物甾醇、維生素和礦物質(zhì)等,降低餐后血糖反應(yīng)[4]、調(diào)節(jié)腸道菌群[2],從而起到調(diào)節(jié)血糖[5]、預(yù)防肥胖[6]和II型糖尿病[7]等作用。

青稞(HordeumvulgareL.)又稱裸大麥,是青藏高原地區(qū)的主要農(nóng)作物之一。青稞富含膳食纖維,特別是其中的β-葡聚糖(beta-glucan,BG)含量在3.66%～8.62%,是世界上β-葡聚糖含量最高的谷類作物[8]。大量研究表明,β-葡聚糖能通過增加消化體系黏度[9]以及降低α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶酶活性[10]等方式抑制淀粉的消化,從而降低餐后血糖濃度,實現(xiàn)降血糖功效。也有研究表明,食物的結(jié)構(gòu)特征在淀粉消化和血糖反應(yīng)中也起著重要的作用,破壞食物結(jié)構(gòu)的完整性可能會增加淀粉消化速率[11]、降低其各項生理功效[12]。然而,β-葡聚糖特性和全谷物結(jié)構(gòu)在調(diào)節(jié)血糖生理活性中誰占主導(dǎo)作用尚不清楚。因此,本文通過分析青稞全粉中β-葡聚糖對淀粉消化的影響,并探究其體外降血糖功效潛在機(jī)理,為青稞的加工提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞全粉(hull-less barley,HB),將青稞粉碎過100目篩；高峰α-淀粉酶、α-淀粉酶、胰酶、胃蛋白酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、異硫氰酸熒光素、熒光增白劑,美國Sigma公司；交聯(lián)β-葡聚糖含量試劑盒,愛爾蘭Megazyme公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-6D數(shù)顯恒溫水浴磁力攪拌鍋,惠州市宏業(yè)儀器有限公司；AXTG16G臺式高速離心機(jī),鹽城市安信實驗儀器有限公司；UV-2450紫外分光光度計,日本島津公司；Mastersizer 2000激光粒度分析儀,英國Malvern公司；TCW-3快速黏度糊化儀,澳大利亞 Newport Science Corp 公司；Phenom Pro-17A00403掃描電鏡,荷蘭Phenom World公司；LSM780激光共聚焦顯微鏡,德國Zeiss公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 青稞全粉體外消化

將樣品分為5組,試驗設(shè)計如表1所示。為探究β-葡聚糖在青稞全粉中對淀粉體外消化影響的機(jī)理,以去掉纖維素的實驗組作為對比。加入酶后于50 ℃水浴中反應(yīng)30 min,經(jīng)離心去上清液并補入4 mL緩沖液后,用0.2 mL 2 mol/L HCl溶液調(diào)pH至1.2,沸水浴5 min糊化,冷卻至室溫。體外模擬消化在MINEKUS等[13]的方法基礎(chǔ)上加以修改。加入3 mL模擬人工胃液,30 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液,1 mL 29.5 mg/mL胃蛋白酶,于37 ℃消化30 min,隨后加入0.5 mL 1 mol/L NaHCO3溶液終止反應(yīng)并調(diào)pH至6.8；加入3 mL模擬人工腸液,80 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液,1 mL 12.4 mg/mL胰蛋白酶,于37 ℃消化120 min。消化全過程使用轉(zhuǎn)子勻速攪拌,第5組在胃消化時用滅活的胃蛋白酶液代替胃蛋白酶液。

表1 青稞全粉體外消化及影響因素分析

在模擬腸消化階段的30、60、90、120 min時各取0.1 mL清液,沸水浴滅酶,用葡萄糖氧化酶(glucose oxidase-peroxidase,GOPOD)試劑測定葡萄糖含量,結(jié)果用葡萄糖生成量表示,如公式(1)所示：

(1)

式中：ΔA,樣品吸光度-空白吸光度；VF,終體積,mL；ΔA標(biāo),100 μg葡萄糖標(biāo)品吸光度-空白吸光度。

1.3.2 青稞淀粉體外水解

青稞β-葡聚糖、淀粉和蛋白質(zhì)的提取分別參照KUREK等[14]、CAO等[15]和楊希娟等[16]的方法。

取5根離心管,分別加入0、15、35 mg青稞β-葡聚糖和15、35 mg青稞蛋白,再于每支心管中加入100 mg青稞淀粉；加入4 mL模擬胰液,沸水浴糊化10 min,冷卻至室溫后再加入1 mL 10 mg/mL α-淀粉酶,于37 ℃下水解,在反應(yīng)10、30、60、90 min分別取0.1 mL清液,用GOPOD試劑測定葡萄糖含量,結(jié)果用淀粉水解率表示：

(2)

式中：ΔA,樣品吸光度-空白吸光度；VF,終體積,mL；ΔA標(biāo),100 μg葡萄糖標(biāo)品吸光度-空白吸光度；0.9,葡萄糖轉(zhuǎn)換為淀粉的轉(zhuǎn)換系數(shù)；m,樣品質(zhì)量,mg。

1.3.3 青稞β-葡聚糖的含量

將樣品分為青稞全粉組、全粉去除蛋白組和全粉去除淀粉及蛋白組,各組稱取100 mg 青稞于離心管,實驗組再通過預(yù)處理除去蛋白或淀粉：加入1 mL 1 mg/mL高峰α-淀粉酶,調(diào)pH至7.0,于90 ℃下反應(yīng)15 min；加入1 mL 1 mg/mL胃蛋白酶,調(diào)pH至4.0,于40 ℃下反應(yīng)15 min。酶解處理完成后,加入7 mL 體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇,沸水浴5 min,加入轉(zhuǎn)子攪拌,4 000 r/min離心10 min,棄上清液,再加入7 mL 95%乙醇離心,重復(fù)3次即完成預(yù)處理。β-葡聚糖的測定方法參照Megazyme公司交聯(lián)β-葡聚糖試劑盒說明書。

1.3.4 青稞的微觀結(jié)構(gòu)

將青稞顆粒浸泡于水中12 h,用薄刀片將其切成厚度為5 μm的薄片,凍干備用。染色參考LANGENAEKE等[17]的方法并加以修改,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%的熒光增白劑(calcofluor white M2R,CWM2R)分別染色10 min,并用蒸餾水清洗3次,完成后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。另外,用掃描電鏡觀察凍干切片和過篩后青稞粉的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.5 青稞全粉粒徑測定

將樣品分為青稞全粉組、全粉去β-葡聚糖組和全粉去蛋白組,各稱取500 mg HB,用30 mL去離子水稀釋。去β-葡聚糖組、去蛋白組分別添加30 mg β-葡聚糖酶、胃蛋白酶,于室溫下酶解1 h。用激光粒度儀Mastersizer 2000測定其粒徑分布,參數(shù)設(shè)置為：分散劑為水,樣品折射率1.520,遮光度為(12±1)%。結(jié)果中平均粒徑用體積平均徑D[4,3]表征。

1.3.6 青稞全粉及淀粉糊化特性分析

糊化特性用快速黏度分析儀測定,根據(jù)文獻(xiàn)[18]并稍做修改。將樣品分為青稞全粉組、全粉去β-葡聚糖組、全粉去蛋白組、青稞淀粉組、青稞淀粉加β-葡聚糖組、青稞淀粉加蛋白組。青稞全粉的3組各稱4.0 g青稞全粉,青稞淀粉的3組各稱3.0 g青稞淀粉于樣品鋁盒,再加入一定量的水,添加量由儀器系統(tǒng)計算,并攪拌均勻。在160 r/min攪拌下測定糊化特性,測定程序如下：在50 ℃下加熱1 min,4.5 min內(nèi)均勻升溫到95 ℃,在95 ℃下加熱2 min,隨后又在4.5 min內(nèi)均勻降溫至50 ℃,在50 ℃保持2 min。記錄結(jié)果中樣品的峰值黏度、谷值黏度、終值黏度、回生值、糊化溫度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010軟件、SPSS 21.0軟件及Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞全粉的體外消化

如圖1所示,相比于未處理的青稞全粉,除去纖維素和β-葡聚糖都能提高淀粉的消化率。在60 min之前,除去纖維素比除去β-葡聚糖的促消化作用更強(qiáng),而60 min之后,除去β-葡聚糖的青稞粉中淀粉消化速率呈現(xiàn)急劇上升的趨勢。由此可知,在青稞全粉內(nèi),淀粉的消化前期主要受纖維素的影響,后期則受β-葡聚糖影響更大。這可能是因為水解掉纖維素后,細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)受到較大程度的破壞,增加了淀粉與酶的接觸面積[19],從而加快了淀粉的消化。而細(xì)胞壁中網(wǎng)狀β-葡聚糖結(jié)構(gòu)的包裹作用仍然存在,所以淀粉的釋放速度較為均勻；而β-葡聚糖雖然參與構(gòu)成了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),但其可能不占主導(dǎo)地位,故水解β-葡聚糖對細(xì)胞壁的破壞程度不如纖維素,淀粉仍被較完整的細(xì)胞壁所包裹,所以消化前期淀粉只能緩慢地釋放,與細(xì)胞壁周圍的酶作用,但隨著消化的進(jìn)行,細(xì)胞壁中由纖維素維系的結(jié)構(gòu)逐漸被破壞,到達(dá)一定程度后,周圍的酶得以進(jìn)入細(xì)胞[20]與大量堆積在細(xì)胞內(nèi)且脫離了β-葡聚糖包裹的游離淀粉作用,所以消化速度顯著提升。

圖1 青稞全粉中纖維素、β-葡聚糖及蛋白質(zhì)對淀粉體外消化的影響

另外,未經(jīng)胃消化的青稞粉保留了更多的蛋白質(zhì),淀粉的消化率顯著低于正常消化的全粉,說明在青稞全粉中蛋白質(zhì)也會對淀粉消化有抑制作用。部分蛋白質(zhì)也參與了細(xì)胞壁的構(gòu)成,酶解蛋白質(zhì)后完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)也會受到一定的破壞。除此之外,還有一種可能的解釋是在青稞全粉中蛋白質(zhì)與淀粉之間存在相互作用力,對淀粉的釋放和酶解產(chǎn)生影響,而正常消化的全粉中的蛋白質(zhì)被胃蛋白酶酶解,這種相互作用力被破壞,因此淀粉的消化率更高。KIM等[21]和JEKINS等[22]發(fā)現(xiàn)了小麥粉中存在蛋白質(zhì)-淀粉相互作用,這種作用具有抑制小麥制品中淀粉消化的能力,LI等[23]最近也進(jìn)一步證實了小麥粉中蛋白質(zhì)含量的增加能夠提高淀粉對α-淀粉酶的抵抗力。在青稞全粉中,這種蛋白質(zhì)-淀粉相互作用力可能也同樣存在,且影響著淀粉的消化。

2.2 青稞β-葡聚糖和蛋白質(zhì)對淀粉體外水解的影響

如圖2所示,將純的青稞β-葡聚糖和蛋白質(zhì)加入青稞淀粉后,均能起到一定程度促進(jìn)淀粉體外水解的作用,且隨添加量增加促進(jìn)作用更加明顯,這與2.1中青稞全粉內(nèi)β-葡聚糖和蛋白質(zhì)會抑制淀粉消化的結(jié)論截然相反。說明β-葡聚糖和蛋白質(zhì)對淀粉的抑制作用不是通過抑制酶活性實現(xiàn)的,而可能是因為外加β-葡聚糖和蛋白質(zhì)后并不能形成完整的青稞細(xì)胞結(jié)構(gòu),沒有細(xì)胞壁包裹以及其他作用力束縛的淀粉直接暴露在淀粉酶的作用下,仍易被水解。因此,β-葡聚糖和蛋白質(zhì)之所以能減緩青稞淀粉消化并不是因為其本身具有抑制作用,而可能是得益于青稞的完整結(jié)構(gòu)。

圖2 青稞β-葡聚糖、蛋白質(zhì)對青稞淀粉水解的影響

2.3 青稞淀粉和蛋白質(zhì)對β-葡聚糖含量的影響

如圖3所示,去除淀粉和蛋白質(zhì)后的青稞粉中測得的β-葡聚糖含量最高,為(6.09±0.10)%；只去除蛋白質(zhì)的青稞粉中β-葡聚糖含量次之,為(5.82±0.08)%；而未處理的青稞全粉中β-葡聚糖含量僅為(5.60±0.06)%。這說明在青稞全粉內(nèi),淀粉和蛋白質(zhì)的存在會降低β-葡聚糖的測定含量。一種可能的解釋是在青稞完整結(jié)構(gòu)中β-葡聚糖、淀粉、蛋白質(zhì)形成了某種特殊結(jié)構(gòu),三者間產(chǎn)生了一定的相互作用力,這種結(jié)構(gòu)使β-葡聚糖被部分包裹,降低了β-葡聚糖被酶水解的效率,從而降低了β-葡聚糖含量的測量值。而通過高峰α-淀粉酶和胃蛋白酶的作用后,這些結(jié)合的淀粉和蛋白質(zhì)被水解,更多的β-葡聚糖得以釋放[24],進(jìn)而被酶水解,因此BG含量的測量值增加。

圖3 青稞全粉中淀粉和蛋白質(zhì)對β-葡聚糖含量測定的影響

2.4 青稞β-葡聚糖和蛋白質(zhì)對青稞全粉粒徑大小及分布的影響

如圖5所示,青稞全粉的粒徑分布在1～10、10～100 和100～1 000 μm的粒徑區(qū)間內(nèi)各存在1個峰。相較于青稞全粉,去掉BG或蛋白質(zhì)后的粒徑變化呈現(xiàn)了相似的趨勢,即位于100～1 000 μm區(qū)間的峰高降低,10～100 μm和1～10 μm區(qū)間的峰高提高,且平均粒徑降低：青稞全粉為(118.61±8.05) μm,去除蛋白質(zhì)后降低至(92.38±1.93) μm,去除BG后降低為(48.26±1.45) μm。由此可見,BG對全粉粒徑的影響更大,這可能是因為BG主要分布于細(xì)胞壁中,水解β-葡聚糖后細(xì)胞完整性受到一定程度的破壞,且BG形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的包裹作用消失,細(xì)胞內(nèi)的小顆粒物質(zhì)如淀粉溶出,進(jìn)而影響了測得的粒徑大小及分布。而相比于β-葡聚糖,蛋白質(zhì)對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的作用要弱,主要組成細(xì)胞膜,在機(jī)械粉碎作用下容易破裂,僅有少數(shù)鑲嵌于細(xì)胞壁[12],故水解蛋白質(zhì)對顆粒粒徑的影響相對較小。這一結(jié)果與CHEN等[20]比較完整蕎麥粉和經(jīng)過破碎的蕎麥粉得出的結(jié)論一致。

a-青稞原料；b-青稞片放大1 000倍的圖像；c-青稞粉放大1 000倍的圖像；d-青稞片在激光共聚焦顯微鏡下的圖像,放大倍數(shù)10倍

2.5 青稞全粉及淀粉糊化特性分析

對比未處理的青稞全粉,去掉β-葡聚糖或蛋白質(zhì)后的青稞粉以及單獨的青稞淀粉糊化黏度都顯著降低。更高的終值黏度表明直鏈淀粉分子之間的結(jié)合強(qiáng)度在未處理的青稞全粉中最大[25],因此β-葡聚糖和蛋白質(zhì)在青稞全粉內(nèi)都會影響淀粉的糊化特性,這和LIU等[26]的研究一致,他們發(fā)現(xiàn)相較于蛋白質(zhì),β-葡聚糖對淀粉糊化特性的影響更大,這可能是因為β-葡聚糖在細(xì)胞壁中形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)將附近的蛋白質(zhì)和淀粉包裹在一起形成了牢固的結(jié)構(gòu),共同影響青稞全粉的糊化黏度[27]。與在青稞全粉中相反,單獨的純青稞BG或蛋白質(zhì)加入青稞淀粉中反而會降低糊化過程中體系的黏度,PEREZ-QUIRCE等[28]也發(fā)現(xiàn)向面包中添加小分子質(zhì)量和中分子質(zhì)量的β-葡聚糖能降低糊化過程體系的黏度,且隨著添加量增加作用越明顯,這可能是因為β-葡聚糖和蛋白質(zhì)的加入減少了糊狀混合物中可利用的水分,進(jìn)而限制了淀粉顆粒的吸水膨脹,提高完整顆粒的保留率,降低了糊化黏度[29],而在青稞全粉中,完整的青稞結(jié)構(gòu)對體系糊化黏度的增加作用強(qiáng)于這種降低糊化黏度的作用,水解β-葡聚糖和蛋白質(zhì)會破壞青稞結(jié)構(gòu)的完整性,故糊化黏度有所降低。這也解釋了為什么β-葡聚糖和蛋白質(zhì)在青稞全粉內(nèi)能抑制淀粉消化,而單獨和青稞淀粉混勻又會促進(jìn)淀粉水解。

表2 青稞β-葡聚糖和蛋白質(zhì)對青稞全粉和青稞淀粉糊化特性的影響

2.6 青稞顆粒的微觀結(jié)構(gòu)

掃描電鏡下觀察青稞顆粒切片,發(fā)現(xiàn)青稞淀粉主要分布于細(xì)胞內(nèi)部(圖4-b),而多數(shù)淀粉在青稞顆粒研磨粉碎的過程中由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞而游離出來 (圖4-c)[30],只有部分仍保持完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。激光共聚焦顯微鏡下觀察到被染成藍(lán)色的青稞β-葡聚糖呈網(wǎng)狀分布于細(xì)胞外層的細(xì)胞壁中(圖4-d),這種分布與ZHANG等[27]觀察到的一致,他們發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖在細(xì)胞壁中形成了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能進(jìn)一步將附近的蛋白質(zhì)和淀粉包裹在一起形成緊密的結(jié)構(gòu),從而降低淀粉酶的可及性,抑制淀粉的消化。這種結(jié)構(gòu)不僅能解釋淀粉和蛋白質(zhì)影響β-葡聚糖含量測定這一現(xiàn)象,同理也說明了青稞全粉中β-葡聚糖和蛋白質(zhì)抑制淀粉消化的原因。

圖4 青稞β-葡聚糖和蛋白質(zhì)對青稞全粉粒徑分布的影響

3 結(jié)論

研究表明,青稞β-葡聚糖主要位于青稞細(xì)胞壁,并對青稞淀粉起到包裹的作用,從而影響了青稞全粉的粒徑及糊化特性,且全粉中的β-葡聚糖、蛋白質(zhì)及纖維素對青稞淀粉的體外消化有抑制作用,而將青稞β-葡聚糖、蛋白質(zhì)及淀粉重組后,這種作用即消失,且黏度也降低,同時,去除青稞蛋白質(zhì)和淀粉增加了青稞β-葡聚糖的含量,這些結(jié)果說明青稞β-葡聚糖及蛋白質(zhì)均能抑制淀粉的消化,且這種作用主要得益于青稞的完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)而不是黏度。因此,青稞全粉的完整結(jié)構(gòu)在抑制淀粉消化中其主導(dǎo)作用,青稞全粉及相關(guān)產(chǎn)品更有利于人體健康,特別是對于肥胖和糖尿病患者。但由于體外消化和體內(nèi)研究有諸多差異性,關(guān)于青稞的降血糖功效仍需進(jìn)一步深入研究。