孫可澄,尹花,趙鑫銳,3,4,陳璐,李江華,3,4,侯曉平,堵國(guó)成,3,4,5*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)2(啤酒生物發(fā)酵工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(青島啤酒股份有限公司),山東 青島,266000)3(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122)4(江南大學(xué) 未來(lái)食品科學(xué)中心,江蘇 無(wú)錫,214122)5(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122)

啤酒是世界三大古酒之一,以其獨(dú)特的風(fēng)味深受消費(fèi)者的青睞[1]。啤酒中的風(fēng)味物質(zhì)對(duì)其口感和香氣起著極其重要的作用,而乙醛是嚴(yán)重影響啤酒風(fēng)味及其穩(wěn)定性的羰基化合物[2]。2～5 mg/L的乙醛使啤酒具有芳香的風(fēng)味,若乙醛含量高于10 mg/L,不僅易產(chǎn)生腐爛青草味,還會(huì)縮短啤酒風(fēng)味的保鮮期,甚至人體飲用后引起不良反應(yīng)[3]。近年來(lái),伴隨著酒精飲料工業(yè)的快速發(fā)展,質(zhì)量安全成為不可忽視的議題。保持品牌特有風(fēng)味的基礎(chǔ)上,如何降低啤酒中的乙醛含量,是生產(chǎn)企業(yè)普遍關(guān)注的焦點(diǎn)。

迄今為止,學(xué)者們相繼提出了啤酒中乙醛含量的控制措施[4]。然而,控制生產(chǎn)工藝不具有普遍適用性,構(gòu)建酵母工程菌不符合食品安全規(guī)范,難以徹底解決啤酒風(fēng)味問(wèn)題。而啤酒中的乙醛主要來(lái)自于酵母的代謝,酵母內(nèi)的乙醇脫氫酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脫氫酶是代謝乙醛的關(guān)鍵酶,共同作用決定了乙醛的含量[5]。酵母從根本上決定了啤酒中乙醛的形成和積累,選育發(fā)酵性能優(yōu)良的低產(chǎn)乙醛釀酒酵母也成為保持啤酒風(fēng)味穩(wěn)定、保障啤酒安全生產(chǎn)的有效途徑[6]。然而,前期篩選低產(chǎn)乙醛酵母菌株的研究中,普遍存在篩選周期較長(zhǎng)[7]、工作量大[8]、成本高[8]和篩選效率偏低[9]的問(wèn)題。因此,需要建立一套高效、快速的低產(chǎn)乙醛啤酒酵母菌株篩選策略。

從食品安全及啤酒實(shí)際生產(chǎn)的角度出發(fā),結(jié)合目前乙醛含量控制方面存在的問(wèn)題,本研究以Lager型啤酒工業(yè)酵母菌株為研究對(duì)象,采用多輪常壓室溫等離子體(atmospheric room temperature plasma,ARTP)誘變育種手段對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行改良,利用乙醇-雙硫侖抗性平板、高濃度乙醛篩選平板及其對(duì)應(yīng)馴養(yǎng)液對(duì)誘變菌株進(jìn)行平板篩選及液體馴化,形成誘變-篩選-馴化的多輪初篩體系,同時(shí)以關(guān)鍵酶活性變化為低產(chǎn)乙醛復(fù)篩標(biāo)準(zhǔn),通過(guò)實(shí)驗(yàn)室搖瓶水平的啤酒模擬釀造體系,最終獲得發(fā)酵性能和生物學(xué)特性均與出發(fā)菌株無(wú)顯著差異的低產(chǎn)乙醛工業(yè)啤酒酵母。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

Lager型啤酒工業(yè)酵母(出發(fā)菌株),江南大學(xué)生物工程學(xué)院生物系統(tǒng)與生物加工研究室保藏。

高濃度乙醛篩選培養(yǎng)基(g/L)：乙醛2,酵母粉10,蛋白胨20,葡萄糖20,瓊脂粉20,121 ℃滅菌15 min(乙醛以0.45 μm有機(jī)濾膜除菌,待培養(yǎng)基滅菌冷卻后添加)。

高濃度乙醛馴養(yǎng)液(g/L)：乙醛3,酵母粉10,蛋白胨20,葡萄糖20,121 ℃滅菌15 min(乙醛添加方式同上)。

乙醇-雙硫侖篩選培養(yǎng)基(g/L)：乙醇10,雙硫侖(滅菌后添加)0.000 2,(NH4)2SO45,KH2PO41,NaCl 0.1,MgSO4·7H2O 0.5,CaCl20.1,酵母膏0.1,瓊脂粉20,115 ℃滅菌20 min。

乙醇-雙硫侖馴養(yǎng)液(g/L)：乙醇10,雙硫侖(滅菌后添加)0.002 0,(NH4)2SO45,KH2PO41,NaCl 0.1,MgSO4·7H2O 0.5,CaCl20.1,酵母膏0.1,115 ℃滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose, YPD)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，葡萄糖20，酵母浸出粉10，121 ℃滅菌15 min。

1.1.2 試劑與原料

乙醛(99.5%，GC純度，CAS No. 75-07-0)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3-庚酮(99.0%，GC純度，CAS No. 106-35-4)，上海麥克林生化科技有限公司；加拿大(卡普蘭德)皮爾森麥芽、卡斯卡特顆粒酒花(Cascade)、馬格努門顆粒酒花(Magnum)，均為進(jìn)口市售。

1.2 儀器與設(shè)備

DLEUW22050麥芽粉碎機(jī),Buhler-Miag公司；BGT-8A協(xié)定糖化儀,BIOER公司；B00 N-900 N超聲波細(xì)胞破碎儀,上海般諾生物科技有限公司；GC-2010AF氣相色譜儀,日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 麥汁制備

45 ℃時(shí),料水比1∶4(g∶mL)加水投料；升溫至48 ℃,保溫30 min；升溫至65 ℃,保溫40 min；升溫至72 ℃,保溫10 min；升溫至78 ℃,保溫10 min,糖化結(jié)束[10]。趁熱過(guò)濾,煮沸1 h,添加酒花(0.25‰)。調(diào)節(jié)麥汁至12°P。

1.3.2 ARTP誘變

將對(duì)數(shù)期的菌體離心洗滌3次,稀釋OD600為1.0。取10 μL菌懸液于無(wú)菌金屬載片(8 mm),以氦氣等離子束對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行誘變處理[11]。保持氦氣流速15.0 L/min,輸入功率100 W,處理距離2 mm,處理溫度<40 ℃。為了獲得最佳的誘變條件,設(shè)置處理時(shí)間為0、50、70、90、110和130 s,將金屬載片置于1 mL的無(wú)菌生理鹽水中,振蕩洗滌。將稀釋菌液涂布于YPD培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)48 h,致死率按公式(1)計(jì)算,繪制致死率曲線,并確定最佳照射時(shí)間。

(1)

1.3.3 高濃度乙醛及乙醇-雙硫侖平板篩選

將誘變菌液分別涂布于含有2.0 g/L乙醛和10 g/L乙醇、0.2 mg/L雙硫侖的抗性平板,30 ℃培養(yǎng)3～4 d后,挑取生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行液體馴化[12-13]。

1.3.4 高濃度乙醛及乙醇-雙硫侖液體馴化

挑取2種抗性平板的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)菌株,分別置于含有3.0 g/L乙醛和10 g/L乙醇、2.0 mg/L雙硫侖的液體培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)2～3 d。

1.3.5 關(guān)鍵酶活力測(cè)定

1.3.5.1 粗酶液的制備

離心收集酵母細(xì)胞,用磷酸鹽緩沖液(pH 8.0,濃度0.05 mol/L)洗滌重懸,超聲破碎細(xì)胞(破4 s停5 s,共5 min),離心取上清液,4 ℃儲(chǔ)藏備用[14]。

1.3.5.2 酶活力測(cè)定

乙醇脫氫酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脫氫酶均選用300 μL的酶活反應(yīng)體系,分別以乙醇和乙醛為反應(yīng)底物,添加細(xì)胞浸出液,采用單池時(shí)間掃描,連續(xù)5 min內(nèi),記錄340 nm波長(zhǎng)處吸光度值[15]。340 nm下,吸光度值增加0.001為1個(gè)活力單位(U)。酶活性以總活力值表示(U/mg)。

1.3.6 啤酒發(fā)酵

菌株變溫?cái)U(kuò)培,靜置取酵泥,接種于麥汁(1×106CFU/mL)?？凵习l(fā)酵栓,液封。12 ℃靜置培養(yǎng)8 d,糖度為4°Bx左右時(shí),前酵結(jié)束。4 ℃靜置發(fā)酵7 d,發(fā)酵成熟,后酵結(jié)束。

1.3.7 乙醛等主要風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

乙醛等啤酒中主要風(fēng)味物質(zhì)含量采用頂空氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定,選取3-庚酮作為內(nèi)標(biāo)[16]。

1.3.8 發(fā)酵性能的測(cè)定

1.3.8.1 酒精度、原麥汁濃度的測(cè)定

依據(jù)GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》及GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 酒中乙醇濃度的測(cè)定》,檢測(cè)啤酒發(fā)酵液的酒精度和原麥汁濃度[17]。

1.3.8.2 發(fā)酵速度的測(cè)定

發(fā)酵過(guò)程中,定期記錄發(fā)酵液質(zhì)量變化,以CO2損失質(zhì)量比較菌株的發(fā)酵速度。菌株變溫?cái)U(kuò)培后置于150 mL麥汁中12 ℃發(fā)酵培養(yǎng),定期搖瓶稱重,當(dāng)失重量差值<0.2 g時(shí),終止發(fā)酵[18]。繪制發(fā)酵醪質(zhì)量損失與時(shí)間曲線,比較各菌株發(fā)酵速度的大小。

1.3.9 生物學(xué)特性的測(cè)定

1.3.9.1 生長(zhǎng)性能的測(cè)定

活化菌株,以5%的接種量接于YPD培養(yǎng)基中,220 r/min,30 ℃培養(yǎng)。階段性取樣,波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定其吸光度值[19]。

1.3.9.2 絮凝性的測(cè)定

相繼以0.01 mol/L的EDTA-Na溶液和無(wú)菌水洗滌酵泥,棄去上清液,加入250 μL pH 4.5 HAc-NaAc緩沖溶液,立即在波長(zhǎng)660 nm處測(cè)定OD1,室溫靜置30 min,取液面頂端50 μL,于波長(zhǎng)660 nm處測(cè)定OD2。以pH 4.5的HAc-NaAc緩沖溶液為空白[20],絮凝性按公式(2)計(jì)算。

(2)

2 結(jié)果與分析

2.1 致死率曲線

為獲得最佳的誘變條件,對(duì)酵母菌液進(jìn)行不同時(shí)間的誘變處理,致死情況見(jiàn)圖1。采用ARTP誘變育種時(shí),若致死率偏低,則無(wú)法對(duì)釀酒酵母進(jìn)行有效改良；若致死率偏高,易造成菌株性能的大幅改變,從而影響成品啤酒的主體風(fēng)味。因此應(yīng)保持菌株致死率80%～90%,即選擇最佳誘變時(shí)間為90 s。

圖1 不同誘變時(shí)間下的酵母致死率

2.2 初篩

2.2.1 高濃度乙醛平板篩選及液體馴化

吸取50 μL誘變菌液(1×103個(gè)/mL)涂布于乙醛質(zhì)量濃度為2.0 g/L的抗性平板,30 ℃培養(yǎng)72 h。吸取1 mL無(wú)菌生理鹽水于平板表面,吹洗數(shù)次,直至洗去所有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)菌株。稀釋菌液至OD600為5.0,按1%接種于含有3.0 g/L乙醛的液體培養(yǎng)基中馴化,30 ℃培養(yǎng)48 h,洗滌馴養(yǎng)菌株以進(jìn)行下一輪誘變。

菌體誘變-平板篩選-液體馴養(yǎng)的流程重復(fù)3次,此過(guò)程中,不斷提高平板及馴養(yǎng)液中的乙醛濃度。一輪初篩平板共獲得136株突變菌株,二輪和三輪初篩平板分別獲得97、43株突變菌株。將第3輪馴養(yǎng)菌液涂布于高濃度乙醛篩選平板,獲得14株突變菌株。

2.2.2 乙醇-雙硫侖平板篩選及液體馴化

吸取50 μL誘變菌液(1×103個(gè)/mL)涂布于以乙醇為唯一碳源,雙硫侖質(zhì)量濃度為0.2 mg/L的抗性平板,30 ℃培養(yǎng)96 h。吸取1 mL無(wú)菌生理鹽水于平板表面,吹洗數(shù)次,直至洗去所有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)菌株。稀釋菌液至OD600為5.0,按1%接種于含有10 g/L乙醇、2.0 mg/L雙硫侖的液體培養(yǎng)基中馴化,30 ℃培養(yǎng)72 h。洗滌馴養(yǎng)菌株以進(jìn)行下一輪誘變。

菌體誘變-平板篩選-液體馴養(yǎng)的流程重復(fù)3次,此過(guò)程中,不斷提高平板及馴養(yǎng)液中的雙硫侖濃度。最終,一輪初篩平板共獲得39株突變菌株,二輪和三輪初篩平板分別獲得27、9株突變菌株。將第3輪馴養(yǎng)菌液涂布于乙醇-雙硫侖篩選平板,獲得6株突變菌株。至此,共獲得20株初篩菌株。

表1 不同輪次篩選平板中的突變菌株數(shù)

2.3 復(fù)篩

啤酒發(fā)酵過(guò)程中,乙醇脫氫酶Ⅰ和乙醛脫氫酶分別促進(jìn)乙醛轉(zhuǎn)化為乙醇和乙酸,而乙醇脫氫酶Ⅱ主要促進(jìn)乙醇向乙醛的轉(zhuǎn)化[21]。因此,具有高乙醇脫氫酶Ⅰ、乙醛脫氫酶活性,低乙醇脫氫酶Ⅱ活性是篩選低產(chǎn)乙醛菌株的關(guān)鍵[22]。為此,對(duì)初篩所得的20株酵母進(jìn)行關(guān)鍵酶活的測(cè)定。

表2 不同輪次馴養(yǎng)液的菌液吸光值

以關(guān)鍵酶活性變化率為篩選指標(biāo),由表3可知,初篩菌株的多種關(guān)鍵酶活性正突變率均達(dá)70%以上。其中乙醇脫氫酶Ⅰ活性增幅高于50%以上的有3株,分別為L(zhǎng)ager-13、Lager-16和Lager-14；乙醇脫氫酶Ⅱ活性降幅高于50%以上的有6株,分別為L(zhǎng)ager-1、Lager-12、Lager-5、Lager-16、Lager-19和Lager-13；各菌株乙醛脫氫酶活性增幅普遍不高,僅有Lager-2、Lager-9和Lager-16的增幅高于15%。綜合3種關(guān)鍵酶活性變化率,以三者總和為篩選指標(biāo),在20株初篩菌株中,選擇Lager-12、Lager-13和Lager-16作為復(fù)篩菌株。

表3 初篩菌株關(guān)鍵酶活性及變化率

2.4 發(fā)酵驗(yàn)證

2.4.1 乙醛等主要風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

乙醛作為啤酒中含量最高的揮發(fā)性羰基化合物,直接影響了啤酒風(fēng)味的協(xié)調(diào)和穩(wěn)定性。由表4可知,突變菌株的啤酒發(fā)酵液中乙醛含量均顯著低于出發(fā)菌株。其中,Lager-16和Lager-13的乙醛含量降幅較大,分別為61.63%和61.14%；Lager-12的乙醛含量降幅為55.95%。

表4 出發(fā)及突變菌株發(fā)酵結(jié)束時(shí)酒樣中的主要風(fēng)味物質(zhì)含量 單位：mg/L

篩選低產(chǎn)乙醛工業(yè)啤酒酵母,不僅要精確監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中的乙醛含量,也需考察其余主要的風(fēng)味物質(zhì),以滿足實(shí)際生產(chǎn)的需求。除乙醛含量以外,相對(duì)出發(fā)菌株,Lager-12和Lager-13發(fā)酵結(jié)束時(shí)風(fēng)味物質(zhì)中的總醇、總酯含量均出現(xiàn)10%～15%的下降,與出發(fā)菌株的整體風(fēng)味存在一定差異；而Lager-16發(fā)酵結(jié)束時(shí)總醇、總酯含量雖略有增加,但增幅低于6%,與出發(fā)菌株在整體風(fēng)味上無(wú)明顯差異。

2.4.2 發(fā)酵性能的測(cè)定

2.4.2.1 酒精度、原麥汁濃度的測(cè)定

酒精度、原麥汁濃度是評(píng)價(jià)啤酒風(fēng)味和質(zhì)量的重要指標(biāo)。酒精度越高,麥汁利用率越高,酒體口感越醇厚[23]。取適量后酵結(jié)束的酒樣,測(cè)定結(jié)果如圖2-a所示。突變菌株相較出發(fā)菌株的酒精度和原麥汁濃度均偏高,其中Lager-13和Lager-16的酒精度增幅更明顯,分別為14.29%和8.57%。此現(xiàn)象與復(fù)篩結(jié)果一致,突變菌株中的乙醇脫氫酶Ⅰ活性增加、乙醇脫氫酶Ⅱ活性降低,直接導(dǎo)致乙醇積累量升高。

2.4.2.2 發(fā)酵速度實(shí)驗(yàn)

啤酒酵母的發(fā)酵速度與菌種有直接的關(guān)系。通常酵母的發(fā)酵速度越快,發(fā)酵周期越短,啤酒的風(fēng)味更清爽、品質(zhì)更穩(wěn)定[24]。由圖2-b可知,發(fā)酵前2 d,各菌株的發(fā)酵速度逐步提升；2 d后,降糖速度迅速減慢,發(fā)酵逐步停止。發(fā)酵前4 d,各突變菌株的發(fā)酵速度較高；5 d后,出發(fā)菌株的發(fā)酵速度較高?？v觀發(fā)酵過(guò)程,出發(fā)菌株與各突變菌株的發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)一致,發(fā)酵速度無(wú)明顯差異。

a-酒精度及原麥汁濃度；b-發(fā)酵速度

2.4.3 生物學(xué)特性的測(cè)定

2.4.3.1 生長(zhǎng)性能實(shí)驗(yàn)

將Lager、Lager-12、Lager-13及Lager-16分別接種于YPD培養(yǎng)基中,于30 ℃,220 r/min條件下培養(yǎng)。發(fā)酵前期間隔3 h取樣,后期間隔2 h取樣,檢測(cè)其在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度,結(jié)果如圖3-a所示。發(fā)酵前期各菌株生長(zhǎng)性能基本一致,對(duì)數(shù)中后期各突變菌生長(zhǎng)性能較出發(fā)菌均有所降低,但彼此間差異不大(≤7.14%)。

2.4.3.2 絮凝性實(shí)驗(yàn)

酵母絮凝性在啤酒生產(chǎn)上具有重要意義,其差異會(huì)直接影響發(fā)酵階段酵母的回收再利用,進(jìn)而改變啤酒的風(fēng)味[22]。因此,對(duì)出發(fā)菌株及3株突變菌株的絮凝性進(jìn)行測(cè)定。如圖3-b所示,突變菌株經(jīng)多輪誘變、馴養(yǎng),絮凝性較出發(fā)菌株均有小幅提升(≤1.99%),彼此間差異不大。

a-生長(zhǎng)曲線；b-絮凝性

2.4.4 發(fā)酵驗(yàn)證結(jié)果

為考察突變株是否具有低產(chǎn)乙醛特性及良好的釀造性能,經(jīng)啤酒發(fā)酵模擬實(shí)驗(yàn),對(duì)比了突變菌與出發(fā)菌的主要酒體風(fēng)味、發(fā)酵性能和生物學(xué)特性。結(jié)果表明,3株突變株均表現(xiàn)出良好的低產(chǎn)乙醛性能,其中Lager-16啤酒發(fā)酵液中的乙醛含量最低。同時(shí),Lager-16與原始菌株啤酒發(fā)酵液中主體風(fēng)味物質(zhì)差異更小,酒精度和原麥汁濃度有所提升；發(fā)酵速度更快,生長(zhǎng)曲線與原始菌株趨勢(shì)大致相同,絮凝性略有升高(1.30%)。

綜上,突變株Lager-16的低產(chǎn)乙醛性能突出,且與出發(fā)菌株Lager的主要酒體風(fēng)味、發(fā)酵性能及生物學(xué)特性指標(biāo)存在小范圍內(nèi)的上下波動(dòng),無(wú)明顯差異。因此,選擇突變菌株Lager-16作為低產(chǎn)乙醛啤酒工業(yè)酵母。

3 結(jié)論與討論

以Lager型啤酒工業(yè)酵母菌株為研究對(duì)象,采用多輪ARTP誘變育種手段對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行改良,利用乙醇-雙硫侖抗性平板及高濃度乙醛篩選平板及其馴養(yǎng)液對(duì)誘變菌株進(jìn)行定向篩選及馴化,形成誘變-篩選-馴化的多輪初篩體系,共獲得初篩菌株20株；同時(shí)以乙醇脫氫酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脫氫酶等關(guān)鍵酶活性變化為低產(chǎn)乙醛釀酒酵母的復(fù)篩標(biāo)準(zhǔn),酶活性正突變率均達(dá)70%以上,優(yōu)選酶活性變化顯著的復(fù)篩菌株3株；通過(guò)實(shí)驗(yàn)室搖瓶水平的啤酒模擬釀造體系,驗(yàn)證突變菌株及原始菌株的主要酒體風(fēng)味、發(fā)酵性能和生物學(xué)特性是否存在顯著差異,最終選擇突變菌株Lager-16作為低產(chǎn)乙醛啤酒工業(yè)酵母。

通過(guò)誘變-篩選-馴化的多輪初篩體系、關(guān)鍵酶活性變化復(fù)篩實(shí)驗(yàn)和啤酒發(fā)酵驗(yàn)證(圖4),篩選得到的突變菌株Lager-16發(fā)酵成品啤酒中乙醛含量由出發(fā)菌株的42.03 mg/L降低至16.51 mg/L,降幅為61.63%。綜合菌株生物學(xué)特性及各項(xiàng)發(fā)酵性能指標(biāo),突變株Lager-16滿足啤酒釀造要求,具有工業(yè)應(yīng)用前景。

圖4 篩選策略流程圖