吳世陶 劉 方 石偉偉 張 敏 李建章 劉恒方△

1）鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052 2）鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450003

線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作（mi?tochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes，MELAS）是由于線粒體DNA（mtDNA）或核DNA（nDNA）突變、導(dǎo)致線粒體的結(jié)構(gòu)和功能異常、細胞供能不足引起的一組臨床綜合征［1］。MELAS綜合征發(fā)病年齡早、臨床表現(xiàn)復(fù)雜、診斷困難，肌肉病理對其診斷具有重要價值，但其為有創(chuàng)性檢查，且兒童患者配合不佳，有一定的局限性?，F(xiàn)在已經(jīng)進入精準醫(yī)學(xué)時代，基因檢測是診斷MELAS綜合征的金標準，且是一種無創(chuàng)、準確的方法［2］。ME?LAS綜合征約95%為mtDNA突變，5%為nDNA突變，國外研究發(fā)現(xiàn)與MELAS綜合征相關(guān)的mtDNA突變有40多種，約80%為3243 A＞G突變，其他突變位點有3271 T＞C、1642 G＞A、3252 A＞G、3260 A＞G、3291 T＞C、8344 A＞G、8993 T＞G、9176 T＞C和13513 G＞A等［3-5］。目前，國外研究方向主要為尋找新的突變位點、分析基因突變的發(fā)病機制、研發(fā)新藥及基因治療等［6-7］，這是一項長期工程、需要積累大量的MELAS綜合征患者。相比之下，國內(nèi)對MELAS綜合征基因突變位點、流行病學(xué)、突變類型與表型的異質(zhì)性等研究相對較少。本研究分析42例MELAS綜合征患者及親屬的基因測序結(jié)果，分析MELAS綜合征的熱點突變、新發(fā)突變及不同組織的突變率等分子生物學(xué)特征。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2011-01—2020-01鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院和鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)肌肉病理和基因測序同時確診的42例MELAS綜合征患者及親屬的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)、肌肉病理和基因測序等資料，其中男22例，女20例，年齡4～42歲，病程2個月～11 a。本研究獲得鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院倫理委員會的批準，且患者或家屬簽署知情同意書。

1.2肌肉病理患者或監(jiān)護人簽署知情同意書，局麻下獲得骨骼肌標本，根據(jù)病情取材部位為肱二頭肌或腓腸肌。新鮮標本分兩部分，一部分行肌肉組織病理染色，另一部分行電鏡檢查。新鮮肌肉標本經(jīng)液氮冷卻的異戊烷迅速冷凍，80℃保存，染色時制成8μm冷凍切片，進行蘇木精-伊紅（HE）、改良Gomori（MGT）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、還原型輔酶Ⅰ四氮唑還原酶（NADH）、細胞色素C氧化酶（COX）、過碘酸雪夫氏（PAS）和油紅O（ORO）染色，顯微鏡200倍下進行病理分析。

1.3基因測序?qū)?2例MELAS綜合征患者及親屬的外周血和新鮮尿液同時進行基因測序，送至武漢康圣環(huán)球醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司進行PCR擴增、電泳后產(chǎn)生清晰可見、大小符合預(yù)期的條帶，首先采用Sanger法對3243 A＞G、3252 A＞G、3271 T＞C和13513 G＞A常見突變位點進行測序。如果常見突變位點陰性時，應(yīng)用二代測序檢測線粒體DNA全長，對于明確的致病突變，采用Sanger測序進行驗證。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，采用秩和檢驗比較血液和尿液中線粒體DNA的突變率。檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1肌肉病理42例患者改良Gomori染色可見較多破碎紅纖維，見圖1。

圖1 肌肉病理（×200）Figure 1 Muscle pathology（×200）

2.2基因測序42例MELAS綜合征患者及親屬進行基因測序，42例患者均發(fā)現(xiàn)存在mtNDA突變。共發(fā)現(xiàn)30例患者存在3243 A＞G突變，血液檢出25例發(fā)生3243 A＞G突變，突變率為22.15%～100%（35.82±11.26）%；尿液檢出30例發(fā)生3243 A＞G突變，突變率為38.46%～100%（63.57±20.85）%；發(fā)現(xiàn)3271 T＞C突變3例，13513 G＞A突變3例，1642 G＞A、3093 C＞G、3256 C＞T、3302 A＞G、3697 G＞A和15242 G＞A突變分別1例。20例患者的親屬存在相同的基因突變位點，其中17例患者的母親、外婆、舅舅、兄弟姐妹或兒女存在相同的3243 A＞G突變位點，3例患者的母親分別存在相同的3271 T＞C、3302 A＞G、3697 G＞A突變位點?；颊?發(fā)生3243 A＞G突變，外周血突變率為52.38%，尿液細胞突變率為100%；患者1的母親發(fā)生3243 A＞G突變，外周血突變率為9.11%，尿液細胞突變率為59.38%，母親無臨床癥狀，為攜帶者（圖2）?；颊?5發(fā)生3093 C＞G突變，外周血突變率為52.68%，尿液細胞突變率為100%（圖3）。患者16發(fā)生13513 G＞A突變，外周血突變率為77.61%；尿液細胞突變率為100%，為純質(zhì)性突變（圖4）；患者17出現(xiàn)3697 G＞A突變，外周血和尿液細胞的突變率均為100%；母親的尿液細胞存在相同的3697 G＞A突變，突變率為21.15%，母親沒有臨床癥狀，為攜帶者（圖5）；患者20發(fā)生3271 T＞C突變，外周血突變率為69.84%；尿液細胞突變率為100%，為純質(zhì)性突變；患者20的母親外周血未發(fā)生3271 T＞C突變；尿液細胞發(fā)生3271 T＞C突變，突變率為17.28%，有臨床表現(xiàn)（圖6）；患者34發(fā)生15242 G＞A突變，外周血突變率為42.75%；尿液細胞突變率為49.53%（圖7）。所有患者的父親均未發(fā)現(xiàn)基因突變。與外周血的線粒體DNA突變率相比，尿液細胞的突變率顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

圖2 患者1的基因測序結(jié)果Figure 2 The gene sequencing results of case 1

圖3 患者15的基因測序結(jié)果Figure 3 The gene sequencing results of case 15

圖4 患者16的基因測序結(jié)果Figure 4 The gene sequencing results of case 16

圖5 患者17的基因測序結(jié)果Figure 5 The gene sequencing results of case 17

圖6 患者20的基因測序結(jié)果Figure 6 The gene sequencing results of case 20

圖7 患者34的基因測序結(jié)果Figure 7 The gene sequencing results of case 34

3 討論

人類mtDNA全長16 569 bp，為雙鏈閉式環(huán)狀分子，其內(nèi)環(huán)為輕鏈（L-strand），外環(huán)為重鏈（Hstrand），編碼22個轉(zhuǎn)運RNA（transfer RNA，tRNA）、2個核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）（12S、16S）和13個蛋白質(zhì)［8-9］。目前發(fā)現(xiàn)與MELAS綜合征相關(guān)的mtDNA基因突變有40多個，分別位于MT CO3、MTNDl、MT-ND4、MT-ND5、MT-CYB和MT-NC6，還位于tRNA和rRNA區(qū)域的MT-TLl、MT-TL2、MT-TV、MT-TF、MT-RNR2、MT-TK、MT-TQ和MT-TH，其中文獻報道最多的是MT-TLl基因［10-14］。人類的MTTLl基因全長為75 bp（np3230-np3304），編碼tR?NALeu（UUR）基因，在線粒體內(nèi)負責(zé)轉(zhuǎn)運亮氨酸，tR?NALeu（UUR）基因含有78個堿基，能夠識別UUA與UUG兩個密碼子［15-16］。目前報道有8個MT-TLl點突變與MELAS綜合征相關(guān)，其中3243 A>G是最常見的突變位點［17］。EL-HATTAB等［18］報道約80%的MELAS綜合征患者為3243 A>G突變。本研究中71.43%（30/42）的患者發(fā)生3243 A>G突變，稍低于上述報道，但與PICARD等［19］報道54.6%～72.3%的MELAS綜合患者為3243 A>G突變基本一致。mtD?NA亮氨酸t(yī)RNA基因3243 A>G導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止，影響了tRNA的甲基化、氨酰化及蛋白質(zhì)合成，造成線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ和Ⅳ的活性出現(xiàn)缺陷，氧化磷酸化障礙、能量供應(yīng)不足，從而導(dǎo)致一系列的臨床癥狀［20］。本組30例3243 A>G突變患者主要表現(xiàn)為卒中樣發(fā)作、頭痛、癲癇、智能減退、聽力下降、精神異常、身材矮小、不耐受疲勞、視力下降和多毛等。

既往研究報道MELAS綜合征患者約10%為3271 T＞C突變，其他突變占10%［21］。本組僅3例3271 T＞C，占7.14%（3/42），推測可能與人種有關(guān)，也可能與樣本量較小有關(guān)。近年來國內(nèi)外陸續(xù)報道了60余例13513 G＞A突變導(dǎo)致的MELAS綜合征［22-23］。本研究通過行mtDNA全長測序發(fā)現(xiàn)，7.14%的患者出現(xiàn)13513 G＞A，是本組患者中第三大常見的突變位點，提示可以將13513 G＞A作為MELAS綜合征的熱點突變進行篩查。13513 G＞A位于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（nicotinamide adenine dinucleo?tide，NADH）5基因上，是最常見的mt DNA ND5所編碼的基因突變［24］。13513 G＞A突變主要可引起ME?LAS綜合征、Leigh綜合征以及MELAS-Leigh疊加綜合征，這些臨床表型可能與年齡有一定的關(guān)系。13513 G＞A突變引起的MELAS綜合征常見于成年人，而其所致的Leigh綜合征常見于嬰幼兒，MELASLeigh疊加綜合征較罕見。本研究中3例13513 G＞A突變，發(fā)病年齡分別為26、19.5和23歲，與既往報道一致［25］。

本研究除發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外報道過的mtDNA 3243 A＞G、13513 G＞A、3302 A＞G、1642 G＞A、3271 T＞C和3256 C＞T突變位點以外［26］，還發(fā)現(xiàn)了3093 C＞G、3697 G＞A和15242 G＞A突變，這3個突變國外已經(jīng)報道［27-29］，而國內(nèi)尚未見報道。患者15主要表現(xiàn)為頭痛、癲癇、聽力下降，發(fā)生3093 C＞G突變，3093 C＞G位于16S rRNA亞基，突變時將導(dǎo)致16S rRNA亞基的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，造成線粒體氧化磷酸化障礙。患者17主要表現(xiàn)為卒中樣發(fā)作、智能減退、視力下降，發(fā)生3697 G＞A突變，其母親存在相同的3697 G＞A突變，但無臨床表現(xiàn)。MT-NDl編碼呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ，該酶是線粒體內(nèi)膜上完成電子傳遞過程的關(guān)鍵酶［30］。m3697位于MT-NDl區(qū)域，當正常的G堿基突變?yōu)锳堿基時，導(dǎo)致第131位甘氨酸被錯誤地翻譯成絲氨酸（p.Gly 131 Ser），改變了MT-ND1的空間結(jié)構(gòu)，從而影響NADH脫氫酶的活性，造成ATP合成減少、細胞能量供應(yīng)不足?；颊?4主要表現(xiàn)為智能減退、身材矮小、多毛、不耐受疲勞，發(fā)生15242 G＞A突變，m15242位于mtDNA MT-CYB基因上，當正常的G堿基突變?yōu)锳堿基時，第166位甘氨酸密碼子（GGA）轉(zhuǎn)換成終止密碼子（AGA），導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止，線粒體氧化磷酸化發(fā)生障礙。在線粒體內(nèi)膜上，呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ是氧化磷酸化電子傳遞過程中的第二個酶，其突變或缺失會影響催化電子從還原型輔酶Q到細胞色素C的轉(zhuǎn)運，且將質(zhì)子從線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)移到膜外。呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ含有11個亞單位，1個由mtDNA編碼，10個由nDNA編碼，而線粒體細胞色素b（mitochondria cytochrome b，MT-CYB）是呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ中唯一由mtDNA編碼的亞基，是一種高度保守的疏水蛋白，含有2個血紅素基團和8或9個跨膜區(qū)，MT-CYB與核心蛋白Ⅰ、Ⅱ共同構(gòu)成呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ的中心成分［31］。因此，MT-CYB基因的突變或缺失將直接影響線粒體氧化磷酸化的過程。本組病例中3093 C＞G、3697 G＞A和15242 G＞A突變所致的MELAS綜合征是國內(nèi)首次報道，國外關(guān)于這3個位點的突變也僅有少量報道，因此，這3個突變在國內(nèi)人群中導(dǎo)致的MELAS綜合征的臨床癥狀與突變率的關(guān)系無法考證，需要更多的病例積累，具體的發(fā)病機制有待進一步研究。

本研究中30例患者發(fā)生3243 A＞G突變，血液檢出25例發(fā)生3243 A＞G突變，突變率22.15%～100%（36.26±13.38）%；尿液檢出30例發(fā)生3243 A＞G突變，突變率38.46%～100%（59.49±22.67）%；與外周血的mtDNA突變率相比，尿液細胞的突變率顯著增高（P<0.05）。目前，尿液細胞的mtDNA突變率明顯高于外周的機制并不明確，有研究認為血外周血細胞對能量需求大、分裂速度快，可能會自然選擇地淘汰mtDNA突變率高的細胞［32］。LAAT等［33］對8例3243 A＞G突變患者從剛出生時的外周血細胞到確診MELAS綜合征（相隔8～20 a）時的外周血細胞的突變率進行縱向比較發(fā)現(xiàn)，外周血的mtDNA突變率進行性降低，平均每年減少1.42%。有學(xué)者認為存在于生命周期短的細胞、對細胞傷害較輕的mtDNA突變，不會對細胞生存產(chǎn)生壓力，允許突變的mtDNA積累等［34］。尿液細胞的DNA主要來源于腎臟和輸尿管的上皮細胞，雖然上皮細胞屬于分裂旺盛的細胞，但上皮細胞耗氧量小，允許突變的mtDNA積累，因此外周血的mtDNA突變率明顯低于尿液細胞。FIN?STERER等［35］等通過對比MELAS綜合征患者血液、尿液、唾液、肌肉細胞和毛囊的mtDNA突變率發(fā)現(xiàn)，血液、尿液和唾液細胞的mtDNA突變率較低，肌肉細胞的突變率最高，而尿液細胞的突變率與肌肉細胞相差無幾。但肌肉取材為有創(chuàng)性檢查，且不適用于無癥狀親屬的篩查。由于尿液無創(chuàng)、容易獲得、突變率高，可作為MELAS綜合征患者及親屬基因測序首選的標本。

本研究共發(fā)現(xiàn)20例患者的母親、外婆、舅舅、兄弟姐妹或兒女存在相同的突變位點，父親均未發(fā)現(xiàn)突變位點，符合母系遺傳。由于受精卵中線粒體的只來源于卵細胞，mtDNA只能從母親傳遞給子女，然后由她的女兒傳遞給后代，mtDNA傳遞至兒子后即終止，父親不能將線粒體基因傳遞給后代，所以ME?LAS綜合征為母系遺傳。17例患者的母親或其他親屬的尿液細胞發(fā)生3243 A＞G突變位點，突變率24.34%～89.26%（45.82±14.18）%，其中15例有臨床表現(xiàn)，輕重不一，2例無臨床表現(xiàn)。閾效應(yīng)和異質(zhì)性可能是患者親屬發(fā)生基因突變但無臨床表現(xiàn)的原因。

MELAS綜合征為母系遺傳，3243 A＞G是最常見的突變位點。臨床懷疑MELAS綜合征時，可先檢測3243 A＞G、3252 A＞G、3271 T＞C、8344 A＞G和13513 G＞A等熱點突變，這樣可確診約90%的患者，當熱點突變陰性時再行mtDNA全長基因測序，若仍為陰性，必要時可進行nDNA測序，這是一種經(jīng)濟、有效的方法。尿液細胞的mtDNA突變率高于外周血，可作為MELAS綜合征患者及親屬基因測序首選的標本。本研究還發(fā)現(xiàn)3697 G＞A、1642 G＞A和15242 G＞A突變?yōu)閲鴥?nèi)首次報道，豐富了國內(nèi)ELAS綜合征線粒體基因突變的特點。MELAS綜合征的發(fā)病機制是十分復(fù)雜的，受mtDNA和nDNA兩套遺傳體系共同調(diào)控，目前國外的研究重心逐漸從單個mtDNA突變位點轉(zhuǎn)移到多個突變位點的復(fù)合突變研究，由mtDNA組到nDNA組突變的研究。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用和新技術(shù)的不斷發(fā)展，許多新的突變位點、復(fù)合突變和nDNA組突變將會被發(fā)現(xiàn)，將有助于闡明MELAS綜合征的發(fā)病機制。對MELAS綜合征認識的深入，也為該病的診治和遺傳咨詢提供依據(jù)。