張凱 ，郭紫微 ，王倩 ，韓雅 ，李貺家，張中帥

1.信陽(yáng)師范學(xué)院地理科學(xué)學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000；2.河南省水土污染協(xié)同防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/信陽(yáng)師范學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000；3.水利部發(fā)展研究中心，北京 100038

抗生素耐藥性導(dǎo)致的環(huán)境問(wèn)題近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注（朱永官等，2018）。環(huán)境中殘留的抗生素促進(jìn)了環(huán)境中微生物抗藥性的發(fā)展，導(dǎo)致環(huán)境中抗性細(xì)菌的大量繁殖（Jiang et al.，2018）。環(huán)境中的抗性細(xì)菌（Antibiotic resistant bacteria，ARB）會(huì)通過(guò)水平轉(zhuǎn)移的方式將抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）傳播到病原菌中，從而對(duì)人體健康產(chǎn)生威脅（Allen et al.，2010；Yang et al.，2018）。目前，針對(duì)各個(gè)環(huán)境介質(zhì)中ARGs及ARB中的研究層出不窮。大量研究結(jié)果表明，空氣、水及土壤等介質(zhì)中均有不同程度的ARGs及ARB污染，環(huán)境中ARGs及ARB污染已不容忽視（Jiang et al.，2018；Yang et al.，2018；García et al.，2020）。

湖庫(kù)型水源地與人體健康密切，其用水安全也是最引人重視的研究之一。Han et al.（2020）的研究結(jié)果表明，即便經(jīng)過(guò)飲用水處理設(shè)施的深度處理，湖庫(kù)型水源地中的菌落結(jié)構(gòu)仍能夠?qū)︼嬘盟械木航M成造成直接影響。這一結(jié)果進(jìn)一步凸顯了研究湖庫(kù)型水源地環(huán)境中耐藥菌的重要性。近年來(lái)，大量研究分析了湖庫(kù)環(huán)境中ARGs及ARB污染現(xiàn)狀（Pang et al.，2015；Nnadozie et al.，2019；Chen et al.，2019；Dang et al.，2020）。結(jié)果表明，湖庫(kù)環(huán)境中也受到了一定程度的 ARB污染，且不同地區(qū)ARB的污染狀況不盡相同。

華中地區(qū)為中國(guó)七大地理分區(qū)之一，其包括河南、湖北、湖南三省。該地區(qū)總面積約56×104km2，占全國(guó)國(guó)土總面積的約5.9%。截至2017年底，華中地區(qū)常住人口約2.23億人，生產(chǎn)總值約11.61萬(wàn)億元，人均生產(chǎn)總值約5.20萬(wàn)元。隨著近年來(lái)華中地區(qū)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，該地區(qū)社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位日益凸顯。然而，經(jīng)濟(jì)及工業(yè)的高速發(fā)展造成了該地區(qū)環(huán)境質(zhì)量的惡化（彭佳雯等，2011；繆羽晨等，2019）。水庫(kù)是華中地區(qū)最重要的飲用水來(lái)源，在促進(jìn)該地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和繁榮、保障居民身體健康方面的作用不可替代。然而，目前缺乏對(duì)該地區(qū)供水水庫(kù)ARB賦存狀況綜合性的調(diào)查。因此，亟需研究明確華中地區(qū)水庫(kù)型水源地 ARB的分布特征，為控制該地區(qū)水庫(kù)環(huán)境 ARB及抗生素污染提供理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支撐。

基于以上背景，本研究選取了華中地區(qū) 11個(gè)大型水庫(kù)型水源地，分析了水樣和底泥中耐藥菌的分布規(guī)律。本研究的主要目標(biāo)有：（1）明確華中地區(qū)水庫(kù)型水源地中耐藥細(xì)菌的污染特征；（2）分析華中地區(qū)水庫(kù)型水源地不同環(huán)境介質(zhì)中耐藥細(xì)菌的分布差異。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

本實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：BSD-400恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），T100PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Biorad），SW-CJ-1G無(wú)菌超凈工作臺(tái)（上海滬凈醫(yī)療器械有限公司），YM75Z高壓蒸汽滅菌器（上海三申醫(yī)療器械有限公司）。

本實(shí)驗(yàn)所用主要試劑包括：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（美國(guó)Axygen），瓊脂糖（北京鼎國(guó)生物有限公司），50×TAE（天津莫克曼生物科技有限公司），PCRmix（南京諾維贊生物科技有限公司），瓊脂粉、酵母粉以及蛋白胨均購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限公司），磺胺甲惡唑、氨芐西林、四環(huán)素、諾氟沙星以及鏈霉素均購(gòu)于大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.2 水樣和底泥的采集與保存

本研究從華中地區(qū)選取了 11個(gè)供水水庫(kù)（圖1），其中4個(gè)水庫(kù)選自河南（HN1，HN2，HN3，HN4），3個(gè)水庫(kù)選自湖北（HB1，HB2，HB3），4個(gè)水庫(kù)選自湖南（HU1，HU2，HU3，HU4）。樣品于2019年10—11月進(jìn)行。采集樣品時(shí)，每個(gè)水庫(kù)庫(kù)區(qū)分別設(shè)定一個(gè) 10000 m2的正方形區(qū)域，在該區(qū)域的4個(gè)頂點(diǎn)和中心位置各取1 L子水樣和20 g左右的表層沉積物。從每個(gè)子樣各取400 mL水和5 g沉積物樣品，分別于2.5 L采樣瓶中和無(wú)菌自封袋中混合均勻，在4 ℃條件下運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

圖1 華中地區(qū)水庫(kù)采樣點(diǎn)示意圖Fig.1 Sampling sites of water supply reservoirs in central China

1.3 水樣和沉積物可培養(yǎng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)

采用 10倍梯度稀釋法對(duì)水樣細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)以及計(jì)數(shù)。將每個(gè)取樣點(diǎn)所取水樣用無(wú)菌PBS稀釋4個(gè)梯度，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行。每個(gè)樣品分取50 μL于LB固體培養(yǎng)基上涂布，于37 ℃培養(yǎng)48 h，隨后取合適梯度對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

以5 mL無(wú)菌離心管為容器，在無(wú)菌條件下準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g沉積物樣品。隨后向離心管加入2 mL無(wú)菌PBS溶液，充分混勻后吸取200 μL至新的5 mL無(wú)菌離心管中進(jìn)行10倍梯度稀釋。每個(gè)采樣點(diǎn)稀釋5個(gè)梯度，此后所有實(shí)驗(yàn)參數(shù)均與水樣10倍梯度法相同。

1.4 抗生素耐藥菌篩選

本研究選取的各類(lèi)抗生素的最終濃度及參考文獻(xiàn)如表1所示。

表1 抗生素濃度信息Table 1 Related information of antibiotic concentration in this study

水樣和沉積物樣品按照10倍梯度稀釋法（0.5 mL+4.5 mL）分別稀釋2個(gè)梯度和3個(gè)梯度，每個(gè)梯度分別設(shè)置3個(gè)平行，分別吸取50 μL樣品均勻涂布于抗性平板上。以未添加抗生素的平板為對(duì)照，平板倒置于37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，隨后取合適梯度對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)（劉珊珊等，2018）。

1.5 耐藥菌株鑒定

從抗性平板上隨機(jī)挑選菌落形態(tài)有明顯差異的細(xì)菌進(jìn)行劃線培養(yǎng)（葉繁等，2019），將純化后的單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，將菌液用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。采用Nanodrop 2000核酸蛋白定量?jī)x測(cè)定提取DNA的質(zhì)量以及純度。以細(xì)菌基因組DNA為模板，采用25 μL體系對(duì)細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增。體系組成為：12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix，上、下游引物各 1 μL，1 μL DNA 模板，9.5 μL 雙蒸水。正向引物序列27F為：5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′，反向引物1492R為：5′-ACGGTTACC TTGTTACGACTT-3′。PCR產(chǎn)物立即于低溫條件下送往北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果確定細(xì)菌種屬。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。熱圖、相關(guān)性熱圖分別用R 3.6.1的 ggplot2及 ggcorrplot包繪制；mantel分析用 R 3.6.1的vegan包進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 華中地區(qū)水庫(kù)型水源地上覆水中抗生素抗性細(xì)菌的分布特征

華中地區(qū)水庫(kù)型水源地 ARB的分布特征如圖2所示。各省水庫(kù)上覆水和沉積物中ARB分布不存在顯著性差異（t檢驗(yàn)，P>0.05），表明華中地區(qū)水庫(kù)型水源地上覆水中ARB分布不存在地域性差異。華中地區(qū)各省的養(yǎng)殖業(yè)均比較發(fā)達(dá)。2016年華中地區(qū)各省豬、牛和羊的總量占全國(guó)總量的比例均比較接近?？股卦陴B(yǎng)殖業(yè)的使用是造成環(huán)境中細(xì)菌耐藥性的重要因素。因此，華中地區(qū)相近的養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模導(dǎo)致了該地區(qū)水庫(kù)中ARB不存在地域性差異。

圖2 華中地區(qū)水庫(kù)型水源地抗生素抗性細(xì)菌的分布特征Fig.2 ARB distribution pattern in water supply reservoirs of central China

上覆水和沉積物中豐度最高的兩類(lèi) ARB均是磺胺類(lèi) ARB（上覆水中平均相對(duì)豐度為 8.9%，在所有耐藥菌中的占比為45%；沉積物中平均豐度為7.0%，占耐藥菌總量的 54%）和 β-內(nèi)酰胺類(lèi) ARB（上覆水中平均豐度為8.1%，在所有耐藥基因中的占比為38%；沉積物中平均豐度為3.2%，占耐藥菌總量的 27%），這可能與其對(duì)應(yīng)抗生素的使用及特性有關(guān)?；前奉?lèi)抗生素有較長(zhǎng)的使用歷史且仍是目前使用量最大的抗生素之一，每年有將近2000 t磺胺類(lèi)抗生素被釋放到生物圈（Qiu et al.，2006）。此外，其具有較好的水溶性且難以降解，因此可以在環(huán)境中持續(xù)積累并提供選擇性壓力（Zhang et al.，2020）。此外，以氨芐青霉素為代表的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素近年來(lái)在醫(yī)療和畜牧業(yè)中被廣泛使用，Zhang et al.（2015）的研究結(jié)果表明，中國(guó)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素使用量為 34100 t，占中國(guó)抗生素總使用量的21%。因此，磺胺類(lèi)和β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的大量使用可能是導(dǎo)致水庫(kù)上覆水中 ARB廣泛存在的重要因素。

喹諾酮類(lèi)ARB在本研究選取的5種抗生素中豐度最低，這可能和喹諾酮類(lèi)抗生素本身的性質(zhì)有關(guān)。排放到環(huán)境中的喹諾酮類(lèi)抗生素并不穩(wěn)定，光照、水和生物作用均能促進(jìn)其降解。此外，水體環(huán)境中喹諾酮類(lèi)抗生素能通過(guò)吸附作用蓄積于沉積物中（孟磊等，2015）。以往關(guān)于水庫(kù)環(huán)境中抗生素的研究表明，喹諾酮類(lèi)抗生素平均濃度低于四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素（廖杰等，2020）。因此，水庫(kù)中喹諾酮較低的含量可能是導(dǎo)致相應(yīng) ARB豐度較低的重要因素。與上覆水相比，沉積物四環(huán)素類(lèi)抗生素占比增高，這可能和沉積物對(duì)四環(huán)素有較強(qiáng)的吸附性能有關(guān)。土壤對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素的吸附能力和吸附容量高于其他類(lèi)別的抗生素（伊麗麗等，2013），導(dǎo)致沉積物中ARB豐度相應(yīng)增加。

2.2 沉積物和上覆水中耐藥菌的豐度關(guān)系

由圖2可知，本研究選取的ARB在大部分采樣點(diǎn)均能檢出，且當(dāng)ARB在水庫(kù)上覆水中檢出時(shí)，其在沉積物中也往往能被檢出。該結(jié)果表明，上覆水與沉積物 ARB的賦存特征存在較強(qiáng)聯(lián)系。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步采用了mantel分析評(píng)估了沉積物和上覆水中 ARB的豐度關(guān)系。結(jié)果表明，華中地區(qū)水庫(kù)型水源地沉積物和上覆水中 ARB豐度呈顯著性正相關(guān)（r=0.472，P=0.026，permutations=9999），表明水庫(kù)沉積物和上覆水ARB組成相似。沉積物是污染物的“匯”和“源”，包括ARB在內(nèi)的污染物通過(guò)吸附、沉降等作用匯集在沉積物上（姜春霞等，2019）。當(dāng)水體發(fā)生擾動(dòng)時(shí)，吸附于沉積物中的污染物又重新釋放到上覆水中（張皓清等，2020）。相對(duì)于河海等環(huán)境介質(zhì)，湖庫(kù)環(huán)境水體流動(dòng)相對(duì)緩慢，沉積物和水交換能力也相對(duì)較弱。但湖庫(kù)有增強(qiáng)水和沉積物之間物質(zhì)交換的途徑。本研究樣品采集工作于10月及11月進(jìn)行，晝夜溫差較大，因此易造成“翻湖”現(xiàn)象，該途徑能夠增強(qiáng)水和沉積物之間的物質(zhì)交換（陸桂華等，2009）。

本研究通過(guò) Spearman相關(guān)性分析探索了不同類(lèi)別ARB的共現(xiàn)關(guān)系，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，多數(shù)耐藥菌之間都具有一定的正相關(guān)關(guān)系。其中四環(huán)素類(lèi)ARB及氨基糖苷類(lèi)ARB均與三類(lèi)耐藥基因有顯著性正相關(guān)。有研究表明，中國(guó)往往采用數(shù)種抗生素聯(lián)用的方式治療疾?。≦iao et al.，2018）。因此，環(huán)境中不同種類(lèi)抗生素的共選擇作用是不同類(lèi)別ARB豐度具有相關(guān)性的因素之一。

圖3 不同類(lèi)別ARB的共現(xiàn)關(guān)系Fig.3 Co-occurrence patterns among different ARB types

2.3 菌種鑒定結(jié)果

本研究根據(jù)細(xì)菌形態(tài)的不同，選取了 26 個(gè)菌株進(jìn)行菌種鑒定，共鑒定出8種菌屬。其中氣單胞菌屬（Aeromonas，9株，34.6%）及不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，7株，26.9%）檢出率最高。此外，腸桿菌屬（Enterobacter）、芽孢桿菌屬（bacillus）以及假單胞菌屬（Pseudomonas）均檢出2株；希瓦氏菌屬（Shewanella）、紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）以及類(lèi)芽孢桿菌屬（Paenibacillus）均檢出1株。氣單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬以及芽孢桿菌屬均為人體條件致病菌，在人體免疫力下降時(shí)能夠引起人體胃腸道、肺部感染（葉繁等，2019）。本研究篩選的氣單胞菌屬及不動(dòng)桿菌屬均對(duì)3種以上抗生素有抗性，這兩種菌屬的多重抗性可能會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生威脅。此外，本研究還篩選出了能夠與人體腸道密切相關(guān)的腸桿菌屬細(xì)菌，兩株細(xì)菌均分離自沉積物中，表明水庫(kù)沉積物一定程度上受到糞源污染。兩株細(xì)菌分別對(duì)磺胺類(lèi)抗生素及四環(huán)素類(lèi)抗生素表現(xiàn)出耐藥性，表明陸源輸入也可能是導(dǎo)致水庫(kù) ARB細(xì)菌廣泛分布的原因之一。

本研究同時(shí)對(duì)水樣和沉積物細(xì)菌總數(shù)（Total heterotrophic bacteria count，HPC）進(jìn)行了計(jì)數(shù)（表2）。結(jié)果表明華中地區(qū)供水水庫(kù) HPC低于山東省湖泊環(huán)境（錢(qián)巖等，2013）及華中地區(qū)非供水湖泊（孫增靈等，2011）中HPC數(shù)量。中國(guó)飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定 HPC 總量不得超過(guò) 1.00×102CFUs·mL?1。以往研究表明，飲用水處理工藝對(duì)細(xì)菌的去除效果極為明顯（Zhang et al.，2020）。因此，雖然華中地區(qū)供水水庫(kù)受陸源輸入細(xì)菌影響，但華中地區(qū)水庫(kù)型水源地較少的細(xì)菌數(shù)量能夠在一定程度上保證飲用水水質(zhì)。

表2 華中地區(qū)水庫(kù)上覆水和沉積物的總異養(yǎng)菌數(shù)Table 2 Total heterotrophic bacteria count of water supply reservoirs in central China

3 結(jié)論

（1）磺胺類(lèi)和四環(huán)素類(lèi) ARB是華中地區(qū)水庫(kù)型水源地豐度最高的兩類(lèi)ARB。

（2）華中地區(qū)水庫(kù)型水源地沉積物和上覆水中的ARB含量沒(méi)有顯著性差異。

（3）華中地區(qū)水庫(kù)型水源地多數(shù)耐藥菌之間具有一定的共現(xiàn)關(guān)系。

（4）水庫(kù)型水源地的一些條件致病菌具有3種以上多重抗性，由此導(dǎo)致的潛在風(fēng)險(xiǎn)值得關(guān)注。