陳 微,孫克偉,葉錫勇

(1湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染性疾病科,長沙 410000;2湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病科;3湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院感科)

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)是在肝硬化、慢性肝炎、慢性膽汁淤積性肝病等慢性肝病基礎(chǔ)上發(fā)生的急性或亞急性肝功能失代償綜合征,常伴隨一個(gè)甚至多個(gè)器官功能衰竭,病情進(jìn)展迅速,病死率高[1,2]。目前臨床采用抗病毒、肝移植、人工肝等治療手段治療ACLF,明顯降低了病死率,但總體治療效果仍不夠理想[3]。研究認(rèn)為,肝組織在肝衰竭過程中經(jīng)受免疫損傷、缺血缺氧性損傷及內(nèi)毒素血癥三重致死性打擊,炎癥反應(yīng)是該病理進(jìn)展過程的中心環(huán)節(jié)[4]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)是細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體,能激活核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路,誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),參與多種疾病的炎癥損傷過程[5,6]。已有研究顯示,TLR4/NF-κB通路參與肝衰竭過程[7]。附子理中湯是傳統(tǒng)中藥湯劑,能顯著改善缺血再灌注急性腎損傷大鼠的腎功能,改善非酒精性脂肪肝大鼠肝臟病理變化,但對ACLF的影響尚鮮有研究[8,9]。本研究將觀察附子理中湯對ACLF大鼠肝損傷的減輕作用,并從炎癥反應(yīng)方面探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠,體質(zhì)量200-230 g,購于上海靈暢生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2018-0003。飼養(yǎng)條件:自由飲水、進(jìn)食,溫度為22-26 ℃,相對濕度為40%-70%,12 h照明/12 h黑暗。

1.1.2 主要試劑 附子理中湯配制:人參9 g,白術(shù)9 g,干姜9 g,炙甘草6 g,炮附子9 g,加4倍的水煎煮60 min,過濾,濾渣加3倍的水煎煮40 min,過濾,濾渣加入2倍的水煎煮30 min,過濾,將3次濾液混合,低溫放置1 d,過濾,使用水浴將濾液濃縮成生藥含量1.5 g/ml的藥液,4 ℃存放備用。乳果糖(貨號(hào):L77521)購自上海吉至生化科技有限公司;大鼠內(nèi)毒素、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)酶聯(lián)免疫(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(貨號(hào):HL20392、HL20064、HL20700、HL20040)購自上海哈靈生物科技有限公司;HE染色試劑盒(貨號(hào):RS3390-3)購自金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司;TLR4抗體、NF-κB p-p65抗體、NF-κB p65抗體、GAPDH抗體、羊抗兔IgG(貨號(hào):ab13867、ab239882、ab16502、ab186930、ab133470)購自美國Abcam公司。

1.1.3 主要儀器 AU5800型全自動(dòng)生化分析儀購自美國Beckman公司;MK3型酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司;CKX41SF型顯微鏡購自日本Olympus公司;GS-800型凝膠掃描成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)造模及分組、給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,參照叢偉[10]造模方法,建立ACLF大鼠模型,共分為兩個(gè)階段。①構(gòu)建大鼠膽汁淤積性肝硬化模型:大鼠禁食12 h后進(jìn)行結(jié)扎膽總管手術(shù),用4%水合氯醛對大鼠行腹腔注射麻醉(0.7 ml/100 g),腹部備皮,無菌消毒,打開腹腔,分離大鼠膽總管,用4-0絲線結(jié)扎,從結(jié)扎中間段將膽總管剪斷,用生理鹽水清洗腹腔后縫合,膽管結(jié)扎4周后存活的大鼠即已成功建立膽汁淤積性肝硬化模型。②建立大鼠ACLF模型:取已成功建立膽汁淤積性肝硬化模型的大鼠,禁食12 h,按0.2 g/kg給予大鼠0.2 g/ml D-氨基半乳糖溶液腹腔注射,24 h后即可在誘導(dǎo)肝硬化基礎(chǔ)上誘導(dǎo)急性肝損傷,建立大鼠ACLF模型。

將成功建立ACLF模型的40只大鼠分為ACLF組、陽性組和附子理中湯低、中、高劑量組,每組8只大鼠,另取8只不造模的大鼠為對照組。附子理中湯低、中、高劑量組大鼠分別灌胃7.5,15,30 g/kg附子理中湯[11],陽性組大鼠灌胃13.5 g/kg乳果糖[12],對照組、ACLF組大鼠灌胃等量生理鹽水,每日1次,連續(xù)給藥兩周。

1.2.2 大鼠肝功能測定 末次給藥24 h后,按0.7 ml/100 g給予大鼠4%水合氯醛腹腔注射麻醉,將大鼠以仰臥位在解剖臺(tái)上固定,開腹采集下腔靜脈血3-5 ml,血液樣品經(jīng)室溫靜置30 min后3 000 r/min離心15 min,分離上清,分為兩份。一份血清用生化分析儀檢測血清門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、總膽紅素(total bilirubin,TBil)、前白蛋白(prealbumin,PA)水平。

1.2.3 ELISA法檢測大鼠血清內(nèi)毒素及炎癥相關(guān)因子表達(dá)情況 剩余一份血清使用內(nèi)毒素、IL-6、IL-8、TNF-α ELISA試劑盒,按照試劑盒說明書操作步驟,檢測血清內(nèi)毒素及IL-6、IL-8、TNF-α水平。

1.2.4 大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察 大鼠開腹采集下腔靜脈血后,均剪取同一葉肝組織,用生理鹽水清洗,分為兩份。一份用于Western blot檢測,另一份置于10%中性甲醛溶液中固定,常規(guī)石蠟包埋,切片,脫蠟,HE染色,顯微鏡觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)。

1.2.5 蛋白印跡(Western blot)法檢測大鼠肝組織中TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 剩余一份肝組織在冰上裂解提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,蛋白樣品變性后行SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,脫脂奶粉封閉1 h,加入一抗(TLR4抗體、NF-κB p-p65抗體、NF-κB p65抗體、GAPDH抗體,1 ∶1 000)孵育過夜,用TBST洗滌,加羊抗兔IgG二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記,1 ∶2 000)孵育1 h,ECL顯色曝光,凝膠掃描成像系統(tǒng)掃描圖像,分析條帶灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝功能指標(biāo)

與對照組相比,ACLF組大鼠血清AST、ALT、TBil水平顯著升高(P<0.05),PA水平顯著降低(P<0.05);與ACLF組相比,陽性組與附子理中湯低、中、高劑量組大鼠血清AST、ALT、TBil水平顯著降低(P<0.05),PA水平顯著升高(P<0.05);陽性組與附子理中湯低劑量組大鼠血清AST、ALT、TBil、PA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與陽性組相比,附子理中湯中、高劑量組大鼠血清AST、ALT、TBil水平顯著降低(P<0.05),PA水平顯著升高(P<0.05);隨著附子理中湯劑量的升高,大鼠血清AST、ALT、TBil水平顯著降低(P<0.05),PA水平顯著升高(P<0.05,見表1)。

表1 各組大鼠血清AST、ALT、TBil、PA水平比較

2.2 各組大鼠血清內(nèi)毒素及炎癥相關(guān)因子表達(dá)情況

與對照組相比,ACLF組大鼠血清內(nèi)毒素、IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著升高(P<0.05);與ACLF組相比,陽性組與附子理中湯低、中、高劑量組大鼠血清內(nèi)毒素、IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著降低(P<0.05);陽性組與附子理中湯低劑量組大鼠血清內(nèi)毒素、IL-6、IL-8、TNF-α水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與陽性組相比,附子理中湯中、高劑量組大鼠血清內(nèi)毒素、IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著降低(P<0.05);隨著附子理中湯劑量的升高,大鼠血清內(nèi)毒素、IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著降低(P<0.05,見表2)。

表2 各組大鼠血清內(nèi)毒素、IL-6、IL-8、TNF-α水平比較

2.3 各組大鼠肝組織病理形態(tài)

對照組大鼠肝組織中細(xì)胞排列整齊,無變性、壞死,未見炎性細(xì)胞浸潤;ACLF組大鼠肝組織中肝細(xì)胞可見片狀壞死,可見炎細(xì)胞浸潤及纖維組織增生;陽性組及附子理中湯低、中、高劑量組肝組織病理損傷較ACLF組均有不同程度地減輕(見圖1)。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態(tài) (HE染色,×200)Figure 1 Pathological morphology of liver tissue of rats in each group (HE staining,×200)

2.4 各組大鼠肝組織中TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與對照組相比,ACLF組大鼠肝組織中TLR4、NF-κB p-p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與ACLF組相比,陽性組和附子理中湯低、中、高劑量組大鼠肝組織中TLR4、NF-κB p-p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);陽性組與附子理中湯低劑量組大鼠肝組織中TLR4、NF-κB p-p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與陽性組相比,附子理中湯中、高劑量組大鼠肝組織中TLR4、NF-κB p-p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);隨著附子理中湯劑量的升高,大鼠肝組織中TLR4、NF-κB p-p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05,見圖2、表3)。

表3 各組大鼠肝組織中TLR4、NF-κB p-p65、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較

圖2 各組大鼠肝組織中TLR4、NF-κB p-p65、NF-κB p65蛋白表達(dá)情況Figure 2 Expression of TLR4,NF-κB p-p65,NF-κB p65 proteins in liver tissue of rats in each group

3 討論

ACLF是在慢性肝病基礎(chǔ)上短期內(nèi)出現(xiàn)的急性或亞急性肝功能失代償?shù)呐R床癥候群,臨床主要表現(xiàn)為極度乏力、黃疸迅速加深、出血傾向、明顯的消化道癥狀、失代償性腹水等,疾病進(jìn)展快,3個(gè)月病死率可高達(dá)50%[13]。由于肝源缺乏,肝移植治療具有明顯的限制,目前ACLF治療仍以內(nèi)科藥物治療為主。因此,尋找高效的ACLF治療藥物備受人們重視。叢偉[10]建立ACLF模型方法較其他造模方法具有簡單、快速、有效、便于臨床藥物研究的特點(diǎn),故本研究采用其造模方法建立ACLF模型。HE染色可見ACLF組大鼠肝組織中肝細(xì)胞存在片狀壞死,可見炎細(xì)胞浸潤及纖維組織增生,血清檢測可見肝功能指標(biāo)AST、ALT、TBil、內(nèi)毒素及炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著升高,PA水平顯著降低,提示大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇,大鼠肝臟功能已明顯惡化,肝臟對內(nèi)毒素的滅活能力明顯下降。

附子理中湯是傳統(tǒng)中藥湯劑,由白術(shù)、人參、炙甘草、干姜和炮附子配制而成,其中,人參的主要成分人參皂苷具有保肝、護(hù)肝作用;炙甘草的活性成分甘草素具有抗炎、抗氧化作用,能抑制肝纖維化[14,15]。譚瑋璐等[16]研究發(fā)現(xiàn),附子理中湯可能通過調(diào)節(jié)腸道黏膜NALP-3炎性體,減少腸道炎性物質(zhì)釋放,并降低過強(qiáng)的免疫應(yīng)答,改善腹瀉型腸易激綜合征癥狀。張艷曉等[17]研究顯示,附子理中湯治療脾腎陽虛型潰瘍性結(jié)腸炎具有較好的療效,其作用機(jī)制可能與降低血清促炎因子及細(xì)胞間黏附因子表達(dá)水平有關(guān)。楊家耀等[9]研究表明,附子理中湯能減輕非酒精性脂肪肝大鼠肝臟損傷,降低炎癥因子釋放。本研究結(jié)果顯示,使用附子理中湯治療ACLF大鼠后,可見大鼠肝組織病理損傷減輕,同時(shí)大鼠血清AST、ALT、TBil、內(nèi)毒素、IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著降低,PA水平顯著升高,且隨著劑量的升高,其療效也在不斷提高,提示附子理中湯能降低ACLF大鼠體內(nèi)炎癥水平,改善肝組織損傷,提高大鼠肝功能,加強(qiáng)肝臟對內(nèi)毒素的滅活能力。研究發(fā)現(xiàn),乳果糖、腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑等能改善ACLF患者預(yù)后,其作用機(jī)制可能與降低炎癥反應(yīng)及內(nèi)毒素血癥有關(guān)[12]。乳果糖是一種人工合成雙糖,不被胃腸黏膜雙糖酶分解,能調(diào)節(jié)腸道菌群,減少腸道內(nèi)毒素產(chǎn)生[18]。本研究采用乳果糖作為陽性藥物判斷附子理中湯對ACLF的療效,結(jié)果顯示,中、高劑量的附子理中湯療效均高于乳果糖,提示附子理中湯治療ACLF在減少腸道內(nèi)毒素產(chǎn)生、減輕肝臟損傷、降低炎癥反應(yīng)方面療效甚佳,具有一定臨床價(jià)值。

TLR4/NF-κB信號(hào)通路是誘發(fā)炎癥反應(yīng)的重要通路,抑制其激活能抑制肝纖維化,進(jìn)而改善肝功能[19]。Du等[20]研究發(fā)現(xiàn),Kaempferol保護(hù)肝細(xì)胞免受Acetaminophen肝毒性的作用機(jī)制與抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。馬威等[21]研究表明,附子理中湯能減輕非酒精性脂肪肝大鼠肝組織炎癥損傷,其作用機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB p65信號(hào)通路激活有關(guān)。本研究顯示,ACLF組大鼠肝組織中TLR4、NF-κB p-p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平較對照組顯著升高,提示TLR4/NF-κB信號(hào)通路參與ACLF大鼠肝組織的病理學(xué)改變過程。使用附子理中湯治療后,ACLF大鼠肝組織中TLR4、NF-κB p-p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低,提示附子理中湯改善ACLF肝損傷的機(jī)制可能涉及對TLR4/NF-κB信號(hào)通路的抑制。

綜上所述,附子理中湯能改善ACLF大鼠肝損傷,減輕炎癥反應(yīng),改善肝功能,其機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。