方耀威,許志亮,王亞紅,高勝蘭,吳 鏗,劉 剛*

(1廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院臨床研究中心,湛江 524000;2廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心內科;*通訊作者,E-mail:gangliu11@gdmc.edu.cn)

肺纖維化是一種預后極差的慢性肺部疾病,其發(fā)病機制尚未清楚。近年來,肺纖維化的發(fā)病率和病死率也逐漸升高。雖然已上市的吡非尼酮和尼達尼布能延緩肺纖維化的進程,但作用有限,因此仍迫切需要更有效的藥物來滿足臨床的治療[1]。

轉化生長因子1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)具有促進組織纖維化的重要功能[2],TGF-β1通過激活Smad依賴性和非依賴性途徑發(fā)揮其生物學活性[3]。其中,Smad2和Smad3是促進TGF-β1介導的組織纖維化的兩個主要下游調節(jié)因子,而Smad7作為TGF-β1/Smad通路的負反饋調節(jié)因子,阻斷了TGF-β1介導的促纖維化信號[4]。

8-氧鳥嘌呤DNA糖化酶1(8-oxoguanine DNA glycosylase-1,OGG1)是一種DNA修復酶,在氧化應激的情況下,它通過與DNA鏈上的8-oxoG結合從而啟動堿基切除修復(BER)過程[5]。本課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn),OGG1在博來霉素誘導的小鼠肺組織中表達上調,對小鼠肺部組織進行病理切片后,蘇木素-伊紅(HE)染色發(fā)現(xiàn)肺泡結構紊亂并有實變,Masson染色觀察發(fā)現(xiàn)肺泡間隙有大量藍色膠原沉積,而敲除OGG1能緩解博來霉素誘導的小鼠肺纖維化,通過進一步探討OGG1影響肺纖維化的機制,證實了OGG1與Smad7存在相互作用,但其相互作用的具體區(qū)域不明。本實驗在前期研究的基礎上,通過原核表達系統(tǒng)獲得OGG1和Smad7不同截段體蛋白,并在體外進行pull-down檢測,進而發(fā)現(xiàn)OGG1與Smad7相互作用的具體區(qū)域。

1 材料與方法

1.1 儀器

蛋白電泳槽(貨號:1658000)、半干轉印系統(tǒng)轉印槽(貨號:1703849)以及化學成像系統(tǒng)(貨號:17001395)均購于美國Bio-Rad公司、脫色搖床(貨號:G004408-0001,中國生工)、試管旋轉搖床(貨號:E0039,中國碧云天)、小型磁力架(貨號:B518800,中國生工)。

1.2 試劑

Protein G免疫磁珠(貨號:D110561,中國生工)、甲醇(貨號:A601617,中國生工)、30%丙烯酰胺(貨號:1610157,美國Bio-Rad公司)、APS(貨號:A3678,美國Sigma公司)、Tris base(貨號:V900483,美國Sigma公司)、TEMED(貨號:T7024,美國Sigma公司)、10% SDS(貨號:151-21-3,美國Sigma公司)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號:P0012,中國碧云天公司)、5xLoading Buffer(貨號:C506032-0005,中國生工)、蛋白預染Marker(貨號:26620,美國ThermoFisher公司)、PVDF膜(貨號:ISEQ00010,美國Sigma公司)、Tween 20(貨號:ST828-500ml,中國碧云天公司)、兔抗GST-Tag多克隆抗體(貨號:D110271-0100,中國生工)、小鼠抗S-Tag單克隆抗體(貨號:D191105-0100,中國生工)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(貨號:A0216,中國碧云天公司)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(貨號:A0208,中國碧云天公司)、發(fā)光液A+B(貨號:34577,美國ThermoFisher公司)。

1.3 Pull-down實驗

按照實驗需求設置3種不同的分組進行實驗,谷胱苷肽羧基轉移酶(glutathione-S-transferase,GST)和S標簽肽(S tag peptide,S-tag)為標簽蛋白,與被檢測目的蛋白如OGG1和Smad7,及它們各自截斷體蛋白結合成為融合蛋白,各種融合蛋白已提前制備完畢。

分組一:為檢測OGG1與Smad7存在相互作用,設置GST標簽蛋白對照組、GST+S-tag-Smad7組、GST-OGG1組以及GST-OGG1+S-tag-Smad7組,每組的蛋白量為50 μg,并用1 ml反應液與每組蛋白混合,反應液的具體成分為20 mmol/L Tris鹽酸鹽(Tris-HCl)、100 mmol/L氯化鈉(NaCl)、50 mmol/L氯化鉀(KCl)、0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、1 mmol/L氯化鎂(MgCl2)和5%(V/V)甘油(glycerol),在4 ℃中用試管旋轉搖床孵育12 h,使GST-OGG1融合蛋白與S-tag-Smad7充分結合,提前留取40 μl反應液作為輸入對照組(Input,IP),加入5×Loading Buffer混勻后沸水加熱5 min制備樣品。在剩下的10 μl反應液中加入GST抗體1 μg,室溫孵育1 h,再加入50 μl protein G磁珠室溫孵育15 min,使用小型磁力架吸附附有結合蛋白的磁珠,使用PBS-T在4 ℃下洗滌5次,每次10 min,去除上清后,使用40 μl洗脫液(pH=2.8,0.2 mol/L glycerol)室溫洗脫3 min,此時磁珠與蛋白發(fā)生解離,再用磁力架子吸附磁珠,上清液即為純化后的每組融合蛋白(IP:GST),如果OGG1和Smad7融合蛋白之間有結合,則蛋白在洗脫過程中不容易解離,用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量,取上清液加入5×Loading Buffer混勻后沸水加熱5 min制備樣品。

分組二:為了檢測不同的OGG1截段體與Samd7的相互作用,將GST-OGG1+S-tag-Smad7融合蛋白混合后作為對照組、GST-OGG1(1-242 aa)+S-tag-Smad7、GST-OGG1(1-138 aa)+S-tag-Smad7、GST-OGG1(1-63 aa)+S-tag-Smad7和GST-OGG1(34-346 aa)+S-tag-Smad7作為實驗組,每組的蛋白量為50 μg,加入反應液4℃孵育12 h使蛋白充分結合,每組取40 μl反應液作為Input對照組,制樣。在剩下10 μl反應液中每組加入S-Tag抗體1 μg(IP:S-tag),室溫孵育1 h,其余的磁珠純化與蛋白制樣步驟同分組一。

分組三:為了檢測OGG1(34-346 aa)與不同的Smad7截段體間的相互作用,將S-tag-Smad7+GST-OGG1(34-346 aa)融合蛋白混合后作為對照組、S-tag-Smad7(1-308 aa)+GST-OGG1(34-346 aa)、S-tag-Smad7(1-240 aa)+GST-OGG1(34-346 aa)和S-tag-Smad7(1-128 aa)+GST-OGG1(34-346 aa)作為實驗組,每組的蛋白量為50 μg,加入反應液4 ℃孵育12 h使蛋白充分結合,每組取40 μl反應液作為Input對照組,制樣。在剩下10 μl反應液每組加入GST抗體1 μg(IP:GST),室溫孵育1 h,其余的磁珠純化與蛋白制樣步驟同分組一。

1.4 Western blot實驗檢測GST標簽蛋白和S-tag標簽蛋白表達

制備10%SDS-PAGE膠,取20 μl已經制備好的蛋白樣本加入各孔,以80 V使蛋白下降至分離膠,然后轉為110 V繼續(xù)電泳,使蛋白跑到底以后,通過預染的Marker對膠塊進行修正切小。按照順序將濾紙、膠塊、膜、濾紙平鋪在半干轉儀上,鋪膜上去以后用玻璃棒輕輕滾動,趕走氣泡,然后夾成“三文治”狀。套上轉膜蓋板,以23 V進行半干轉,總長為40 min。將半干轉后的膜用TBST進行漂洗后,以TBST配制的5%的脫脂牛奶進行常溫封閉,封閉時間為2 h。TBST漂洗3次,每次5 min,隨后根據(jù)實驗需求孵育兔抗GST-Tag抗體(稀釋比1 ∶1 000)或小鼠抗S-Tag抗體(稀釋比1 ∶1 000)抗體,根據(jù)膜的大小適量調整孵育抗體的量,4 ℃孵育18 h,去除一抗后,TBST漂洗3次,每次5 min,然后使用辣根過氧化物酶標記山羊抗兔/小鼠IgG(H+L)(稀釋比1 ∶5 000)抗體常溫孵育1 h,去除二抗后,TBST漂洗5次,每次5 min。加入發(fā)光液A+B后用化學成像系統(tǒng)機器進行顯影。

2 結果

2.1 OGG1與Smad7體外相互作用

將GST-OGG1與S-tag-Smad7在反應液共孵育處理后,預留一部分反應液將作為輸入對照組,在未進行pull-down實驗前,進行免疫印跡檢測GST或S-tag標簽蛋白,結果發(fā)現(xiàn)GST標簽約在25 kD,S-tag-Smad7標簽約在58 kD,GST-OGG1標簽約在66 kD,GST-OGG1+S-tag-Smad7標簽分別約在66 kD和58 kD(見圖1)。剩下的一部分反應液加入GST抗體蛋白與其融合蛋白充分結合后,磁珠純化后免疫印跡檢測S-tag標簽蛋白,發(fā)現(xiàn)單獨的GST標簽組、GST+S-tag-Smad7和GST-OGG1組均未發(fā)現(xiàn)相互作用,在GST-OGG1+S-tag-Smad7組則發(fā)現(xiàn)在58 kD處發(fā)生相互作用(見圖1)。

Input:輸入組;IB:免疫印跡;IP:免疫沉淀圖1 OGG1和Smad7體外pull-down實驗分析Figure 1 Interaction between OGG1 and Smad7 by pull-down assay

2.2 OGG1截段體與Smad7體外相互作用

OGG1各截段體氨基酸分區(qū):66 kD(1-346 aa),57 kD(1-242 aa),43 kD(1-138 aa),35 kD(1-63 aa),62 kD(34-346 aa)(見圖2)。

圖2 OGG1各截段體分區(qū)Figure 2 Partition of truncated OGG1

將GST-OGG1不同截段體1-346 aa、1-242 aa、1-138 aa、1-63 aa和34-346 aa,與S-tag-Smad7在反應液共孵育處理后,將其反應液與洗脫液分別進行Western blot,結果發(fā)現(xiàn)OGG1(1-346 aa)和Smad7約在66 kD處有相互作用,OGG1(34-346 aa)與Smad7約在62 kD處有相互作用,1-242 aa、1-138 aa、1-63 aa均未與Smad7發(fā)生相互作用(見圖3)。

2.3 Smad7截段體與OGG1體外相互作用

Smad7各截段體氨基酸分區(qū):58 kD(1-428 aa),46 kD(1-308 aa),38 kD(1-240 aa),25 kD(1-128 aa)(見圖4)。

圖4 Smad7各截段體分區(qū)Figure 4 Partition of truncated Smad7

將S-tag-Smad7不同截段體1-428 aa、1-308 aa、1-240 aa和1-128 aa分別與GST-OGG1(34-346 aa)在反應液共孵育處理后,將其反應液與洗脫液分別進行Western blot,結果發(fā)現(xiàn)1-428 aa、1-308 aa、1-240 aa都可以與GST-OGG1(34-346 aa)相互作用,它們分別的相互作用位置約為58 kD、46 kD和38 kD,但1-128 aa并不與GST-OGG1(34-346 aa)發(fā)生相互作用(見圖5)。

1.GST-OGG1(1-346 aa)+S-tag-Smad7;2.GST-OGG1(1-242 aa)+S-tag-Smad7;3.GST-OGG1(1-138 aa)+S-tag-Smad7;4.GST-OGG1(1-63 aa)+S-tag-Smad7;5.GST-OGG1(34-346 aa)+S-tag-Smad7圖3 不同OGG1截段體和Smad7體外pull-down實驗分析Figure 3 Interaction between different truncated OGG1 and Smad7 by pull-down assay

1.S-tag-Smad7(1-428 aa)+GST-OGG1(34-346 aa);2.S-tag-Smad7(1-308 aa)+GST-OGG1(34-346 aa);3.S-tag-Smad7(1-240 aa)+GST-OGG1(34-346 aa);4.S-tag-Smad7(1-128 aa)+GST-OGG1(34-346 aa)圖5 不同Smad7截段體和OGG1(34-346 aa)體外pull-down實驗分析Figure 5 Interaction between different truncated Smad7 and OGG1(34-346 aa) by pull-down assay

3 討論

有研究表明,OGG1能防止石棉誘導的線粒體氧化應激所導致的肺泡上皮細胞(AEC)凋亡,改善石棉引起的小鼠肺纖維化[7]。同時,OGG1通過調節(jié)NF-κB信號通路,促進肺泡2型上皮細胞(AEC2)的增殖和自我更新,從而緩解小鼠肺纖維化進程[8]。本項目的前期研究結果表明,OGG1分別促進了肺泡上皮細胞和肺成纖維細胞的轉分化和激活過程,并且OGG1的缺失能夠顯著緩解博來霉素誘導的小鼠肺纖維化程度[6]。由此可見,OGG1參與調控肺纖維化的進程,但其具體作用機制尚不明確。

本次實驗證實了OGG1全長蛋白與Smad7全長蛋白存在相互作用(見圖1),為了進一步驗證OGG1全長與Smad7全長發(fā)生相互作用的具體區(qū)域,我們構建了OGG1的5段截段體(見圖2),實驗證實,OGG1的1-242 aa區(qū)間截段體與Smad7全長無相互作用,而34-346 aa和1-346 aa截段體與Smad7全長存在有相互作用(見圖3),提示OGG1的242-346 aa區(qū)域與Smad7全長存在相互作用。研究發(fā)現(xiàn),OGG1的半胱氨酸殘基在氧化應激下起不同的功能性作用,按其功能作用可分為四類:糖基化酶活性位點(C146和C255);裂解酶活性位點(C140S,C163,C241和C253);結構穩(wěn)定性位點(C253)和未知功能位點(C28和C75)。其中當結構穩(wěn)定性位點(C253)突變?yōu)榱涟彼峄蛘弋惲涟彼釙r,會嚴重降低OGG1的催化活性,其次,糖基化酶活性位點C255突變比C146突變更加影響OGG1的糖基化酶活性[9,10]。本實驗發(fā)現(xiàn),OGG1的242-346 aa區(qū)域與Smad7全長存在相互作用,且該區(qū)域包含有C253和C255位點,提示該位點除維持結構穩(wěn)定活性和糖基化酶活性外,還可以通過與Smad7發(fā)生相互作用,從而發(fā)揮新的病理生理功能,但其具體作用機制仍需進一步研究。

已知OGG1(242-346 aa)與Smad7全長發(fā)生相互作用,但Smad7與OGG1相互作用區(qū)域仍未知,因此,我們進一步構建Smad7的4段截段體(見圖4),結果發(fā)現(xiàn),除了1-128 aa不與GST-OGG1(34-346 aa)相互作用外,其他區(qū)域都與其有相互作用(見圖5),側面提示Smad7(128-240 aa)與OGG1(242-346 aa)存在相互作用。研究表明,Smad蛋白是TGF-β/Smad信號通路中的關鍵蛋白,在哺乳動物細胞中已經鑒定出8種Smad蛋白,并將其分類為3種亞家族:受體調控的Smads(R-Smads:Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8)、伴侶Smads(Co-Smad:Smad4)和抑制性Smads(I-Smads:Smad6和Smad7)[11,12]。Smad7是TGF-β/Smad信號的負性調控因子,它通過與TGF-β的I型受體(TβRI)結合,從而抑制TGF-β信號通路;其次,它還能通過其MH2結構域阻斷Smad2/3的激活[13]。另外,TGF-β通過結合它的Ⅱ型受體(TβRⅡ),并磷酸化激活TβRI,此時,TβRI進一步磷酸化激活Smad2/3[13]。本研究結果初步證實,OGG1截段體(242-346 aa)與Smad7截段體(128-240 aa)間存在相互作用,因此提示OGG1可能通過與Smad7的關鍵結構域結合,從而削弱Smad7與Smad2/3的相互競爭作用,同時阻斷Smad7與TβRI結合,進而激活TGF-β/Smad2/3信號通路,發(fā)揮促進肺纖維化的作用。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),過表達OGG1,Smad2/3總蛋白及其磷酸化形式均表達上調,且Smad7表達也上調,同時通過細胞免疫共沉淀實驗也發(fā)現(xiàn),OGG1與Smad7之間存在相互作用[6]。本研究首次發(fā)現(xiàn),OGG1的242-346 aa區(qū)域與Smad7的128-240 aa區(qū)域存在相互作用,提示OGG1可能通過與Smad7結合,從而削弱Smad7對Smad2/3的抑制作用。因此,參與激活Smad2/3介導的促纖維化信號,加速肺纖維化進程,本研究結果進一步完善了OGG1促肺纖維化進程的作用機制。