耿笑林，王孟月，張翼，劉鵬，李可樂(lè)，杜東穎，逄文強(qiáng)，黃玉欣*，田克恭*

(1. 國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471003；2. 普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽(yáng) 471003)

雞肝炎-心包積液綜合征 (hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS)是由禽腺病毒血清4型 (fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4)引起的一種高度傳染性疾病，該病于1987年在巴基斯坦的安卡拉地區(qū)首次暴發(fā)，隨后在亞洲、歐洲和南美洲等地區(qū)流行[1-4]。2015年7月起，由FAdV-4中國(guó)流行株引起的HHS在我國(guó)山東、河南、安徽和江蘇等省份大面積流行[5]，死亡率最高可達(dá)80%以上，因?yàn)槿狈τ行У囊呙邕M(jìn)行針對(duì)性預(yù)防，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，F(xiàn)AdV-4的疫苗研制對(duì)防控該病尤為重要。

FAdV-4具有兩條纖突，一條長(zhǎng)纖突(Fiber-1)和一條短纖突(Fiber-2)，其中Fiber-2蛋白主要是通過(guò)識(shí)別宿主細(xì)胞上的特異受體而使病毒吸附結(jié)合在宿主細(xì)胞上，對(duì)病毒增殖、組裝或擴(kuò)散的某個(gè)階段是必需的，缺失Fiber-2則不能產(chǎn)生病毒粒子[6]，因此Fiber-2是疫苗研制的潛在抗原蛋白之一。

大腸桿菌由于其生長(zhǎng)迅速，容易達(dá)到高細(xì)胞密度和低成本培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)[7]，無(wú)論在實(shí)驗(yàn)室還是在工業(yè)規(guī)模上，成為許多重組蛋白(包括Fiber-2蛋白)的首選表達(dá)系統(tǒng)。然而，由于缺乏先進(jìn)的翻譯后修飾和真核伴侶蛋白，外源蛋白易聚集以包涵體形態(tài)產(chǎn)生[8]。生物系統(tǒng)中存在的各種小分子可以在體外協(xié)助蛋白質(zhì)折疊，以改善蛋白質(zhì)在多種情況下的錯(cuò)誤折疊和聚集，被稱為化學(xué)伴侶[9]。蛋白質(zhì)折疊與伴侶蛋白介導(dǎo)的突變緩沖有關(guān)，一些化學(xué)物質(zhì)如鹽、糖、氨基酸和多聚物被用來(lái)提高外源蛋白的可溶性表達(dá)[10]。如葡萄糖、蔗糖、甘油等可能會(huì)緩沖蛋白表面的突變，山梨醇在體外被廣泛用作蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑[11]，精氨酸作為蛋白質(zhì)聚集抑制因子的作用已被廣泛認(rèn)識(shí)[12-13]。此外，β-環(huán)糊精是一種環(huán)狀寡糖，呈筒狀結(jié)構(gòu)，其兩端與外部為親水性，內(nèi)部為親脂性中心，被用來(lái)阻止部分折疊蛋白的不可逆性聚集。

本研究在利用大腸桿菌表達(dá)Fiber2蛋白時(shí)，大部分的蛋白以包涵體形式存在，且不與陽(yáng)性血清發(fā)生瓊脂擴(kuò)散沉淀反應(yīng)(agar gel diffusion precipitation，AGP)。因此，本研究嘗試在培養(yǎng)基中分別加入甘油、葡萄糖、β-環(huán)糊精、山梨醇、蔗糖、精氨酸、甘露醇等物質(zhì)，篩選可以提高Fiber-2的可溶性表達(dá)的化學(xué)伴侶分子，為進(jìn)一步的工藝放大奠定基礎(chǔ)；同時(shí)對(duì)表達(dá)的可溶性Fiber-2進(jìn)行免疫原性分析，為進(jìn)一步研制FAdV-4亞單位疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；pET28a載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；引物及基因序列的合成與測(cè)序均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成；2×TransStart FastPfu PCR SuperMix(-dye)高保真DNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶購(gòu)自賽默飛世爾科技公司、FAdV-4陽(yáng)性血清由普萊柯生物工程股份有限公司制備、鑒定并保存。

酵母提取物、胰蛋白胨購(gòu)自O(shè)XOID公司；葡萄糖、異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)購(gòu)自BBI公司；瓊脂糖購(gòu)自TaKaRa公司；甘油、萄糖、β-環(huán)糊精、蔗糖、露醇、精氨酸、山梨醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 FAdV-Fiber-2重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)GenBank公布的Fiber-2基因序列(登錄號(hào)為FR872912.1)設(shè)計(jì)合成特異的引物P1和P2。P1序列NcoⅠ-F：5′-CATGCCATGGGCATGCTCCGAGCCCCTAAA-3′，P2序列HindⅢ-R：5′-CCCAAGCTTTTACGGGACGGAGGCTGCT-3′。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。以本實(shí)驗(yàn)室分離毒株FAV-HN[14]的DNA為模板，使用引物組P1和P2擴(kuò)增目的基因片段，PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后與pET28a載體一同由NcoⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶37 ℃酶切1 h，并進(jìn)行純化回收，回收產(chǎn)物由T4 DNA連接酶室溫連接1 h，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞；提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗(yàn)證和測(cè)序鑒定。

1.3 重組蛋白FAdV-Fiber-2的表達(dá)

將測(cè)序鑒定無(wú)誤的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB固體平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日，挑取單菌落接種于100 mL新鮮LB培養(yǎng)基中(含50 μg/mL硫酸卡那霉素)，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6左右，加入0.2 mol/L的IPTG并降溫至28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。

1.4 化學(xué)伴侶分子對(duì)重組蛋白FAdV-Fiber-2在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的影響

將重組大腸桿菌FAdV-Fiber-2無(wú)菌接種于含50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日，挑取單菌落接種于含硫酸卡那霉素的100 mL新鮮LB培養(yǎng)基中(含50 μg/mL硫酸卡那霉素)，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6左右，此時(shí)分別加入40 mL/L的甘油，40 g/L的葡萄糖，2 g/L的β-環(huán)糊精，40 g/L的山梨醇，0.4 mol/L的蔗糖，0.1 mol/L的精氨酸，40 g/L的甘露醇，同時(shí)加入0.2 mol/L的IPTG并降溫至28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。

選取添加甘油、蔗糖和β-環(huán)糊精的破碎菌體上清液，添加入10 mmol/L咪唑，0.45 μm過(guò)濾后，以1 mL/min的流速通過(guò)Ni SepharoseTM6 Fast Flow鎳柱，隨后用上樣緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L NaCl, pH值7.2)和洗雜緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L NaCl, 50 mmol/L 咪唑, pH值7.2)分別沖洗鎳柱，最后用洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L NaCl, 500 mmol/L 咪唑, pH值7.2)洗脫目的蛋白。收集洗脫產(chǎn)物，并用Zetasizer Nano ZSP系統(tǒng)對(duì)純化后樣品進(jìn)行粒徑分析。

1.5 重組蛋白免疫效果評(píng)價(jià)

為了評(píng)價(jià)Fiber-2蛋白的免疫效果，將其用PBS緩沖液進(jìn)行梯度稀釋至AGP效價(jià)為1∶20、1∶21和1∶22作為抗原，分別與礦物油佐劑按1∶2的比例乳化制備亞單位疫苗。將50只21日齡SPF雞隨機(jī)分為5組(A～E)，每組10只。A～C組雞分別皮下接種0.3 mL亞單位疫苗，F(xiàn)iber-2抗原的AGP效價(jià)依次為1∶20、1∶21和1∶22，D組接種0.3 mL FAdV全病毒滅活疫苗(1 mL抗原中含1×106TCID50的細(xì)胞源FAdV)，作為陽(yáng)性對(duì)照組[15]，E組雞注射無(wú)菌PBS作為空白對(duì)照組。所有SPF雞分別于免疫后第0、7、14、21天進(jìn)行翅下靜脈采血，并通過(guò)AGP檢測(cè)血清中針對(duì)FAdV的特異性抗體水平。

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1 目的蛋白含量測(cè)定

培養(yǎng)結(jié)束后，8 000 r/min離心10 min收集菌體，取1 g濕重重懸于40 mL無(wú)菌生理鹽水中(1∶40)，冰水浴中超聲波破碎35 min，破碎條件為：超聲功率400 W，工作5 s，間歇15 s。破碎液于2～8 ℃，10 000 r/min離心10 min后取上清，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.6.2 不同表達(dá)蛋白的AGP分析

采用AGP進(jìn)行檢測(cè)，具體方法為：稱取1%的瓊脂粉，加入0.01 moL/L的PBS緩沖液，水浴煮沸融化后倒入平皿內(nèi)，厚度2～3 mm，自然冷卻。使用打孔器打出7個(gè)相鄰的梅花孔，挑出孔內(nèi)瓊脂，并在火焰上緩慢加熱以對(duì)孔底邊緣進(jìn)行封閉。將1.6.1破碎后離心所得上清，用PBS倍比稀釋，緩慢加入外周梅花孔中，加滿為宜，中間孔加入FAdV陽(yáng)性血清，盡量避免產(chǎn)生氣泡。以PBS緩沖液替代抗原作為陰性對(duì)照，中間孔與外周孔之間出現(xiàn)沉淀線判定為一個(gè)滴度。

2 結(jié)果

2.1 FAdV-Fiber-2重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

以P1、P2為引物，以分離毒株FAV-HN的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后與pET28a載體一同由NcoⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶37 ℃酶切1 h，并進(jìn)行純化回收，回收產(chǎn)物由T4 DNA連接酶室溫連接1 h，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞；提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，酶切可得到1 400 bp左右大小的DNA片段(圖1)，與預(yù)期的FAdV-Fiber-2基因片段大小相等，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL5000)；1.重組載體酶切

2.2 重組蛋白FAdV-Fiber-2的表達(dá)

重組菌種于37 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6左右，加入0.2 mol/L的IPTG并降溫至28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，誘導(dǎo)后的重組菌在60 kDa左右處出現(xiàn)明顯表達(dá)蛋白條帶，與目的蛋白預(yù)期分子量相符。上清中目的條帶較弱，目的蛋白大部分以包涵體形式存在(圖2)。對(duì)其進(jìn)行AGP效價(jià)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1，目的蛋白的AGP效價(jià)為1∶32。

M.預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未誘導(dǎo)上清；2.誘導(dǎo)后上清；3.誘導(dǎo)后沉淀

2.3 化學(xué)伴侶分子對(duì)重組蛋白FAdV-Fiber-2在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的影響

重組菌種于37 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6左右，加入不同的化學(xué)伴侶分子甘油、葡萄糖、β-環(huán)糊精、山梨醇、蔗糖、精氨酸、甘露醇，同時(shí)加入0.2 mol/L的IPTG，并降溫至28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，誘導(dǎo)后的重組菌在60 kDa左右處出現(xiàn)明顯表達(dá)蛋白條帶，與目的蛋白預(yù)期分子量相符。添加甘油、葡萄糖、β-環(huán)糊精、山梨醇、甘露醇，都能提升FAdV-4 Fiber-2的可溶性表達(dá)量，且添加β-環(huán)糊精蛋白表達(dá)量顯著高于其他試驗(yàn)組，而添加精氨酸、蔗糖，在菌體裂解上清中目的條帶的可溶性表達(dá)量，與不添加任務(wù)化學(xué)伴侶分子的對(duì)照組無(wú)顯著差異(圖3)。對(duì)其進(jìn)行AGP效價(jià)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。

M.預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未誘導(dǎo)上清；2.誘導(dǎo)后上清；3.添加甘油組上清；4.添加葡萄糖組上清；5.添加β-環(huán)糊精組上清；6.添加山梨醇組上清；7.添加蔗糖組上清；8.添加精氨酸組上清；9.添加甘露醇組上清

表1 不同化學(xué)分子伴侶對(duì)FAdV-Fiber-2蛋白表達(dá)的影響

選取添加甘油、蔗糖和β-環(huán)糊精的樣品通過(guò)蛋白層析純化系統(tǒng)進(jìn)行鎳柱純化，并利用Zetasizer Nano ZSP系統(tǒng)進(jìn)行粒徑分析，結(jié)果顯示平均粒徑和聚合物分散性指數(shù)(PDI)均為β-環(huán)糊精<甘油<蔗糖(圖4、表2)。

圖4 不同化學(xué)伴侶分子處理后Fiber-2蛋白粒徑分析

表2 添加不同化學(xué)伴侶分子后Fiber-2蛋白平均粒徑和聚合物分散性指數(shù)(PDI)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

利用德泰生物的生物信息學(xué)工具對(duì)Fiber-2蛋白的N端150多個(gè)氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析顯示其N端存在疏水性較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)域(圖5)，在誘導(dǎo)階段加入β-環(huán)糊精可能促進(jìn)Fiber-2蛋白N端區(qū)肽鏈的正確折疊，從而改變?nèi)?jí)結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)Fiber-2蛋白的可溶性表達(dá)量的提升。而蔗糖由于黏度較高，在誘導(dǎo)階段添加對(duì)Fiber-2蛋白的可溶性表達(dá)量無(wú)正面影響。

圖5 Fiber-2蛋白N端的疏水性分析

2.6 疫苗免疫原性分析

用AGP檢測(cè)免疫后血清FAdV-4抗體，結(jié)果顯示各組在免疫前和免疫后第7天均未檢測(cè)到FAdV-4抗體。A組(Fiber-2 蛋白AGP效價(jià)為1∶20)雞于免疫后第14和21天檢測(cè)到AGP抗體，分別為2/10和5/10。B組和C組(Fiber-2 蛋白AGP效價(jià)分別為1∶21和1∶22)雞于免疫后第14和21天，均檢測(cè)到AGP抗體。E組(FAdV全病毒滅活疫苗)在免疫后第14和21天，均檢測(cè)到AGP抗體(10/10)，與B組和C組結(jié)果一致(表3)。

表3 不同試驗(yàn)組免疫后抗體反應(yīng)

3 討論

FAdVs血清型多、致病力差異大。隨著近幾年因禽腺病毒感染發(fā)生的禽病加劇，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[15]，因此，禽腺病毒疫苗的研發(fā)顯得尤為迫切。Fiber-2蛋白具有型和亞群特異性抗原決定簇，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生主要的型特異性中和抗體[16-17]，對(duì)FAdV-4的感染、致病及診斷有重要意義[18]。

由于利用大腸桿菌表達(dá)Fiber-2蛋白時(shí)，大部分的蛋白以包涵體形式存在。本研究在培養(yǎng)基中分別加入甘油、葡萄糖、β-環(huán)糊精、蔗糖、甘露醇、精氨酸、山梨醇等化學(xué)伴侶分子物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)β-環(huán)糊精可以顯著提高Fiber-2蛋白的可溶性表達(dá)的量。

β-環(huán)糊精是一種環(huán)狀寡糖，呈筒狀結(jié)構(gòu)，其兩端與外部為親水性，內(nèi)部為親脂性中心，可通過(guò)其疏水性內(nèi)核與未折疊蛋白相互作用掩蓋蛋白疏水殘基，幫助蛋白重新折疊，從而提高蛋白的可溶性表達(dá)量。Du等[19]通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加β-環(huán)糊精來(lái)提升單鏈Fv抗體可溶性表達(dá)量，可溶性單鏈Fv抗體比對(duì)照組高出4.17倍。但未見(jiàn)其在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的成功應(yīng)用，有文獻(xiàn)報(bào)道，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中通過(guò)添加不同濃度的β-環(huán)糊精，未能提升olFN-tau蛋白的可溶性表達(dá)量[20]。

Fiber-2蛋白的N端存在疏水性較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)域這一特殊的空間結(jié)構(gòu)，加入β-環(huán)糊精可能促進(jìn)了其N端區(qū)肽鏈的正確折疊，從而改變了三級(jí)結(jié)構(gòu)，使Fiber-2蛋白的可溶性表達(dá)量的提升；同時(shí)提示，對(duì)于其他類似Fiber-2蛋白這種N端具有較強(qiáng)的疏水性特性的蛋白，可以嘗試通過(guò)添加β-環(huán)糊精這一方法來(lái)提高蛋白的可溶性表達(dá)。

以可溶性表達(dá)的重組fiber-2蛋白為抗原免疫 SPF 雞，利用AGP檢測(cè)接種后雞血清中針對(duì)FAdV-4的抗體，抗原AGP效價(jià)1∶21和1∶22免疫組與細(xì)胞培養(yǎng)的FAV-HN滅活疫苗對(duì)照組所有雞在免疫后第14和21天AGP檢測(cè)血清抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)，表明重組蛋白抗原進(jìn)入機(jī)體后能夠有效刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)快速產(chǎn)生免疫應(yīng)答，證明表達(dá)可溶性重組Fiber-2蛋白具有較好的免疫原性，且產(chǎn)生的抗體能夠與FAdV-4發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)，抗原可有效刺激免疫系統(tǒng)并產(chǎn)生了較高水平的特異性抗體。

4 結(jié)論

研究探索了不同化學(xué)分子伴侶對(duì)重組Fiber-2蛋白可溶性表達(dá)的影響，首次發(fā)現(xiàn)β-環(huán)糊精可顯著提高FAdV-4 Fiber-2蛋白可溶性表達(dá)量，為進(jìn)一步的工藝放大提供了依據(jù)，同時(shí)為其他同類外源蛋白質(zhì)在原核中的可溶性表達(dá)提供了借鑒。對(duì)表達(dá)的可溶性Fiber-2進(jìn)行免疫原性分析，為進(jìn)一步研制FAdV-4亞單位疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。