羅弼豪，徐浩，羅麗華，范昱鑫，楊卓霖，王月婷，季天潤(rùn)，康煜坤，韓雪英*，郭抗抗*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 深圳海關(guān)動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045)

豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)于1991年在加拿大被首次報(bào)道，它不僅是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原，而且與豬皮炎與腎炎綜合征、豬呼吸道綜合征、增生性壞死性肺炎和先天性顫抖病及繁殖障礙綜合征等有重要關(guān)聯(lián)。2000年，由該病毒引發(fā)的相關(guān)豬病在我國(guó)首次報(bào)道[1]，現(xiàn)如今PCV2已在我國(guó)豬群中普遍流行并嚴(yán)重危害我國(guó)生豬養(yǎng)殖和貿(mào)易的發(fā)展[2]。因此，加強(qiáng)生豬豬群中PCV2尤其是其亞型的監(jiān)測(cè)和防控顯得尤為迫切。

PCV2為無(wú)囊膜的單股環(huán)狀DNA病毒[3]，其病毒基因組全長(zhǎng)1 767 bp，含11個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)，以編碼的Cap蛋白ORF2最為重要。Cap蛋白大小約27.8 ku，是介導(dǎo)PCV2進(jìn)入宿主細(xì)胞的衣殼(結(jié)構(gòu))蛋白，同時(shí)也是PCV2全基因組中變異程度最高的蛋白。鑒于Cap蛋白的重要性和特殊性，ORF2毫無(wú)疑問(wèn)成為了研究PCV2整個(gè)基因組變異的首要靶基因[4]。

為深入掌握陜西部分地區(qū)屠宰生豬PCV2的流行和遺傳變異規(guī)律，本研究對(duì)2018—2019年采自陜西部分地區(qū)屠宰生豬的血液樣品進(jìn)行PCV2檢測(cè)，對(duì)部分陽(yáng)性樣品ORF2基因進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序、序列比對(duì)及遺傳變異分析，通過(guò)探討上述地區(qū)PCV2毒株流行和遺傳變異情況，進(jìn)而為該地區(qū)PCV2感染的針對(duì)性防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和來(lái)源

2018年10月—2019年3月，課題組共對(duì)陜西省咸陽(yáng)和楊凌的生豬屠宰企業(yè)進(jìn)行了15次采樣(每次20份)，合計(jì)采集血樣300份。血樣豬源來(lái)自漢中、安康、商洛、銅川、寶雞、咸陽(yáng)和楊凌等地。

1.2 主要試劑

病毒基因組提取試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)；2×TaqPCR MasterMix以及凝膠回收純化試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DNA Marker DL 2000購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參照湯智慧等[5]設(shè)計(jì)血液樣品PCV2檢測(cè)用引物。上游引物PCV2-F：5′-GTGGTCTACATTTCCAGCAGTTF-3′；下游引物PCV2-R：5′-GCTCAAACCCCCGCTC-3′。

參照GenBank中PCV2分離株(AF381175.1)設(shè)計(jì)ORF2基因擴(kuò)增用引物，上游引物PCV2-Cap-F：5′-TTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTA-3′；下游引物PCV2-Cap-R：5′-ATGACGTATCCAAGGAGGC-GTT-3′。引物合成由英淮捷基貿(mào)易有限公司完成。

1.4 病毒DNA提取

血樣在-80 ℃與室溫間反復(fù)凍融3次后，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒DNA，提取物-20 ℃保存。

1.5 樣品PCR檢測(cè)

以PCV2-F/R為引物，參照湯智慧等[5]的反應(yīng)條件進(jìn)行病毒PCR檢測(cè)。

反應(yīng)體系：上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、2×TaqPCR MasterMix 10.0 μL、樣品DNA模板1.0 μL、補(bǔ)足ddH2O至20 μL；

反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.6 ORF2基因擴(kuò)增

選取20份PCV2陽(yáng)性檢測(cè)血樣，以PCV2-Cap-F/R為引物擴(kuò)增ORF2基因，并按試劑盒說(shuō)明書(shū)純化回收相關(guān)反應(yīng)產(chǎn)物。

反應(yīng)體系：上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、2×TaqPCR MasterMix 10.0 μL、樣品DNA模板1.0 μL、補(bǔ)足ddH2O至20 μL。

反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。純化回收產(chǎn)物經(jīng)載體連接、感受態(tài)轉(zhuǎn)化、抗性培養(yǎng)和PCR驗(yàn)證后測(cè)序。

1.7 ORF2基因序列比對(duì)和遺傳變異分析

對(duì)獲得的ORF2基因進(jìn)行序列比對(duì)和構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，以獲知PCV2陽(yáng)性樣品中ORF2的同源性和遺傳變異情況。序列比對(duì)用12株國(guó)內(nèi)外PCV2參考毒株(GenBank)，見(jiàn)表1所示。

表1 豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因序列分析所選參考毒株基因型及登錄號(hào)

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中PCV2的病原學(xué)檢測(cè)

300份屠宰生豬血樣經(jīng)PCV2-F/R引物擴(kuò)增后，有38份血樣在332 bp處獲得了特異性條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致。部分血樣病原學(xué)檢測(cè)PCR結(jié)果見(jiàn)圖1所示，PCV2病原學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性率為12.67%(38/300)。

N. 陰性對(duì)照；P. 陽(yáng)性對(duì)照；M. DNA Marker DL 1000；71～91. 部分屠宰生豬樣品

2.2 部分PCV2陽(yáng)性樣品ORF2基因的擴(kuò)增和測(cè)序

從38份PCV2陽(yáng)性樣品中選取20份(SX-HZ-P1、SX-HZ-P2、SX-AK-P1、SX-AK-P2、SX-BJ-P1、SX-BJ-P2、SX-BJ-P3、SX-BJ-P4、SX-SL-P1、SX-SL-P2、SX-SL-P3、SX-SL-P4、SX-YL-P1、SX-YL-P2、SX-YL-P3、SX-YL-P4、SX-YL-P5、SX-YL-P6、SX-YL-P7和SX-YL-P8)，以PCV2-Cap-F/R為引物擴(kuò)增ORF2基因，均在大約750 bp附近獲得了與預(yù)期大小一致的特異性條帶，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，擴(kuò)增產(chǎn)物均為ORF2基因，且產(chǎn)物大小為702 bp(圖2)。

M. DNA Marker DL 2000；1. 陰性對(duì)照；2. 陽(yáng)性對(duì)照；3～22. 20份陽(yáng)性樣品

2.3 ORF2基因的序列比對(duì)

20份擴(kuò)增的ORF2基因間序列比對(duì)結(jié)果顯示，核苷酸和編碼氨基酸的同源性為94.3%～100%和85.9%～100%。它們與12株國(guó)內(nèi)外PCV2參考毒株ORF2基因序列比對(duì)結(jié)果顯示，核苷酸和編碼氨基酸的同源性為89.5%～100%和79.5%～100%。其中，與SH1001(KF850459.1)和SH1102(KF850464.1)毒株ORF2基因的核苷酸和編碼氨基酸同源性為95.0%～99.7%和88.5%～99.1%(圖3)；與SXXAA-01(KC800644.1)和YN/KM/2018(MH593263.1)毒株ORF2基因的核苷酸和編碼氨基酸同源性為94.6%～100%和87.6%～100%(圖4)。

圖3 ORF2基因核苷酸同源性比對(duì)結(jié)果

圖4 ORF2基因氨基酸同源性比對(duì)結(jié)果

2.4 ORF2基因的遺傳變異分析

20個(gè)擴(kuò)增的ORF2基因構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)如圖5所示。遺傳變異分析的結(jié)果顯示：11份陽(yáng)性血樣所含毒株屬于PCV2b亞型(SX-HZ-P1、SX-HZ-P2、SX-AK-P1、SX-BJ-P1、SX-BJ-P4、SX-SL-P1、SX-SL-P2、SX-YL-P1、SX-YL-P2、SX-YL-P4和SX-YL-P6)，9份陽(yáng)性血樣所含毒株屬于PCV2d亞型(SX-AK-P2、SX-BJ-P2、SX-BJ-P3、SX-SL-P3、SX-SL-P4、SX-YL-P3、SX-YL-P5、SX-YL-P7、SX-YL-P8)，PCV2b亞型和PCV2d亞型分別占55%和45%；未發(fā)現(xiàn)其他PCV2亞型。

圖5 ORF2基因遺傳進(jìn)化樹(shù)建立

3 討論

PCV2自1991年報(bào)道以來(lái)就在全球廣泛流行，其10%～30%的死亡率給世界養(yǎng)豬業(yè)造成極為嚴(yán)重的損失[6]。由于PCV2對(duì)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的負(fù)面影響，因此，加強(qiáng)生豬PCV2的監(jiān)測(cè)和防治，不僅有利于豬群養(yǎng)殖安全，也有利于保障人民的食用安全。為確保PCV2監(jiān)測(cè)結(jié)果的代表性和有效性，豬源的選擇至關(guān)重要。單純選擇不同地域分布和養(yǎng)殖規(guī)模的單一豬場(chǎng)開(kāi)展PCV2監(jiān)測(cè)，不利于從更高和更廣的視角研究PCV2的發(fā)病和流行病學(xué)情況。生豬屠宰企業(yè)是某一區(qū)域生豬的主要集中地之一，在這里采集的樣品能同時(shí)涵蓋多個(gè)豬場(chǎng)，從而更有代表性，是開(kāi)展地區(qū)生豬豬群PCV2監(jiān)測(cè)的重要且有效途徑。段群棚等[7]曾對(duì)2015年3月至2019年2月采集自廣西14個(gè)地市規(guī)模豬場(chǎng)的1 114份具有呼吸道癥狀病豬樣品進(jìn)行疫病病原學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示，PCV2的陽(yáng)性率為38.96%；李新蘋(píng)等[8]曾對(duì)新疆5個(gè)規(guī)模化屠宰場(chǎng)進(jìn)行了豬支原體肺炎與其他病原混合感染情況的調(diào)查，結(jié)果顯示，新疆豬支原體肺炎、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、PCV2或者胸膜肺炎放線桿菌(APP)的混合感染率為57.1%。本研究對(duì)2018—2019年采自陜西省咸陽(yáng)和楊凌地區(qū)生豬屠宰企業(yè)的300份血樣進(jìn)行PCV2病原學(xué)檢測(cè)，陽(yáng)性率達(dá)到12.67%(38/300)，表明PCV2在陜西省生豬豬群中的存在不容忽視。與羅麗華等[9]對(duì)2016—2017年采自陜西省免疫豬場(chǎng)和非免疫豬場(chǎng)樣品的PCV2病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果相比，雖然本試驗(yàn)PCV2的陽(yáng)性結(jié)果(12.67%)顯著低于非免疫豬場(chǎng)的PCV2陽(yáng)性結(jié)果(32%)，但仍略高于免疫豬場(chǎng)10%的陽(yáng)性結(jié)果，提示陜西省屠宰生豬豬群的PCV2防控依然任重道遠(yuǎn)，來(lái)源豬場(chǎng)需隨時(shí)根據(jù)本地PCV2流行情況采取更加有針對(duì)性的生物安全措施。

考慮到ORF2基因是PCV2遺傳變異分析時(shí)的常用靶基因[10-11]，為獲得血液來(lái)源地區(qū)PCV2的遺傳變異情況，本研究對(duì)20份PCV2陽(yáng)性血液的ORF2基因進(jìn)行了序列比對(duì)和遺傳變異分析。結(jié)果顯示，采集的陜西省屠宰生豬血樣中PCV2毒株，與所選的12株國(guó)內(nèi)外參考毒株尤其是疫苗株的ORF2基因具有高度同源性，如與國(guó)內(nèi)KF850459.1和KF850464.1株ORF2核苷酸和編碼氨基酸的同源性，分別達(dá)到了95.0%～99.7%和88.5%～99.1%；與KC800644.1和MH593263.1株ORF2核苷酸和碼氨基酸的同源性分別達(dá)到了94.6%～100%和87.6%～100%。隨后的遺傳變異分析進(jìn)一步揭示，11份陽(yáng)性血樣所含毒株屬于PCV2b亞型，9份陽(yáng)性血樣所含毒株均屬于PCV2d亞型，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他亞型，這表明PCV2b亞型和PCV2d亞型是當(dāng)前陜西省屠宰生豬中PCV2的主要流行毒株。相較于PCV2的其他4個(gè)亞型，PCV2b亞型是世界范圍內(nèi)最主要的流行毒株[12]。劉玄福等[13]對(duì)2015—2017年我國(guó)河北北部地區(qū)、李金鳳等[14]對(duì)2017年廣西地區(qū)的PCV2流行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，除了PCV2b亞型外，PCV2d亞型是當(dāng)?shù)亓餍卸局?；而鄧文芳等[15]對(duì)2017—2018年華中地區(qū)(湖北省、湖南省和河南省)的PCV2流行調(diào)查結(jié)果顯示，該地區(qū)流行毒株竟以PCV2d亞型為主。上述研究表明，PCV2在我國(guó)的流行毒株已不再是PCV2b亞型一家獨(dú)大，而是在由PCV2b亞型向PCV2d亞型轉(zhuǎn)變，且PCV2d亞型有逐漸增多的趨勢(shì)。本研究與上述研究結(jié)果一致，PCV2b亞型和PCV2d亞型在陜西省的屠宰生豬中共同存在，且PCV2d亞型的占比已達(dá)到45%(9/20)，提示PCV2d亞型極有可能與PCV2b亞型一樣成為未來(lái)陜西豬群的主要流行毒株，該結(jié)論可為制定針對(duì)性防控PCV2措施提供基礎(chǔ)資料。

當(dāng)前，疫苗作為防控PCV2的重要手段仍發(fā)揮著重要作用。研究表明，豬群接種PCV2疫苗后可顯著降低PCV2的陽(yáng)性率和感染豬組織中的病毒含量[16]?？紤]到PCV2的流行性和變異性所帶來(lái)的隱性感染和繼發(fā)感染[17-18]，PCV2仍是我國(guó)大規(guī)模生豬養(yǎng)殖業(yè)安全的重大隱患。通過(guò)對(duì)各地PCV2的監(jiān)測(cè)和遺傳變異分析，可詳細(xì)獲知PCV2在該地區(qū)的流行和遺傳變化情況，從而有針對(duì)地推動(dòng)當(dāng)?shù)亻_(kāi)展疫苗研制和制定防控計(jì)劃，這對(duì)國(guó)內(nèi)PCV2的防治、養(yǎng)豬業(yè)的安全生產(chǎn)及社會(huì)穩(wěn)定具有重要現(xiàn)實(shí)意義。