尹坤，王同燕，宋歡歡，白露露，李勝強，譚菲菲，田克恭,3*

(1. 國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471003；2. 普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471003；3. 洛陽普泰生物技術(shù)有限公司，河南 洛陽 471003)

桿狀病毒表達載體系統(tǒng)(Baculovirus expression vector system, BEVS)是近年來被廣泛用于高效表達外源蛋白的載體系統(tǒng)，為重組蛋白單體、多聚體蛋白復(fù)合物、病毒樣顆粒、膜蛋白以及對哺乳動物細胞有毒的蛋白提供了通用的表達平臺，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域[1]。相對于原核、酵母和CHO等表達系統(tǒng)，BEVS具有一定優(yōu)勢：桿狀病毒專一寄生于無脊椎動物，安全性高；可對重組蛋白進行正確折疊和翻譯后修飾，獲得具有生物活性的蛋白；適應(yīng)于多基因表達如病毒樣顆粒 (virus-like particle) 的復(fù)雜設(shè)計；適用于大規(guī)模無血清培養(yǎng)等[2-6]。在實際生產(chǎn)過程中，貼壁轉(zhuǎn)染獲得的P0代重組病毒滴度低，需要進一步病毒擴繁來獲得高滴度的重組病毒，但由于重組桿狀病毒在傳代過程中基因組存在不穩(wěn)定性，在重組病毒擴繁中會導(dǎo)致目的基因片段的丟失，成為重組桿狀病毒產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化過程中的限制因素之一[7-8]。將傳統(tǒng)貼壁轉(zhuǎn)染方式獲得的P0代重組病毒傳代放大，使重組病毒滴度與外源蛋白表達均達到最優(yōu)，此過程需要12～20 d傳代周期[9]。

本研究利用ExpiFectamineTMSf Transfection Reagent和ExpiSf9對重組Bacmid進行高密度懸浮轉(zhuǎn)染，可在6～10 d內(nèi)獲得足量、高病毒滴度和高表達量的低代次重組桿狀病毒，為利用重組桿狀病毒表達外源蛋白的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了一條可行的路徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ExpiSf9細胞、Sf-900TMⅡ SFM、Opti-MEM、DAB Kit、ExpiFectamineTMSf Transfection Reagent、CellfectinTMⅡ Reagent、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG均購自于賽默飛世爾科技(中國)有限公司；NC膜購自上海生工；細胞板、細胞瓶購自康寧公司；臺盼藍細胞染色液購自于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；表達豬細小病毒VP2蛋白的重組Bacmid、Sf9細胞和豬細小病毒多克隆抗體由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心制備并保存。

1.2 表達豬細小病毒VP2重組桿狀病毒拯救

1.2.1 懸浮轉(zhuǎn)染

將懸浮Expisf9細胞稀釋至密度為2.50×106個/mL，置于27～28 ℃振蕩培養(yǎng)箱備用；取120 μL ExpiFectaminTMSf Transfection Reagent加入到1 mL opti-MEM無血清培養(yǎng)基中，顛倒混勻10 次，室溫靜置5 min，然后加入50 μg含有豬細小病毒 VP2基因的重組 Bacmid，輕柔混勻10次，室溫孵育5 min后，將混合液加入到100 mL 準(zhǔn)備好的Expisf9細胞中，在27～28 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染后24、48、72、96和120 h，分別取懸浮細胞100 μL，與0.4%的臺盼藍等體積混勻，使用細胞計數(shù)儀進行細胞密度和細胞活率的監(jiān)測，待懸浮轉(zhuǎn)染細胞活率降至70%～80%時，收獲重組桿狀病毒，并記為P0代。

1.2.2 貼壁轉(zhuǎn)染

6孔板中每孔接種Sf9細胞0.9×106～1×106個，室溫靜置30 min～1 h；取8 μL CellfectinTMⅡ Reagent 加入到100 μL Sf-900TMⅡ SFM中并充分混勻，取3 μg含有豬細小病毒 VP2基因的重組Bacmid加入到另一管100 μL Sf-900 Ⅱ SFM培養(yǎng)基中并充分混勻；將上述兩管合并混勻，置于室溫靜置孵育15～30 min；孵育結(jié)束后將混合液輕柔加入到細胞培養(yǎng)液中，置于27～28 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染3～5 h后換為含有10%血清的昆蟲細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)放入27 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染后每天觀察細胞狀態(tài)，待細胞出現(xiàn)明顯病變時收獲P0代重組桿狀病毒。

1.3 重組桿狀病毒P0代滴度測定

將兩種轉(zhuǎn)染方式收獲的P0代重組桿狀病毒10倍梯度稀釋后，分別接種于鋪有Sf9細胞的96孔板，每孔6.5×104個細胞，27 ℃培養(yǎng)箱吸附1 h后，換為甲基纖維素的半固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)43～48 h，吸棄半固體培養(yǎng)基，80%丙酮固定細胞后加入桿狀病毒囊膜蛋白gp64的單克隆抗體，孵育1 h后洗3 次，然后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育1 h，最后通過底物顯色，在顯微鏡下對出現(xiàn)藍色斑點的數(shù)量進行統(tǒng)計，計算不同轉(zhuǎn)染方式獲得的P0代重組桿狀病毒滴度(PFU/mL)。

1.4 P0代重組桿狀病毒的蛋白表達鑒定

將不同轉(zhuǎn)染方式獲得的P0代重組桿狀病毒培養(yǎng)物進行超聲破碎4 ℃，12 000 r/min，離心10 min，取上清進行SDS-PAGE、Western blot等鑒定。SDS-PAGE和Western blot的具體步驟為：制備電泳樣品進行SDS-PAGE，同時將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，以鼠源豬細小病毒多抗血清按照 1∶1 000稀釋后作為一抗，37 ℃ 孵育1 h，PBST 洗滌后，使用HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)作為二抗，孵育1 h，使用DAB顯色試劑盒避光顯色2 min，終止顯色后分析蛋白的反應(yīng)性。

1.5 重組桿狀病毒傳代及HA效價測定

將收獲的P0代重組桿狀病毒以體積比1∶100接種Sf9細胞，接種72 h待細胞病變明顯時，收獲上清即為P1代重組桿狀病毒毒種，按照此方法依此獲得P2～P5代重組桿狀病毒，對P0～P5代重組桿狀病毒表達豬細小病毒VP2的HA效價進行測定。

HA效價測定具體方法為：在96孔V型微量反應(yīng)板每孔均加25 μL PBS，吸取25 μL離心，上清加入第1孔混勻；從第1孔吸取25 μL混合液加入第2孔混勻，依次倍比稀釋，最后一孔不加抗原作為空白對照，每孔加入25 μL 0.5%豚鼠紅細胞懸液，輕輕震蕩均勻，室溫靜置1 h后觀察結(jié)果。在空白對照成立的條件下，以出現(xiàn)100%凝集的最高稀釋倍數(shù)為HA效價。

2 結(jié)果

2.1 不同轉(zhuǎn)染方式對細胞增殖及細胞活率的影響

提取的PPV VP2 Bacmid分別進行貼壁轉(zhuǎn)染Sf9或高密度懸浮轉(zhuǎn)染ExpiSf9細胞，使用細胞計數(shù)儀對細胞數(shù)和細胞活率進行統(tǒng)計，結(jié)果如圖1和圖2所示。轉(zhuǎn)染后第3天ExpiSf9細胞密度由初始的2.50×106個/mL增加至6.53×106個/mL，并在轉(zhuǎn)染后第4天達到至7.47×106個/mL，且細胞活率都保持在95% 以上。在轉(zhuǎn)染后第3天，Sf9細胞的細胞密度增加到0.95×106個/mL，細胞活率同樣保持在95%以上，但轉(zhuǎn)染第4天后細胞密度下降至0.76×106個/mL，活率也下降至89.2%。通過對比不同轉(zhuǎn)染方式后細胞密度和活率變化，結(jié)果表明，無論使用Cellfectin Ⅱ Reagent 對Sf9細胞進行貼壁轉(zhuǎn)染，還是ExpiFectamineTMSf Transfection Reagent對ExpiSf 9進行懸浮轉(zhuǎn)染后細胞數(shù)量依然在進行生長，表明轉(zhuǎn)染試劑并沒有對細胞增殖造成傷害。

圖1 懸浮或貼壁轉(zhuǎn)染對細胞密度的影響

圖2 不同轉(zhuǎn)染方式細胞活率變化

2.2 不同轉(zhuǎn)染方式對P0代重組桿狀病毒滴度的影響

對貼壁轉(zhuǎn)染Sf9和高密度懸浮轉(zhuǎn)染ExpiSf9獲得的P0代重組病毒進行病毒滴度測定，使用針對桿狀病毒gp64抗體作為一抗，測定結(jié)果如圖3所示。貼壁轉(zhuǎn)染方式P0代病毒滴度為1.8×107PFU/mL，而懸浮轉(zhuǎn)染ExpiSf9 獲得的P0代病毒滴度為1.2×108PFU/mL，高密度懸浮轉(zhuǎn)染方式獲得的P0代重組桿狀病毒滴度要明顯高于貼壁轉(zhuǎn)染方式。

圖3 不同轉(zhuǎn)染方式獲得的P0重組病毒滴度

2.3 不同轉(zhuǎn)染方式對P0代重組桿狀病毒蛋白表達量的影響

對不同轉(zhuǎn)染方式收獲的P0代重組桿狀病毒進行VP2蛋白表達鑒定，通過SDS-PAGE和Western blot分別檢測外源蛋白的表達情況。SDS-PAGE鑒定表明不同轉(zhuǎn)染方式獲得的重組桿狀病毒均有條帶，大小與預(yù)期蛋白大小(65 kDa)一致。高密度懸浮轉(zhuǎn)染獲得的P0代重組桿狀病毒所表達的VP2蛋白量要高于貼壁轉(zhuǎn)染所獲得的重組蛋白量(圖4)。Western blot鑒定結(jié)果如圖5所示，兩種P0代重組桿狀病毒表達的豬細小病毒VP2蛋白均能夠與鼠源豬細小病毒多抗血清反應(yīng)，表明重組PPV VP2蛋白具有良好反應(yīng)原性。

M.蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量；1.Sf9細胞對照；2.貼壁轉(zhuǎn)染獲得的PPV VP2蛋白；3.高密度懸浮轉(zhuǎn)染獲得的PPV VP2蛋白

M.蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量；1.Sf9細胞對照；2.貼壁轉(zhuǎn)染獲得的PPV VP2蛋白；3.高密度懸浮轉(zhuǎn)染獲得的PPV VP2蛋白

2.4 不同轉(zhuǎn)染方式對不同代次病毒外源蛋白HA效價的影響

對收獲的貼壁轉(zhuǎn)染和高密度懸浮轉(zhuǎn)染獲得的P0代重組桿狀病毒，分別傳代至P5代，測定P0～P5代重組桿狀病毒表達PPV VP2的HA效價。不同代次重組PPV VP2 蛋白的HA效價變化如圖6所示。相對于貼壁轉(zhuǎn)染方式，懸浮轉(zhuǎn)染獲得的P0代和P1代重組病毒，所表達的重組PPV VP2、HA效價提高極顯著(P<0.01)獲得的P0代重組病毒，高密度懸浮轉(zhuǎn)染獲得的P0代重組病毒接種Sf9細胞表達的重組PPV VP2蛋白的HA效價提高8倍，且高密度懸浮轉(zhuǎn)染獲得重組病毒通過傳代獲得的P1～P5代表達的重組PPV VP2 HA效價均較高，P1代就能達到19 log2，而貼壁轉(zhuǎn)染方式獲得的重組病毒需要傳至P3代時才能達到此水平。

**差異極顯著，P<0.01

3 討論

桿狀病毒表達系統(tǒng)具有外源基因容量大、翻譯后修飾功能、生物安全性好、體外培養(yǎng)簡單等特點，被廣泛地應(yīng)用于不同物種來源的重組蛋白的表達[10-11]。目前使用昆蟲細胞體外培養(yǎng)是獲得大量重組桿狀病毒簡便有效的方法，常采用重組Bacmid貼壁轉(zhuǎn)染Sf9細胞以獲得重組桿狀病毒，但由于貼壁Sf9細胞數(shù)量有限，且獲得的P0代重組桿狀病毒體積較小病毒滴度較低，需要多次傳代才能到達所需的體積和病毒滴度，然而，重組桿狀病毒在連續(xù)生產(chǎn)或按比例擴繁過程中會形成和積累DI(defective interfering particle，DI)顆粒，這些不能自主復(fù)制的缺陷干擾顆粒的基因組比例缺失高達40%[12-14]。隨著缺陷型重組桿狀病毒在搖瓶培養(yǎng)/或生物反應(yīng)器中的連續(xù)傳代，占比逐漸增加，結(jié)果導(dǎo)致外源蛋白產(chǎn)量下降[7,15]。因此，采用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法，對于實驗室進行蛋白表達可能不受影響，但對于重組桿狀病毒產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化仍然存在問題。

為了減少由于DI顆粒的產(chǎn)生導(dǎo)致外源蛋白表達量降低的影響，近些年來科學(xué)家們不斷對載體進行基因改造以期望獲得更加穩(wěn)定的桿狀病毒載體，同時也在不斷的進行培養(yǎng)基改良，生物反應(yīng)器的使用以及工藝方面的優(yōu)化等多方面的努力，為后續(xù)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定理論和實踐基礎(chǔ)。我們在實際生產(chǎn)過程也嘗試多種優(yōu)化方案，其中包括高密度懸浮轉(zhuǎn)染，這種轉(zhuǎn)染方式獲得的低代次高滴度的重組桿狀病毒，便于在后續(xù)使用過程中以低感染復(fù)數(shù)進行感染，可以減少傳代效應(yīng)對外源蛋白表達量的影響。在當(dāng)前無法完全克服由于傳代產(chǎn)生DI顆粒，并導(dǎo)致外源蛋白表達量大幅度降低的條件下，選擇高密度懸浮轉(zhuǎn)染在低代次提供足量種子批，為后續(xù)生產(chǎn)提供保障，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了一條可行的路徑。