翟少華，向微微，胡美荷，孫亞偉，蒙建菊，葉夢(mèng)珺，候萌，阿麗雅，王金泉*，胡燕

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2. 新疆維吾爾自治區(qū)科技人才開(kāi)發(fā)中心，新疆 烏魯木齊 830011)

新疆是我國(guó)重要的羊養(yǎng)殖和羊肉生產(chǎn)地區(qū)，其肉羊品種也以脂臀羊居多，阿勒泰大尾羊成年后尾脂可達(dá)體重的17%[1]。養(yǎng)殖業(yè)中，胴體中脂肪的沉積水平是影響肉質(zhì)的關(guān)鍵因素，畜禽脂肪過(guò)度沉積會(huì)影響畜禽的生產(chǎn)效能[2]?，F(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)中的過(guò)量脂肪是畜禽業(yè)面臨的主要問(wèn)題之一[3-4]。羊尾脂是指綿羊尾內(nèi)部的大體積脂肪，可食用，目前多用于日化產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。此外，羊尾脂具有藥用價(jià)值，廣泛應(yīng)用于新疆少數(shù)民族醫(yī)藥[5]。但過(guò)多的脂肪沉積不利于生產(chǎn)者和消費(fèi)者，因?yàn)槔速M(fèi)了膳食能量，同時(shí)也產(chǎn)生了經(jīng)濟(jì)價(jià)值較低的產(chǎn)品，降低產(chǎn)量，因此，減少脂肪產(chǎn)生，以及減少脂肪在身體和尾部的沉積，是綿羊產(chǎn)業(yè)的主要目標(biāo)[6]。

和田羊和小尾寒羊都是新疆地區(qū)廣泛養(yǎng)殖的肉羊品種，相比于阿勒泰大尾羊，和田羊和小尾寒羊的尾脂沉積較少。有報(bào)道稱，油紅O染色下，小尾寒羊尾脂脂肪細(xì)胞多呈形態(tài)均勻的卵圓形[7]，但對(duì)于和田羊尾脂的形態(tài)學(xué)研究和二者的羊尾脂脂肪細(xì)胞的顯微、超微結(jié)構(gòu)鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)光學(xué)顯微鏡和透射電鏡技術(shù)，主要研究和田羊和小尾寒羊尾部脂肪細(xì)胞顯微、超微結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)與異同，為進(jìn)一步探究羊尾部脂肪的形成機(jī)制，調(diào)控羊尾部脂肪過(guò)度沉積奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試劑

選擇15月齡成年雄性和田羊和小尾寒羊共12只，按品種分為2組，每組6只，去除毛皮的新鮮尾部脂肪，通過(guò)2.5%的戊二醛固定液(電鏡保存方法)、速凍方法來(lái)保存樣品(冰凍切片保存)。

無(wú)水乙醇、二甲苯、丙酮購(gòu)自于天津市化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉購(gòu)自于立杰國(guó)際貿(mào)易有限公司；苦味酸、液體石蠟、中性樹(shù)膠、油紅O染色液均購(gòu)自于烏魯木齊市阜瑞克生物科技有限公司；戊二醛、鋨酸購(gòu)自于金川集團(tuán)有限公司技術(shù)中心；檸檬酸鉛、醋酸鈾購(gòu)自于湖北楚盛威化工有限公司； Epon 812 包埋劑、OCT冰凍切片包埋劑購(gòu)自于上海易微信息科技有限公司；環(huán)氧樹(shù)脂512、十二烷基琥珀酸(DDSA)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、二乙基苯胺(DEA)、氫氧化鈉、重蒸水、三氯甲烷配制的0.25%福爾蒙瓦爾膜、濃H2SO4均為市售。

1.2 脂肪組織冰凍切片制備

1.2.1 樣本固定

樣品托上涂一層OCT包埋膠，將速凍組織置于其上，4 ℃冰箱預(yù)冷5～10 min再用OCT膠浸透包埋組織塊。取下組織并置于錫箔或者玻片上，并將其放置樣品托上，再添一層OCT膠，完全覆蓋，置速凍架(PE)上30 min。

1.2.2 冰凍切片

恒溫冰凍切片機(jī)為較理想的冰凍切片機(jī)，其基本結(jié)構(gòu)是將切片機(jī)置于低溫密閉室內(nèi)，故切片時(shí)不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至5～10 μm。切片時(shí)，低溫室內(nèi)溫度以-15～-20 ℃為宜，切好的切片室溫放置30 min后，烘箱干燥20 min，室溫自然冷卻。

1.3 油紅O染色法

1.3.1 油紅O染色液配制

飽和油紅O原液按油紅O∶蒸餾水=3∶2加入蒸餾水，混勻，室溫放置5～10 min ，過(guò)濾后使用。

1.3.2 染色步驟

切片用甲醛-鈣固定10 min；蒸餾水充分洗滌；60%異丙醇浸洗；油紅O染液染色10 min(染液可回收再利用)；60%異丙醇分化至間質(zhì)清晰；蒸餾水洗；Mayer蘇木素復(fù)染；蒸餾水洗；甘油明膠封片。

顯微鏡觀察結(jié)果：組織細(xì)胞中脂滴呈鮮紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，間質(zhì)無(wú)色。60%異丙醇分化，可在鏡下控制至脂肪組織呈鮮紅色，間質(zhì)無(wú)色。

1.4 脂肪組織透射電子顯微鏡鏡樣品制備

剪取一小塊組織，用雙面刀片將材料切成約1 mm × 1 mm × 3 mm的長(zhǎng)塊，逐一放入盛有預(yù)冷的新鮮2.5%戊二醛固定液的小管中，放入冰箱4 ℃低溫固定24～48 h 。

取和田羊和小尾寒羊尾部脂肪組織樣 1 mm3，用 2.5%戊二醛固定液固定24 h，然后以0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液清洗3 ～ 5 次，15～20 min/次；再用 2%鋨酸固定3 h 。固定后用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液清洗樣品，重復(fù)3～5 次，15～20 min/次；將固定的樣品分別在30%、50%、70%、80%、90%、100%系列濃度乙醇由低到高逐級(jí)加入到原固定瓶中脫水，各濃度脫水15 min；脫水后分別在無(wú)水乙醇∶丙酮(比例為1∶1)、無(wú)水乙醇∶丙酮(比例為 1∶4)、純丙酮中置換，各30 min；置換后用 Epon 812 包埋劑∶丙酮(比例為1∶1)、Epon 812 包埋劑∶丙酮(比例為4∶1)、Epon 812 包埋劑滲透，各3 h ；滲透后用 Epon 812 包埋劑進(jìn)行包埋，聚合條件為37 ℃聚合12 h ，45 ℃聚合12 h，60 ℃聚合48 h ；對(duì)聚合好的聚合塊進(jìn)行修塊、切片，超薄切片厚度為70～100 nm；用醋酸鈾染色液和檸檬酸鉛染色液分別染色20 min，然后再用水沖洗；將染色后的銅網(wǎng)放在鋪有濾紙的平皿中晾干，將染色好的切片置透射電子顯微鏡下，觀察并記錄細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 和田羊、小尾寒羊尾脂脂肪組織顯微結(jié)構(gòu)

光學(xué)顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖1所示。脂肪組織切片染色均勻，脂滴無(wú)色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色緊貼于細(xì)胞膜的一側(cè)。視野下可見(jiàn)和田羊尾脂的脂肪細(xì)胞呈扁橢圓形，排列緊密，間質(zhì)結(jié)構(gòu)較少，細(xì)胞數(shù)量多(圖1A)；小尾寒羊尾脂細(xì)胞脂滴較大，細(xì)胞輪廓清晰，間質(zhì)結(jié)構(gòu)多，細(xì)胞數(shù)量少(圖1B)。由圖2可見(jiàn)，和田羊和小尾寒羊尾脂脂肪細(xì)胞間的長(zhǎng)徑差異不顯著(P>0.05)，和田羊尾脂脂肪細(xì)胞短徑和細(xì)胞面積極顯著小于小尾寒羊(P<0.01)。

A.和田羊尾脂；B.小尾寒羊尾脂

A. 脂肪細(xì)胞長(zhǎng)徑長(zhǎng)度；B. 脂肪細(xì)胞短徑長(zhǎng)度；C. 脂肪細(xì)胞面積；數(shù)據(jù)為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”，**表示差異極顯著(P<0.01)

2.2 和田羊、小尾寒羊尾脂脂肪細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的比較

2.2.1 和田羊尾脂脂肪細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

在透射電鏡不同放大倍數(shù)下，均不能觀察到一個(gè)完整的尾脂脂肪細(xì)胞。如圖3所示：透射電鏡下連續(xù)觀察顯示，雙層膜明顯(圖3A、圖3B)，尾脂脂肪細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)一個(gè)融合的大脂滴，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核位于細(xì)胞內(nèi)一側(cè)的邊緣，占據(jù)較少空間。細(xì)胞周圍的薄層細(xì)胞質(zhì)中含一般的細(xì)胞器，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等(圖3B～圖3D)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面光滑，呈螺旋狀緊密排列(圖3E、圖3F)。細(xì)胞膜外側(cè)發(fā)現(xiàn)有特殊的“絨毛狀”結(jié)構(gòu)，并且周圍分布著較多的黑色點(diǎn)狀顆粒(圖3E、圖3G)，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，核膜電子密度較高，邊緣清晰，核質(zhì)電子密度比胞質(zhì)高(圖3H)。

圖中阿拉伯?dāng)?shù)字1為雙層膜，2為脂滴，3為線粒體，4為絨毛狀結(jié)構(gòu)，5為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，6為細(xì)胞核，7為核仁，8為細(xì)胞間質(zhì)

2.2.2 小尾寒羊尾脂脂肪細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

小尾寒羊尾脂肪細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器豐富，在電鏡視野下可以觀察到一個(gè)完整的脂肪細(xì)胞，如圖4所示。鏡下連續(xù)觀察結(jié)果顯示，脂肪細(xì)胞細(xì)胞膜及細(xì)胞間質(zhì)較寬，在脂肪細(xì)胞交界處，清晰可見(jiàn)許多大小、外形不一、散在的脂肪滴(圖4A、圖4B)。細(xì)胞中細(xì)胞器的特點(diǎn)是：可見(jiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)密集排列，表面光滑，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)散在分布有大量腫脹呈空泡狀的線粒體，其線粒體在大小、外形及線粒體嵴的排列上也有差異(圖4C至圖4G)。此外，在細(xì)胞膜的外側(cè)未見(jiàn)明顯“絨毛狀”結(jié)構(gòu)。 脂肪細(xì)胞間隙中細(xì)胞核體積較大，核仁染色質(zhì)豐富 (圖4E)。

圖中阿拉伯?dāng)?shù)字1為雙層膜，2為脂滴，3為線粒體，4為絨毛狀結(jié)構(gòu)，5為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，6為細(xì)胞核，7為核仁，8為細(xì)胞間質(zhì)

3 討論

試驗(yàn)選用的小尾寒羊是經(jīng)雜交選育的優(yōu)良品種，毛質(zhì)細(xì)軟、凈肉率高、肉質(zhì)好、尾較小、尾脂短[8]，而和田羊是新疆和田地區(qū)特有的地方品種，具有耐干旱、耐粗飼的特點(diǎn)，體格小，產(chǎn)肉性能低、尾短瘦，因此，在已知和田羊與小尾寒羊尾部外觀形態(tài)差異的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)觀察并比較了尾部脂肪細(xì)胞組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的異同。結(jié)果顯示，和田羊尾脂脂肪細(xì)胞呈橢圓形，胞內(nèi)細(xì)胞器豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈螺旋狀分布，線粒體于細(xì)胞內(nèi)邊緣分布，膜外有“絨毛狀”結(jié)構(gòu)和散在的黑色顆粒，這一特殊結(jié)構(gòu)與在阿勒泰大尾羊尾脂脂肪細(xì)胞的細(xì)胞膜外側(cè)發(fā)現(xiàn)的“發(fā)絲狀”結(jié)構(gòu)相似[9]，但其生理功能有待進(jìn)一步研究。小尾寒羊尾脂脂肪細(xì)胞體積大，細(xì)胞間質(zhì)寬，胞內(nèi)有豐富的未融合的小脂滴，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊并片狀結(jié)構(gòu)清晰，線粒體散在分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。和田羊和小尾寒羊尾脂脂肪細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)具有明顯差異。由于試驗(yàn)動(dòng)物均來(lái)自規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)，所以推測(cè)這種差異可能與其遺傳特性、脂肪沉積或相關(guān)脂代謝基因的存在或表達(dá)與否有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)室前期有研究結(jié)果顯示，脂肪與肥胖相關(guān)基因(FTO)基因表達(dá)水平在阿勒泰大尾羊和小尾寒羊之間存在品種間的差異[1]。綿羊品種之間的比較轉(zhuǎn)錄組的研究表明，尾脂形成差異也與脂質(zhì)、脂肪酸代謝相關(guān)途徑和細(xì)胞連接相關(guān)的途徑(如細(xì)胞黏附分子)有關(guān)[6,10-13]。上述研究結(jié)果表明到基因在綿羊尾部脂肪形成和脂質(zhì)代謝中的重要作用。隨著羊尾部脂肪沉積基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的完善，相關(guān)的研究技術(shù)有望應(yīng)用于綿羊優(yōu)良品種的選育、調(diào)節(jié)羊體脂質(zhì)代謝，進(jìn)而改善綿羊肉質(zhì)和提高畜牧生產(chǎn)效益。

總之，本次試驗(yàn)通過(guò)對(duì)和田羊和小尾寒羊尾脂顯微、超微結(jié)構(gòu)的觀察，對(duì)不同品種羊尾脂細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有初步的了解，對(duì)探究羊尾部脂肪的形成、脂肪代謝機(jī)制及種間差異的形成機(jī)制具有重要意義。