邵紅霞，汪 輝，秦秋明

（上海微譜化工技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 200438）

鹽酸法舒地爾是一種具有廣泛藥理作用的新型藥物，其分子結(jié)構(gòu)為5-異喹啉磺酰胺衍生物，是RHO 激酶抑制物，通過增加肌球蛋白輕鏈磷酸酶的活性擴(kuò)張血管，降低內(nèi)皮細(xì)胞的張力，改善腦組織微循環(huán)，不產(chǎn)生和加重腦的盜血，同時可拮抗炎性因子，保護(hù)神經(jīng)抗凋亡，促進(jìn)神經(jīng)再生[1-2]。鹽酸法舒地爾注射液于1995 年在日本上市，在臨床上用于蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣等引起的缺血性腦血管疾病癥狀的改善[3～4]。

鹽酸法舒地爾的合成是以5-異喹啉磺酸為起始原料，首先與氯化亞砜形成5-異喹啉磺酰氯鹽酸鹽，然后與高哌嗪反應(yīng)獲得法舒地爾，再進(jìn)一步成鹽、精制，制得鹽酸法舒地爾[5]。鹽酸法舒地爾合成路線不是很長，起始原料有可能會殘留在工藝過程之中；另外，鹽酸法舒地爾潛在的一種降解方式是5-異喹啉磺酸和高哌嗪解離，降解后產(chǎn)生高哌嗪[6]。因此，為了嚴(yán)格控制鹽酸法舒地爾注射液的質(zhì)量，需要對其中的高哌嗪進(jìn)行檢測。

高哌嗪沒有紫外吸收，極性大，不易用液相分析。目前普遍采用離子色譜法進(jìn)行檢測。張錦梅等[7]采用非抑制電導(dǎo)離子色譜法對高哌嗪進(jìn)行了測定，但靈敏度較低。陳梅蘭等[8]采用抑制性離子色譜法對鹽酸法舒地爾原料中高哌嗪進(jìn)行測定，靈敏度高，但樣品需過固相萃取小柱，操作繁瑣。近期，楊萬運等[9]公開了一種高哌嗪的高效液相檢測方法，利用衍生化試劑將熒光基團(tuán)加在高哌嗪的氨基上，再利用高效液相色譜法進(jìn)行定性和定量分析，缺點是需要柱前衍生，耗時費力。本文通過探索研究，將樣品稀釋后有機相萃取進(jìn)樣，無需樣品固相小柱凈化或衍生，采用超高液相色譜-電噴霧電離-三重四極桿質(zhì)譜法（UPLCESI-MS/MS），建立了在4 min 內(nèi)快速、高效測定鹽酸法舒地爾注射液中高哌嗪含量的方法。經(jīng)方法學(xué)驗證，該法靈敏度高、專屬性強、精密度好、回收率良好，可準(zhǔn)確測定鹽酸法舒地爾注射液中高哌嗪的含量。

1 實驗部分

1.1 儀器

ACQUITY I CLASS &QTRAP 4500 超高效液相色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，XPR206DR/A 型十萬分之一電子天平（METTLER TOLEDO 公司），Direct 8 超純水儀（密理博公司），XW-80A旋渦混合器（常州阿米勒儀器科技有限公司）。

1.2 對照品與試劑

對照品：高哌嗪，含量為99.99%，批號為L8A0T61，購自北京百靈威科技有限公司。

試劑：乙腈，質(zhì)譜純，購自LiChrosolv；甲醇，質(zhì)譜純，購自SIGMA-ALDRICH；氯化鈉、氫氧化鈉，均為分析純，購自GENREAL-REAGENT；甲酸，純度為98%，購自Adamas-beta；純化水為Direct 8 制備的超純水。

樣品：國內(nèi)某藥企鹽酸法舒地爾注射液加速6 個月試驗（40 ℃/75%RH）及長期12 個月試驗（30 ℃/65% RH）樣 品（批 號：FAIRM002、FAIRM003、FAIRM004），規(guī)格為2 mL：30 mg。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜質(zhì)譜條件

色譜、質(zhì)譜條件等參數(shù)見表1～表3。

表1 色譜條件

表2 流動相梯度表

表3 質(zhì)譜參數(shù)

1.3.2 溶液的制備

（1）稀釋劑：1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液。

（2）萃取劑：乙腈。

（3）對照品母液

稱取高哌嗪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)52.390 mg 置于10 mL棕色樣品瓶中，用純化水溶解后稀釋至刻度，搖勻；量取上述溶液229.0 μL 置于10 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為120.0 μg·mL-1的對照品母液。

（4）對照品溶液

量取對照品母液100.0 μL 置于20 mL 棕色樣品瓶中，加入稀釋劑10.00 mL，混勻，再加入萃取劑10.00 mL，最后加入氯化鈉至底部呈現(xiàn)流沙狀，渦旋0.5 min，靜置5 min，取上層溶液約1 mL 置于2 mL 棕色進(jìn)樣小瓶中，得到濃度為1200 μg·L-1的對照品溶液。

（5）供試品溶液

量取樣品400.0 μL 置于20 mL 棕色樣品瓶中，加入稀釋劑9.600 mL，混勻，再加入萃取劑10.00 mL，最后加入氯化鈉至底部呈現(xiàn)流沙狀，渦旋0.5 min，靜置5 min，取上層溶液約1 mL 置于2 mL棕色進(jìn)樣小瓶中，上機測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理的優(yōu)化

對前處理樣品稀釋劑進(jìn)行了詳細(xì)考察。比較了高哌嗪分別用純水、0.1%甲酸、1 mol·L-1氫氧化鈉水溶液稀釋后再用乙腈萃取的回收率和穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將高哌嗪用1 mol·L-1氫氧化鈉水溶液稀釋后再用乙腈萃取具有較高的回收率，且結(jié)果穩(wěn)定。推測可能是因為鹽酸法舒地爾注射液呈酸性，堿性的稀釋劑有利于高哌嗪從酸性溶液中游離出來，提高萃取率，從而增加了回收率。

2.2 供試品溶液保存條件

鹽酸法舒地爾注射液說明書中明確貯藏條件為遮光、密閉保存。試驗中發(fā)現(xiàn)供試品溶液若不避光保存，則回收率明顯偏高，推斷鹽酸法舒地爾易見光降解成高哌嗪。將供試品溶液使用棕色瓶避光保存后回收率正常，且在室溫下24 h 穩(wěn)定，故分析過程中應(yīng)注意將供試品溶液避光放置。

2.3 質(zhì)譜參數(shù)的考察

對質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的高哌嗪溶液在電噴霧離子源（ESI）下進(jìn)行一級質(zhì)譜母離子掃描，結(jié)果表明，在ESI 正離子模式下高哌嗪有更好的響應(yīng)，母離子為101；進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，尋找子離子碎片，確定豐度較高的子離子為定量離子，最終確定響應(yīng)豐度較高的離子為84.1 和58.1。確定定量離子為58.1Da 后，繼續(xù)在多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）下優(yōu)化最佳去簇電壓（DP）和最佳碰撞能量（CE），以達(dá)到最佳的檢測靈敏度，參數(shù)優(yōu)化后的結(jié)果見表4。

表4 UPLC-MS/MS 的掃描參數(shù)

2.4 專屬性考察結(jié)果

將試劑空白溶液、對照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣測試，高哌嗪出峰處無干擾，專屬性良好。結(jié)果見圖1（對照品溶液譜圖）和圖2（供試品溶液譜圖）。

圖1 對照品溶液譜圖

圖2 鹽酸法舒地爾注射液譜圖

2.5 線性與范圍結(jié)果

量取對照品母液30.0 μL、50.0 μL、100.0 μL、150.0 μL、200.0 μL，分別于20 mL 棕色樣品瓶中加入稀釋劑10.00 mL，混勻，再加入萃取劑10.00 mL，最后加入氯化鈉至底部呈現(xiàn)流沙狀，渦旋0.5 min，靜置5 min，配制360～2400 μg·L-1五個系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取上層溶液約1 mL 置于2 mL 棕色進(jìn)樣小瓶中。按表1～表4 試驗條件測定，以目標(biāo)物的濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，線性結(jié)果：Y=92.5X+517，r=0.9977，見圖3，表明高哌嗪在360～2400 μg·L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖3 高哌嗪線性擬合譜圖

2.6 檢測限結(jié)果

取高哌嗪對照品溶液逐步稀釋，以S/N≈3 時檢測限濃度為60 μg·mL-1，相當(dāng)于限值濃度的5%。

2.7 重復(fù)性結(jié)果

量取樣品母液400.0 μL 置于20 mL 棕色樣品瓶中，加入高哌嗪標(biāo)準(zhǔn)儲備液100.0 μL，加入稀釋劑9.600 mL，混勻，再加入萃取劑10.00 mL，最后加入氯化鈉至底部呈現(xiàn)流沙狀，渦旋0.5 min，靜置5 min，取上層溶液約1 mL 置于2 mL 棕色進(jìn)樣小瓶中，上機測試。配制6 份，試驗結(jié)果見表5。

表5 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.8 準(zhǔn)確度結(jié)果

量取樣品母液400.0 μL 置于20 mL 棕色樣品瓶中，分別加入高哌嗪標(biāo)準(zhǔn)儲備液30.0 μL、100.0 μL 和150.0 μL，加入稀釋劑9.600 mL，混勻，再加入萃取劑10.00 mL，最后加入氯化鈉至底部呈現(xiàn)流沙狀，渦旋0.5 min，靜置5 min，取上層溶液約1 mL 置于2 mL 棕色進(jìn)樣小瓶中，上機測試，每個準(zhǔn)確度水平平行配制3 份，試驗結(jié)果見表6。

表6 準(zhǔn)確度試驗結(jié)果

2.9 溶液穩(wěn)定性結(jié)果

取新鮮配制的對照品溶液和100%準(zhǔn)確度水平溶液（置于棕色小瓶避光保存）作為0 h 穩(wěn)定性考察溶液，于0 h、3 h、6 h、18 h、24 h 分別進(jìn)樣，各時間點與零點的濃度比值在93%～103%之間，表明對照品溶液和供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 耐用性結(jié)果

改變流速（±10%）、柱溫（±1 ℃）、流動相中甲醇比例（±5%）后，100%準(zhǔn)確度水平供試品溶液中高哌嗪含量RSD 不超過1%。表明本方法的耐用性較好。

2.11 樣品檢測及安全性評估

高哌嗪是鹽酸法舒地爾合成工藝中用到的一種原料，同時也是其降解雜質(zhì)，根據(jù)藥監(jiān)局的相關(guān)要求，鹽酸法舒地爾中高哌嗪的含量不得超過0.1%，其注射液中高哌嗪的含量不得超過0.2%[10]。取國內(nèi)某藥企3 批樣品（批號：FAIRM002、FAIRM003、FAIRM004）加速6 個月試驗（40 ℃/75%RH）及長期12 個月試驗（30 ℃/65%RH），按1.3.2 項方法制備樣品及對照品溶液，按表1～表4 條件測定。結(jié)果表明，3 批加速6 個月及長期12 個月樣品中高哌嗪含量均未檢出，即低于檢測限（100%限值濃度的5%）。表明該藥企鹽酸法舒地爾注射液中高哌嗪的安全風(fēng)險較低。

3 結(jié)論

本文建立了一種鹽酸法舒地爾注射液中高哌嗪的準(zhǔn)確定量測定方法，具有前處理簡單，分析快速、靈敏度高、測定結(jié)果準(zhǔn)確、專屬性強等諸多優(yōu)點，可應(yīng)用于鹽酸法舒地爾注射液質(zhì)量監(jiān)測。