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        食管鱗狀細胞癌中CHI3L1、E-cadherin及Snail相關(guān)性研究及其意義

        2021-08-06 03:27:22趙文俊秦燕子馬莉蔡兆根秦永明
        中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志 2021年6期
        關(guān)鍵詞:食管癌陽性率淋巴結(jié)

        趙文俊 秦燕子 馬莉 蔡兆根 秦永明

        食管癌(Esophageal cancer, EC)的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)一直位居前列,死亡率位于第六位[1]。EC在中國的發(fā)病率和死亡率一直保持在較高水平[2],其中食管鱗狀細胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是最主要的組織學(xué)類型[3]。盡管目前腫瘤的綜合治療有了很大改善,但是食管癌的侵襲、轉(zhuǎn)移仍然給患者帶來致命性危害。近年關(guān)于分子靶向治療已成為研究熱點,也在ESCC臨床治療中取得了較好的療效,但是目前關(guān)于EC的發(fā)生、發(fā)展機制仍不清楚。

        CHI3L1(Chitinase-3-like protein 1)又稱YKL-40,位于1q32.1染色體上,編碼CHI3L1蛋白,作為一種分泌型糖蛋白可分泌至細胞外進入循環(huán)系統(tǒng),在炎性疾病及腫瘤中發(fā)揮重要作用[4]。在嚴重細菌感染[5]、炎癥性腸病[6]等慢性炎癥性疾病中血清CHI3L1明顯升高,且其升高水平與部分疾病的嚴重程度呈正相關(guān)。此外,CHI3L1在多種惡性腫瘤患者血清及腫瘤細胞中高表達,且預(yù)示著腫瘤患者生存及預(yù)后不佳,提示其在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮一定作用[7,8]。CHI3L1與ESCC發(fā)生的關(guān)系目前國內(nèi)外文獻報道較少,本次實驗擬通過研究CHI3L1、E-cadherin與Snail的關(guān)系來探討ESCC的發(fā)生機制。

        1 材料與方法

        1.1 臨床資料收集2014年1~12月我院及蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院ESCC存檔標本164例。其中男134例,女30例;<65歲70例,≥65歲94例;腫瘤大體形態(tài):潰瘍型70例,髓質(zhì)型66例,蕈傘型18例,縮窄型10例;腫瘤位置:上段17例,中段77例,下段70例;組織學(xué)分化程度:高分化27例,中分化105例, 低分化32例;瘤體大?。海?.5cm 83例,≥3.5cm 81例;浸潤深度:侵及外膜層59例,未至外膜層105例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:有61例,無103例;pTNM分期:Ⅰ+Ⅱ期114例,Ⅲ+Ⅳ期50例。收集2019年9~11月術(shù)前活檢已證實為ESCC新鮮組織標本10例及其對應(yīng)的癌旁標本(距癌灶5cm以上的食管上皮組織),其中男7例,女3例;<65歲的2例,≥65歲的8例;腫瘤大體形態(tài):潰瘍型3例,髓質(zhì)型5例,蕈傘型1例,縮窄型1例;腫瘤位置:上段2例,中段7例,下段1例;組織學(xué)分化程度:高分化5例,中分化3例,低分化2例;瘤體大小:<3.5cm 5例,≥3.5cm 5例;浸潤深度:侵及外膜層6例,未至外膜層4例;發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6例,未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例;pTNM分期:Ⅰ+Ⅱ期8例,Ⅲ+Ⅳ期2例。本研究得到患者同意,且術(shù)前均未行放、化療等治療。病理診斷結(jié)果由兩位高年資病理醫(yī)生共同判定。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 實驗試劑 抗體:兔多克隆CHI3L1(ab77528,Abcam,USA), E-cadherin(AF0131,Affinity Biosciences,USA),Snail(AF6032,Affinity Biosciences,USA),ElivisionTMplus試劑盒和DAB顯色試劑盒購自福州邁新有限公司。PMSF,RIPA裂解液購自Beyotime公司, ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、PVDF 購自Merck Millipore公司,脫脂奶粉購自Bio-Rad公司。MMLV購自Promega公司,real- time PCR反應(yīng)液配制(20μl反應(yīng)體系,染料法)采用TaKaRa公司的產(chǎn)品,Trizol購自Invitrogen公司,RNA保護液購自TIANGEN公司。引物序列由Sangon Biotech合成。

        1.2.2 Western blot實驗 ESCC新鮮標本離體后剪取適量癌組織及癌旁組織分別放入EP管中,做好標記,迅速放入液氮罐中,備用。取300mg新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品,加1ml含PMSF的強RIPA裂解液,用電動勻漿器進行破碎勻漿,將加入裂解液后收集的樣品置冰上,裂解20~30min,4℃,12 000r,離心10min,取上清,即為提取的總蛋白。按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作(Beyotime,P0010),測定樣品濃度。取適量蛋白樣品,加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液,用漩渦振蕩器震蕩混勻,離心,置于100℃水浴加熱5min,使蛋白充分變性。把蛋白樣品和預(yù)染蛋白marker直接上樣到預(yù)先配制的SDS-PAGE 膠加樣孔內(nèi);加入電泳液,開始電泳,轉(zhuǎn)膜,將洗滌液吸去,加入Western 封閉液(5%脫脂奶粉溶液),在搖床上緩慢搖動,室溫封閉1h。加入稀釋好的一抗(CHI3L1稀釋比1:1 000,E-cadherin 稀釋比1:500,Snail 稀釋比1:500),加稀釋好的HRP標記二抗,加入TBST洗滌液,在搖床上緩慢搖動洗滌 10min×3 次;將洗滌后的膜用濾紙吸干表面洗滌液,立刻加上配制好的ECL試劑進行化學(xué)發(fā)光法檢測,膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育,經(jīng)膠片曝光顯影,掃描灰度值。重復(fù)3次實驗。

        1.2.3 實時熒光定量PCR 剪取適量ESCC組織及癌旁組織放入EP管中,分別倒入適量 RNA保護液,做好標記,4℃過夜,倒出RNA保護液,放入液氮罐中,備用。組織樣品按50~100mg/ml Trizol加入Trizol,另外,組織體積不能超過Trizol體積的10%,用電動勻漿器充分勻漿1~2min,充分裂解,實驗操作參照Invitrogen公司的 Trizol 使用說明書。提取出的mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄,參照 MMLV 系統(tǒng)使用說明書,總體積 25μl,制作 cDNA 模板。參照實時熒光定量PCR常用試劑使用說明書-染料法PCR Master Mix,加入上、下游引物,反應(yīng)體系為 20μl,進行 real-time PCR 實驗。95℃ 60s,60℃ 30s,95℃5s,溶解曲線分析(95℃ 15s,60℃ 60s,95℃ 15s),40個循環(huán)。重復(fù)3次實驗,獲得 CHI3L1,E-cadherin,Snail 及內(nèi)參 GAPDH 循環(huán) Ct 值(Ct 代表每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定閾值時的反應(yīng)循環(huán)數(shù))。引物見表1。

        表1 目的基因及參照基因引物序列及產(chǎn)物大小

        1.2.4 免疫組織化學(xué)實驗方法 參照 ElivisionTMplus試劑盒說明書。切片烤干,于二甲苯溶液及梯度濃度的乙醇中脫蠟至水洗,3%過氧化氫10min 左右,抗原修復(fù),滴一抗(CHI3L1稀釋比 1:1 000,E-cadherin稀釋比1:100,Snail 稀釋比1:100),放入 37℃恒溫箱1h,加增強劑(每塊組織加1滴)后放入37℃恒溫箱30min,滴二抗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染1min,鹽酸分析液分化,返藍2min,中性樹膠封片。采用已知陽性片作對照,以PBS 液代替一抗作空白對照。

        1.2.5 結(jié)果判定 Western blot實驗用目的基因的灰度值除以內(nèi)參的灰度值,以校正誤差,所得比值就是某樣本中目的蛋白的相對表達量。實時熒光定量PCR用△△Ct法算出每個目的基因的表達值,目的基因表達值=2-(目的基因 Ct-內(nèi)參基因 Ct)。免疫組化實驗結(jié)果采用半定量法。腫瘤細胞染色強度:0分示不著色,1分示淺黃色,2分示棕黃色,3分示棕褐色。陽性腫瘤細胞占比:0~10%為1分,11%~50%為2分,51%~75%為 3分,76%~100%為4分。染色強度與陽性比值相乘,>3分為陽性,≤3分為陰性。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗分析 CHI3L1,E-cadherin及 Snail 與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。CHI3L1,E-cadherin及Snail相關(guān)性使用Spearman分析。單因素分析采用 Kaplan-Meier分析,多因素分析采用Cox回歸模型分析。組間比較采用t檢驗。Western blot及實時熒光定量 PCR實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差(±s)表示。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 CHI3L1、E-cadherin、Snail蛋白及mRNA在ESCC組織及癌旁組織中的表達情況CHI3L1在ESCC新鮮組織中蛋白相對表達量為0.7907±0.4490,在癌旁組織中相對表達量為0.4102±0.2647,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.308,P<0.05)。E-cadherin蛋白在ESCC新鮮組織中相對表達量0.6060±0.1112,明顯低于癌旁組織的0.8170±0.2613,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.350,P<0.05)。在ESCC新鮮組織中 Snail蛋白相對表達量為0.5213±0.2432,在癌旁組織中為0.3250±0.1266,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.261,P<0.05)。在ESCC新鮮組織中CHI3L1 mRNA相對值為0.6504±0.5439,高于癌旁組織的0.0628±0.0955,Snail mRNA在新鮮癌組織中相對值為0.5464±0.7126。高于癌旁組織的0.0590±0.0562,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.365,P<0.05;t=2.156,P<0.05)。Ecadherin mRNA在ESCC新鮮組織中相對表達量為1.1990±1.4780低于癌旁組織的5.4260±2.6110,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.456,P<0.05)。CHI3L1,E-cadherin、Snail蛋白及mRNA在ESCC新鮮組織與癌旁組織中的差異表達見圖1、2。

        圖1 CHI3L1、E-cadherin、Snail蛋白及mRNA在ESCC組織及癌旁組織中的定量表達

        圖2 Western blot實驗中CHI3L1、E-cadherin及Snail蛋白表達情況

        2.2 CHI3L1、E-cadherin、Snail蛋白表達與ESCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系CHI3L1 及Snail 陽性表達為細胞漿中呈黃色或棕黃色顆粒著色;而 E-cadherin陽性表達為細胞膜呈黃色或棕黃色著色(見圖3)。腫瘤浸潤至漿外膜層的CHI3L1陽性率為82.9%(87/105),未浸潤至外膜層的CHI3L1陽性率為30.5%(18/59),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示浸潤深度越深,其越容易表達。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的 CHI3L1陽性率(88.5%,54/61)明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CHI3L1陽性率(49.5%,51/103),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。pTNM 分期中Ⅰ、Ⅱ期的 CHI3L1 陽性率為52.6%(60/114),Ⅲ、Ⅳ期的 CHI3L1 陽性率為90.0%(45/50),提示腫瘤pTNM 分期越高,CHI3L1 陽性率越高(P<0.05)。此外發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑越大,CHI3L1 陽性表達率越高(P<0.05)。不同年齡、性別、腫瘤位置及組織學(xué)分化程度的患者的CHI3L1蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的Snail陽性率明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05);腫瘤侵及漿膜層的Snail陽性率高于未侵及漿膜層的(P<0.05);不同性別、年齡、腫瘤大體類型、腫瘤位置、組織學(xué)分化程度及瘤體大小的患者的Snail 陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)?;颊吣挲g越大,瘤體越大,腫瘤組織分化越低,pTNM 分期越高,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或浸潤越深,E-cadherin 陽性率越低(P<0.05);而不同性別、腫瘤大體類型、腫瘤位置的患者的E-cadherin陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

        圖3 CHI3L1、Snail及E-cadherin在ESCC組織中的表達

        續(xù)表2

        2.3 CHI3L1,E-cadherin及Snail相關(guān)性分析CHI3L1蛋白與Snail蛋白呈明顯正相關(guān)(r=0.699,P<0.05),而與E-cadherin呈負相關(guān)(r=-0.380,P<0.05);Snail蛋白與 E-cadherin亦呈負相關(guān)(r=-0.481,P<0.05)。提示CHI3L1 與 Snail 具有正協(xié)同關(guān)系,而E-cadherin 與CHI3L1、Snail 具有負協(xié)同關(guān)系。見表3。

        表3 ESCC中CHI3L1、E-cadherin及Snail相關(guān)性

        2.4 生存分析患者5年生存率為35.9%(59/164)。Kaplan-Meier生存分析顯示CHI3L1、E-cadherin、Snail蛋白表達與患者生存相關(guān)(Log-rank=47.964,P<0.001;Log-rank=40.051,P<0.001;Log-rank=75.234,P<0.001;見圖4)。CHI3L1、Snail陽性率越高,患者生存時間越短(P<0.05);而E-cadherin陽性率越低,患者生存時間反而越短(P<0.05)。將患者年齡、性別、腫瘤位置、大體類型、腫瘤大小、組織學(xué)分級、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期、CHI3L1蛋白、E-cadherin蛋白及Snail蛋白納入 Cox回歸模型中,顯示CHI3L1、E-cadherin 及Snail因子可以作為ESCC患者獨立預(yù)后因素(P<0.05,見表4)。

        圖4 CHI3L1、E-cadherin 及 Snail陽性組和陰性組中生存分析

        表4 Cox回歸模型多因素生存分析

        續(xù)表4

        3 討論

        有研究顯示CHI3L1可以誘導(dǎo)炎性小體激活、細胞凋亡、癌變和腫瘤血管生成,參與免疫應(yīng)答、炎癥和細胞外基質(zhì)的形成,可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境,具有影響腫瘤生長、轉(zhuǎn)移等作用[9]。本次實驗中,我們證實了CHI3L1 在ESCC 中明顯高表達,并隨著癌組織浸潤深度的加深,淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移及pTNM分期越晚,CHI3L1蛋白表達越高,說明高表達CHI3L1可促進 ESCC 的侵襲、轉(zhuǎn)移,這與先前報道的結(jié)果一致[10,11]。有研究顯示CHI3L1在乳腺癌、腎細胞癌和結(jié)直腸癌患者血清中水平顯著升高,可作為判斷病情和預(yù)后的標志因子[12~14]。本次實驗通過Cox多因素分析顯示 CHI3L1可作為評估ESCC 患者生存的獨立預(yù)后因子,其高表達可能提示該患者預(yù)后不良,生存時間縮短。有研究也證實了血清CHI3L1升高與肺癌的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)[15,16]。Zheng等[10]指出CHI3L1聯(lián)合食管鱗狀細胞癌抗原(Squamous cell carcinoma antigen,SCCA)可顯著提高傳統(tǒng)食管癌腫瘤標志物癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen ,CEA)、SCCA檢測食管癌的敏感性。Xing等[11]首次證明了血清CHI3L1可作為食管癌預(yù)后監(jiān)測指標。

        E-cadherin是一種跨膜糖蛋白,屬于鈣黏蛋白家族之一,在正常上皮組織內(nèi)位于細胞膜中,具有黏附性,介導(dǎo)細胞黏膜,維持上皮結(jié)構(gòu)的完整性、細胞極性的作用[17]。本次實驗檢測了E-cadherin 在ESCC中表達降低,這與先前研究一致[18]。本次實驗發(fā)現(xiàn)隨著浸潤深度加深,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,pTNM分期越晚,E-cadherin表達降低,說明 E-cadherin蛋白表達缺失或降低可能促進ESCC腫瘤細胞黏附性降低,腫瘤細胞容易發(fā)生轉(zhuǎn)移、侵襲[19]。Zhai等[20]指出E-cadherin在ESCC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中表達降低,其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈明顯負相關(guān)(P<0.05)。國內(nèi)也有研究顯示E-cadherin蛋白表達隨著腫瘤浸潤深度的增加反而降低[21]。在本次實驗中,生存分析顯示E-cadherin蛋白表達越低,ESCC 患者預(yù)后越差,且 E-cadherin蛋白表達情況可以作為患者獨立預(yù)后因素。

        Snail是一種編碼鋅指結(jié)構(gòu)類型的轉(zhuǎn)錄因子,屬于鋅指結(jié)合蛋白基因家族,在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中發(fā)揮著重要作用[22]。Snail在多種惡性腫瘤中明顯高表達,包括乳腺癌[23]、結(jié)腸癌[24]、食管癌[25]等。本次實驗已證實Snail在ESCC中陽性率顯著增加(P<0.05),這與上述文獻報道一致。同時,腫瘤浸潤深度的增加,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,pTNM分期越高,Snail陽性率增加,提示ESCC發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移可能伴隨著Snail的高表達。Saitoh等[26]指出Snail可誘導(dǎo)EMT的發(fā)生并且在促進惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵性作用;吳宇翔等[27]發(fā)現(xiàn)SIRT1可通過調(diào)控Snail表達參與食管癌細胞株EMT發(fā)生,從而促進其侵襲轉(zhuǎn)移。在進行食管癌生存分析中,顯示Snail陽性組生存率顯著低于陰性組,Snail可以作為患者獨立預(yù)后影響因素,這與先前研究一致[25,28]。

        EMT可通過降低上皮標志物表達,增加間質(zhì)標志物表達,使得細胞粘附能力降低而增加細胞運動能力, 從而增加腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲能力[29]。大量研究顯示鈣黏蛋白E-cadherin及轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail是EMT重要調(diào)控分子。在本次實驗中通過Spearman相關(guān)性分析得出CHI3L1與Snail呈正相關(guān),而與E-cadherin呈負相關(guān),Snail與E-cadherin亦呈負相關(guān)。有文獻指出CHI3L1在乳腺癌等惡性腫瘤中可通過下調(diào) E-cadherin,從而加速腫瘤的進展;在乳腺癌上皮中通過CHI3L1過表達可以導(dǎo)致細胞的能動性增加,并且 E-cadherin 的表達減弱[30]。在非小細胞肺癌細胞系CL1-1、H23、H838、CL1-5 和 H2009中,CHI3L1調(diào)節(jié)EMT 標記物的表達,包括 Twist1、Snail、Slug、N-cadherin、Vimentin和E-cadherin,表明CHI3L1可通過促進肺癌細胞EMT發(fā)生從而增強腫瘤的遷移及侵襲能力[31]。復(fù)習(xí)文獻及結(jié)合本次實驗,我們認為在ESCC中高表達的CHI3L1與EMT發(fā)生密切相關(guān),但是具體的機制目前還不清楚。研究顯示Snail通過與E-cadherin啟動子上的E-box作用元件結(jié)合,抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄,從而抑制E-cadherin表達水平,上皮間連接發(fā)生破壞,誘導(dǎo)EMT發(fā)生[32,33]。有報道CHI3L1可能在磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT/mTOR信號通路調(diào)控中發(fā)揮作用,促使腫瘤存活、轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移[34,35]。有學(xué)者認為CHI3L1是通過AKT信號通路調(diào)節(jié)EMT必需基因,從而促進癌細胞的遷移和侵襲,推測CHI3L1有可能成為癌癥治療的靶標[31,36,37]。本次實驗推測高表達的CHI3L1可能與轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail結(jié)合,抑制E-cadherin表達,導(dǎo)致細胞松散,黏附性降低,上皮逐漸向間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進ESCC細胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移。研究顯示,CHI3L1在癌組織中高水平的表達與腫瘤的血管形成有關(guān)[38,39],CHI3L1參與食管癌EMT是否也會促進血管形成,有待進一步研究及探討。

        綜上所述,本次實驗提示CHI3L1可能通過誘導(dǎo)EMT的發(fā)生參與ESCC的發(fā)生、發(fā)展。推測對CHI3L1、Snail及E-cadherin表達水平并進行干預(yù),通過靶向分子手段下調(diào) CHI3L1、Snail水平及增強E-cadherin水平,來達到抑制ESCC進展的目的,有望為ESCC患者靶向分子治療提供新的途徑。

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