趙文俊 秦燕子 馬莉 蔡兆根 秦永明

食管癌（Esophageal cancer, EC）的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)一直位居前列，死亡率位于第六位[1]。EC在中國的發(fā)病率和死亡率一直保持在較高水平[2]，其中食管鱗狀細胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是最主要的組織學(xué)類型[3]。盡管目前腫瘤的綜合治療有了很大改善，但是食管癌的侵襲、轉(zhuǎn)移仍然給患者帶來致命性危害。近年關(guān)于分子靶向治療已成為研究熱點，也在ESCC臨床治療中取得了較好的療效，但是目前關(guān)于EC的發(fā)生、發(fā)展機制仍不清楚。

CHI3L1（Chitinase-3-like protein 1）又稱YKL-40，位于1q32.1染色體上，編碼CHI3L1蛋白，作為一種分泌型糖蛋白可分泌至細胞外進入循環(huán)系統(tǒng)，在炎性疾病及腫瘤中發(fā)揮重要作用[4]。在嚴重細菌感染[5]、炎癥性腸病[6]等慢性炎癥性疾病中血清CHI3L1明顯升高，且其升高水平與部分疾病的嚴重程度呈正相關(guān)。此外，CHI3L1在多種惡性腫瘤患者血清及腫瘤細胞中高表達，且預(yù)示著腫瘤患者生存及預(yù)后不佳，提示其在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮一定作用[7，8]。CHI3L1與ESCC發(fā)生的關(guān)系目前國內(nèi)外文獻報道較少，本次實驗擬通過研究CHI3L1、E-cadherin與Snail的關(guān)系來探討ESCC的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2014年1～12月我院及蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院ESCC存檔標本164例。其中男134例，女30例；＜65歲70例，≥65歲94例；腫瘤大體形態(tài)：潰瘍型70例，髓質(zhì)型66例，蕈傘型18例，縮窄型10例；腫瘤位置：上段17例，中段77例，下段70例；組織學(xué)分化程度：高分化27例，中分化105例， 低分化32例；瘤體大?。海?.5cm 83例，≥3.5cm 81例；浸潤深度：侵及外膜層59例，未至外膜層105例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有61例，無103例；pTNM分期：Ⅰ+Ⅱ期114例，Ⅲ+Ⅳ期50例。收集2019年9～11月術(shù)前活檢已證實為ESCC新鮮組織標本10例及其對應(yīng)的癌旁標本（距癌灶5cm以上的食管上皮組織）,其中男7例，女3例；＜65歲的2例，≥65歲的8例；腫瘤大體形態(tài):潰瘍型3例，髓質(zhì)型5例，蕈傘型1例，縮窄型1例；腫瘤位置:上段2例，中段7例，下段1例；組織學(xué)分化程度:高分化5例，中分化3例，低分化2例；瘤體大小:＜3.5cm 5例，≥3.5cm 5例；浸潤深度:侵及外膜層6例，未至外膜層4例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例；pTNM分期：Ⅰ+Ⅱ期8例，Ⅲ+Ⅳ期2例。本研究得到患者同意，且術(shù)前均未行放、化療等治療。病理診斷結(jié)果由兩位高年資病理醫(yī)生共同判定。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗試劑 抗體：兔多克隆CHI3L1（ab77528，Abcam，USA）, E-cadherin（AF0131，Affinity Biosciences，USA），Snail（AF6032，Affinity Biosciences，USA），ElivisionTMplus試劑盒和DAB顯色試劑盒購自福州邁新有限公司。PMSF，RIPA裂解液購自Beyotime公司， ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、PVDF 購自Merck Millipore公司，脫脂奶粉購自Bio-Rad公司。MMLV購自Promega公司，real- time PCR反應(yīng)液配制（20μl反應(yīng)體系，染料法）采用TaKaRa公司的產(chǎn)品，Trizol購自Invitrogen公司，RNA保護液購自TIANGEN公司。引物序列由Sangon Biotech合成。

1.2.2 Western blot實驗 ESCC新鮮標本離體后剪取適量癌組織及癌旁組織分別放入EP管中，做好標記，迅速放入液氮罐中，備用。取300mg新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml含PMSF的強RIPA裂解液，用電動勻漿器進行破碎勻漿，將加入裂解液后收集的樣品置冰上，裂解20～30min，4℃，12 000r，離心10min，取上清，即為提取的總蛋白。按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作（Beyotime，P0010），測定樣品濃度。取適量蛋白樣品，加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，用漩渦振蕩器震蕩混勻，離心，置于100℃水浴加熱5min，使蛋白充分變性。把蛋白樣品和預(yù)染蛋白marker直接上樣到預(yù)先配制的SDS-PAGE 膠加樣孔內(nèi)；加入電泳液，開始電泳，轉(zhuǎn)膜，將洗滌液吸去，加入Western 封閉液（5%脫脂奶粉溶液），在搖床上緩慢搖動，室溫封閉1h。加入稀釋好的一抗（CHI3L1稀釋比1:1 000，E-cadherin 稀釋比1:500，Snail 稀釋比1:500），加稀釋好的HRP標記二抗，加入TBST洗滌液，在搖床上緩慢搖動洗滌 10min×3 次；將洗滌后的膜用濾紙吸干表面洗滌液，立刻加上配制好的ECL試劑進行化學(xué)發(fā)光法檢測，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)膠片曝光顯影，掃描灰度值。重復(fù)3次實驗。

1.2.3 實時熒光定量PCR 剪取適量ESCC組織及癌旁組織放入EP管中，分別倒入適量 RNA保護液，做好標記，4℃過夜，倒出RNA保護液，放入液氮罐中，備用。組織樣品按50～100mg/ml Trizol加入Trizol，另外，組織體積不能超過Trizol體積的10%，用電動勻漿器充分勻漿1～2min，充分裂解，實驗操作參照Invitrogen公司的 Trizol 使用說明書。提取出的mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄，參照 MMLV 系統(tǒng)使用說明書，總體積 25μl，制作 cDNA 模板。參照實時熒光定量PCR常用試劑使用說明書-染料法PCR Master Mix，加入上、下游引物，反應(yīng)體系為 20μl，進行 real-time PCR 實驗。95℃ 60s，60℃ 30s，95℃5s，溶解曲線分析（95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s），40個循環(huán)。重復(fù)3次實驗，獲得 CHI3L1，E-cadherin，Snail 及內(nèi)參 GAPDH 循環(huán) Ct 值（Ct 代表每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定閾值時的反應(yīng)循環(huán)數(shù))。引物見表1。

表1 目的基因及參照基因引物序列及產(chǎn)物大小

1.2.4 免疫組織化學(xué)實驗方法 參照 ElivisionTMplus試劑盒說明書。切片烤干，于二甲苯溶液及梯度濃度的乙醇中脫蠟至水洗，3%過氧化氫10min 左右，抗原修復(fù)，滴一抗（CHI3L1稀釋比 1:1 000，E-cadherin稀釋比1:100，Snail 稀釋比1:100），放入 37℃恒溫箱1h，加增強劑（每塊組織加1滴）后放入37℃恒溫箱30min，滴二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染1min，鹽酸分析液分化，返藍2min，中性樹膠封片。采用已知陽性片作對照，以PBS 液代替一抗作空白對照。

1.2.5 結(jié)果判定 Western blot實驗用目的基因的灰度值除以內(nèi)參的灰度值，以校正誤差，所得比值就是某樣本中目的蛋白的相對表達量。實時熒光定量PCR用△△Ct法算出每個目的基因的表達值，目的基因表達值=2-(目的基因 Ct-內(nèi)參基因 Ct)。免疫組化實驗結(jié)果采用半定量法。腫瘤細胞染色強度：0分示不著色，1分示淺黃色，2分示棕黃色，3分示棕褐色。陽性腫瘤細胞占比：0～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為 3分，76%～100%為4分。染色強度與陽性比值相乘，＞3分為陽性，≤3分為陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗分析 CHI3L1，E-cadherin及 Snail 與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。CHI3L1，E-cadherin及Snail相關(guān)性使用Spearman分析。單因素分析采用 Kaplan-Meier分析，多因素分析采用Cox回歸模型分析。組間比較采用t檢驗。Western blot及實時熒光定量 PCR實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差（±s）表示。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHI3L1、E-cadherin、Snail蛋白及mRNA在ESCC組織及癌旁組織中的表達情況CHI3L1在ESCC新鮮組織中蛋白相對表達量為0.7907±0.4490，在癌旁組織中相對表達量為0.4102±0.2647，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.308，P＜0.05）。E-cadherin蛋白在ESCC新鮮組織中相對表達量0.6060±0.1112，明顯低于癌旁組織的0.8170±0.2613，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.350，P＜0.05）。在ESCC新鮮組織中 Snail蛋白相對表達量為0.5213±0.2432，在癌旁組織中為0.3250±0.1266，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.261，P＜0.05）。在ESCC新鮮組織中CHI3L1 mRNA相對值為0.6504±0.5439，高于癌旁組織的0.0628±0.0955，Snail mRNA在新鮮癌組織中相對值為0.5464±0.7126。高于癌旁組織的0.0590±0.0562，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.365，P＜0.05；t=2.156，P＜0.05）。Ecadherin mRNA在ESCC新鮮組織中相對表達量為1.1990±1.4780低于癌旁組織的5.4260±2.6110，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.456，P＜0.05）。CHI3L1，E-cadherin、Snail蛋白及mRNA在ESCC新鮮組織與癌旁組織中的差異表達見圖1、2。

圖1 CHI3L1、E-cadherin、Snail蛋白及mRNA在ESCC組織及癌旁組織中的定量表達

圖2 Western blot實驗中CHI3L1、E-cadherin及Snail蛋白表達情況

2.2 CHI3L1、E-cadherin、Snail蛋白表達與ESCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系CHI3L1 及Snail 陽性表達為細胞漿中呈黃色或棕黃色顆粒著色；而 E-cadherin陽性表達為細胞膜呈黃色或棕黃色著色（見圖3）。腫瘤浸潤至漿外膜層的CHI3L1陽性率為82.9%（87/105），未浸潤至外膜層的CHI3L1陽性率為30.5%（18/59），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示浸潤深度越深，其越容易表達。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的 CHI3L1陽性率（88.5%，54/61）明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CHI3L1陽性率（49.5%，51/103），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。pTNM 分期中Ⅰ、Ⅱ期的 CHI3L1 陽性率為52.6%（60/114），Ⅲ、Ⅳ期的 CHI3L1 陽性率為90.0%（45/50），提示腫瘤pTNM 分期越高，CHI3L1 陽性率越高（P＜0.05）。此外發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑越大，CHI3L1 陽性表達率越高（P＜0.05）。不同年齡、性別、腫瘤位置及組織學(xué)分化程度的患者的CHI3L1蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的Snail陽性率明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05）；腫瘤侵及漿膜層的Snail陽性率高于未侵及漿膜層的（P＜0.05）；不同性別、年齡、腫瘤大體類型、腫瘤位置、組織學(xué)分化程度及瘤體大小的患者的Snail 陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）?；颊吣挲g越大，瘤體越大，腫瘤組織分化越低，pTNM 分期越高，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或浸潤越深，E-cadherin 陽性率越低（P＜0.05）；而不同性別、腫瘤大體類型、腫瘤位置的患者的E-cadherin陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖3 CHI3L1、Snail及E-cadherin在ESCC組織中的表達

續(xù)表2

2.3 CHI3L1，E-cadherin及Snail相關(guān)性分析CHI3L1蛋白與Snail蛋白呈明顯正相關(guān)（r=0.699，P＜0.05），而與E-cadherin呈負相關(guān)（r=-0.380，P＜0.05）；Snail蛋白與 E-cadherin亦呈負相關(guān)（r=-0.481，P＜0.05）。提示CHI3L1 與 Snail 具有正協(xié)同關(guān)系，而E-cadherin 與CHI3L1、Snail 具有負協(xié)同關(guān)系。見表3。

表3 ESCC中CHI3L1、E-cadherin及Snail相關(guān)性

2.4 生存分析患者5年生存率為35.9%（59/164）。Kaplan-Meier生存分析顯示CHI3L1、E-cadherin、Snail蛋白表達與患者生存相關(guān)（Log-rank=47.964，P＜0.001；Log-rank=40.051，P＜0.001；Log-rank=75.234，P＜0.001；見圖4）。CHI3L1、Snail陽性率越高，患者生存時間越短（P＜0.05）；而E-cadherin陽性率越低，患者生存時間反而越短（P＜0.05）。將患者年齡、性別、腫瘤位置、大體類型、腫瘤大小、組織學(xué)分級、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期、CHI3L1蛋白、E-cadherin蛋白及Snail蛋白納入 Cox回歸模型中，顯示CHI3L1、E-cadherin 及Snail因子可以作為ESCC患者獨立預(yù)后因素（P＜0.05，見表4）。

圖4 CHI3L1、E-cadherin 及 Snail陽性組和陰性組中生存分析

表4 Cox回歸模型多因素生存分析

續(xù)表4

3 討論

有研究顯示CHI3L1可以誘導(dǎo)炎性小體激活、細胞凋亡、癌變和腫瘤血管生成，參與免疫應(yīng)答、炎癥和細胞外基質(zhì)的形成，可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，具有影響腫瘤生長、轉(zhuǎn)移等作用[9]。本次實驗中，我們證實了CHI3L1 在ESCC 中明顯高表達，并隨著癌組織浸潤深度的加深，淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移及pTNM分期越晚，CHI3L1蛋白表達越高，說明高表達CHI3L1可促進 ESCC 的侵襲、轉(zhuǎn)移，這與先前報道的結(jié)果一致[10，11]。有研究顯示CHI3L1在乳腺癌、腎細胞癌和結(jié)直腸癌患者血清中水平顯著升高，可作為判斷病情和預(yù)后的標志因子[12～14]。本次實驗通過Cox多因素分析顯示 CHI3L1可作為評估ESCC 患者生存的獨立預(yù)后因子，其高表達可能提示該患者預(yù)后不良，生存時間縮短。有研究也證實了血清CHI3L1升高與肺癌的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)[15，16]。Zheng等[10]指出CHI3L1聯(lián)合食管鱗狀細胞癌抗原（Squamous cell carcinoma antigen，SCCA）可顯著提高傳統(tǒng)食管癌腫瘤標志物癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen ，CEA）、SCCA檢測食管癌的敏感性。Xing等[11]首次證明了血清CHI3L1可作為食管癌預(yù)后監(jiān)測指標。

E-cadherin是一種跨膜糖蛋白，屬于鈣黏蛋白家族之一，在正常上皮組織內(nèi)位于細胞膜中，具有黏附性，介導(dǎo)細胞黏膜，維持上皮結(jié)構(gòu)的完整性、細胞極性的作用[17]。本次實驗檢測了E-cadherin 在ESCC中表達降低，這與先前研究一致[18]。本次實驗發(fā)現(xiàn)隨著浸潤深度加深，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，pTNM分期越晚，E-cadherin表達降低，說明 E-cadherin蛋白表達缺失或降低可能促進ESCC腫瘤細胞黏附性降低，腫瘤細胞容易發(fā)生轉(zhuǎn)移、侵襲[19]。Zhai等[20]指出E-cadherin在ESCC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中表達降低，其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈明顯負相關(guān)（P＜0.05）。國內(nèi)也有研究顯示E-cadherin蛋白表達隨著腫瘤浸潤深度的增加反而降低[21]。在本次實驗中，生存分析顯示E-cadherin蛋白表達越低，ESCC 患者預(yù)后越差，且 E-cadherin蛋白表達情況可以作為患者獨立預(yù)后因素。

Snail是一種編碼鋅指結(jié)構(gòu)類型的轉(zhuǎn)錄因子，屬于鋅指結(jié)合蛋白基因家族，在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）中發(fā)揮著重要作用[22]。Snail在多種惡性腫瘤中明顯高表達，包括乳腺癌[23]、結(jié)腸癌[24]、食管癌[25]等。本次實驗已證實Snail在ESCC中陽性率顯著增加（P＜0.05），這與上述文獻報道一致。同時，腫瘤浸潤深度的增加，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，pTNM分期越高，Snail陽性率增加，提示ESCC發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移可能伴隨著Snail的高表達。Saitoh等[26]指出Snail可誘導(dǎo)EMT的發(fā)生并且在促進惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵性作用；吳宇翔等[27]發(fā)現(xiàn)SIRT1可通過調(diào)控Snail表達參與食管癌細胞株EMT發(fā)生，從而促進其侵襲轉(zhuǎn)移。在進行食管癌生存分析中，顯示Snail陽性組生存率顯著低于陰性組，Snail可以作為患者獨立預(yù)后影響因素，這與先前研究一致[25，28]。

EMT可通過降低上皮標志物表達，增加間質(zhì)標志物表達，使得細胞粘附能力降低而增加細胞運動能力， 從而增加腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲能力[29]。大量研究顯示鈣黏蛋白E-cadherin及轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail是EMT重要調(diào)控分子。在本次實驗中通過Spearman相關(guān)性分析得出CHI3L1與Snail呈正相關(guān)，而與E-cadherin呈負相關(guān)，Snail與E-cadherin亦呈負相關(guān)。有文獻指出CHI3L1在乳腺癌等惡性腫瘤中可通過下調(diào) E-cadherin，從而加速腫瘤的進展；在乳腺癌上皮中通過CHI3L1過表達可以導(dǎo)致細胞的能動性增加，并且 E-cadherin 的表達減弱[30]。在非小細胞肺癌細胞系CL1-1、H23、H838、CL1-5 和 H2009中，CHI3L1調(diào)節(jié)EMT 標記物的表達，包括 Twist1、Snail、Slug、N-cadherin、Vimentin和E-cadherin，表明CHI3L1可通過促進肺癌細胞EMT發(fā)生從而增強腫瘤的遷移及侵襲能力[31]。復(fù)習(xí)文獻及結(jié)合本次實驗，我們認為在ESCC中高表達的CHI3L1與EMT發(fā)生密切相關(guān)，但是具體的機制目前還不清楚。研究顯示Snail通過與E-cadherin啟動子上的E-box作用元件結(jié)合，抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄，從而抑制E-cadherin表達水平，上皮間連接發(fā)生破壞，誘導(dǎo)EMT發(fā)生[32，33]。有報道CHI3L1可能在磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT/mTOR信號通路調(diào)控中發(fā)揮作用，促使腫瘤存活、轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移[34，35]。有學(xué)者認為CHI3L1是通過AKT信號通路調(diào)節(jié)EMT必需基因，從而促進癌細胞的遷移和侵襲，推測CHI3L1有可能成為癌癥治療的靶標[31，36，37]。本次實驗推測高表達的CHI3L1可能與轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail結(jié)合，抑制E-cadherin表達，導(dǎo)致細胞松散，黏附性降低，上皮逐漸向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進ESCC細胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移。研究顯示，CHI3L1在癌組織中高水平的表達與腫瘤的血管形成有關(guān)[38，39]，CHI3L1參與食管癌EMT是否也會促進血管形成，有待進一步研究及探討。

綜上所述，本次實驗提示CHI3L1可能通過誘導(dǎo)EMT的發(fā)生參與ESCC的發(fā)生、發(fā)展。推測對CHI3L1、Snail及E-cadherin表達水平并進行干預(yù)，通過靶向分子手段下調(diào) CHI3L1、Snail水平及增強E-cadherin水平，來達到抑制ESCC進展的目的，有望為ESCC患者靶向分子治療提供新的途徑。