李連鳳， 周 婷， 余其梅， 林 慧， 王震宇， 秦靈芝， 孔憲榮， 廖 偉

武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1公共衛(wèi)生學(xué)院 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 430065 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 3病理科 4放射科，武漢 430030 5武漢市第五醫(yī)院呼吸與重癥內(nèi)科，武漢 430050

近年來(lái)，肺癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)超過(guò)乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌和腦癌所致死亡人數(shù)的總和，其中男性和女性的死亡率分別為23%和22%[1]。肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC，約占85%)和小細(xì)胞肺癌(SCLC，約占15%)兩種類(lèi)型，NSCLC的主要組織學(xué)類(lèi)型是鱗癌與腺癌，而肺腺癌是肺癌中較常見(jiàn)的一種類(lèi)型，約占肺癌總數(shù)的40%，且易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，5年平均生存率約為18%[2]。

受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)家族在胚胎發(fā)育和疾病進(jìn)展中具有重要作用，受體酪氨酸激酶樣孤核受體2(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2，ROR2)是其中的一種蛋白，屬于Ⅰ型跨膜蛋白[3]，在發(fā)育期的胚胎中表達(dá)，存在于胚芽、心臟、原始生殖器、發(fā)育中的體細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞中[4]。ROR2在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、遷移、增殖和分化等方面也發(fā)揮著重要作用[5]。腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移依賴(lài)于細(xì)胞的極化作用，即細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面。有研究發(fā)現(xiàn)ROR2信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞極化，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。在乳腺癌[7]、宮頸癌[8]、軟骨肉瘤[9]、胰腺癌[4]、平滑肌肉瘤和胃腸道間質(zhì)瘤[10]等多種惡性腫瘤中ROR2 mRNA或蛋白高表達(dá)與患者總體生存率較低相關(guān)；但另有研究報(bào)道在胃癌[3]、肝癌[5，11]和結(jié)直腸癌[12]中ROR2的表達(dá)下降。這表明在不同的癌癥中ROR2蛋白的作用可能不盡相同。

目前，ROR2蛋白在肺腺癌患者體內(nèi)的表達(dá)情況尚不清楚。本研究采用組織芯片及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了ROR2蛋白在肺腺癌患者癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，分析ROR2蛋白與肺腺癌患者臨床特征及生存情況的關(guān)系，以期為早期干預(yù)和治療肺腺癌提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究選取了華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院2010年3月至2015年9月入院后進(jìn)行切除手術(shù)的235例肺腺癌患者，收集患者的年齡、性別、吸煙情況、腫瘤的分化類(lèi)型、腫瘤大小、TNM分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、細(xì)胞增殖指數(shù)Ki67的表達(dá)量和是否接受放化療等基本信息和臨床特征資料。

在腫瘤分化類(lèi)型中，微乳頭型和實(shí)體型屬于低分化(71例)，腺泡型和乳頭型屬于中分化(124例)，貼壁型為高分化(40例)；TNM分期是按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)肺癌TNM分期第7版(2009年)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，其中Ⅰ期52例、Ⅱ期37例、Ⅲ期99例、Ⅳ期47例。隨訪至2018年6月，存活患者56例，死亡患者179例。所有參與本研究的患者均簽署了知情同意書(shū)，本研究獲得華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 組織芯片的制作

收集所有研究對(duì)象的肺癌組織和癌旁組織，分別取小塊肺組織置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h，再進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片及蘇木精-伊紅(HE)染色，在顯微鏡下鏡檢，確定芯片取點(diǎn)部位。在取點(diǎn)前，稍加熱蠟塊，根據(jù)HE染色的結(jié)果定位，用取樣器對(duì)目的部位的組織點(diǎn)進(jìn)行取樣，并按順序依次注入到相應(yīng)規(guī)格的受體蠟塊孔內(nèi)，再利用組織芯片融合儀(BP0100，Biossci公司)對(duì)芯片進(jìn)行融合(60～65℃，20 min)，將熔好的芯片蠟塊取出放于蠟?zāi)Ｖ?，并用蠟填充滿(mǎn)，再在制作好的組織芯片表面填充薄薄一層蠟，4 μm切片。

1.3 免疫組織化學(xué)(IHC)染色

將組織芯片的石蠟切片置于環(huán)保透明劑及梯度乙醇中脫蠟復(fù)水，蒸餾水沖洗，高溫高壓抗原修復(fù)1～2 min，冷卻至室溫，TBS沖洗3次，3%H2O2室溫20 min，TBS沖洗3次，10%山羊血清孵育20 min，加ROR2一抗工作液(1∶200，Abcam，ab190145)4℃過(guò)夜，復(fù)溫15 min，TBS沖洗3次，滴加50 μL DAKO二抗，室溫孵育25 min，TBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，清水洗凈、脫水、封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察ROR2蛋白的表達(dá)并拍照。

1.4 組織芯片IHC染色的結(jié)果判定

按染色顏色深淺對(duì)蛋白的表達(dá)程度進(jìn)行半定量評(píng)分：未著色為0分，定義為陰性(-)；淡黃色為1分，定義為弱陽(yáng)性(+)；棕黃色為2分，定義為陽(yáng)性()；棕褐色為3分，定義為強(qiáng)陽(yáng)性()。由5名經(jīng)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)的人員在不知患者臨床資料的情況下單獨(dú)完成閱片，以3人以上的一致性評(píng)分作為最終的評(píng)分結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的連續(xù)性變量采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的連續(xù)性變量采用兩獨(dú)立樣本的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，分類(lèi)變量采用R×C卡方檢驗(yàn)；ROR2在癌組織和癌旁組織表達(dá)的差異采用Wilcoxon配對(duì)樣本秩和檢驗(yàn)；不同臨床特征與ROR2陽(yáng)性表達(dá)程度的關(guān)系采用趨勢(shì)性卡方檢驗(yàn)；分層分析采用Cochran-Mantel-Haenszel(CMH)卡方檢驗(yàn)；以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌患者的臨床特征分析

本研究中納入的肺腺癌患者年齡在27～80歲之間，平均年齡為56.7歲。隨訪結(jié)束時(shí)存活病例有56例，平均年齡(53.86±8.64)歲；死亡病例有179例，平均年齡(57.33±9.98)歲，存活病例的平均年齡明顯小于死亡病例，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。死亡病例中，癌組織為低分化類(lèi)型、腫瘤大小>3 cm、TNM分期為Ⅱ～Ⅳ期以及發(fā)生淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的比例明顯高于存活病例，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。而性別、吸煙情況、吸煙量、是否接受放化療和ROR2蛋白表達(dá)程度等特征在兩組人群中的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 肺腺癌患者的臨床特征分析

2.2 肺腺癌患者肺組織中ROR2蛋白的表達(dá)情況

如圖1所示，肺部癌組織中的肺泡結(jié)構(gòu)不完整，肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生了增生性改變，癌組織多以貼壁型、乳頭型和腺泡型腺癌為主。癌旁的肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，少部分出現(xiàn)增生性變化。ROR2蛋白在癌組織和癌旁組織中均有表達(dá)，呈現(xiàn)黃色或棕黃(褐)色的陽(yáng)性顆粒，主要表達(dá)定位于腺癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。235例肺腺癌患者中，49例(20.85%)患者癌組織中ROR2蛋白呈陰性表達(dá)，186例(79.15%)患者癌組織中ROR2蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，其中112例(47.66%)為弱陽(yáng)性，62例(26.38%)為陽(yáng)性，12例(5.11%)為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；在癌旁組織中，148例(62.98%)呈陰性表達(dá)，78例(33.19%)為弱陽(yáng)性，9例(3.83%)為陽(yáng)性表達(dá)，無(wú)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。我們對(duì)ROR2蛋白在癌組織和癌旁組織的表達(dá)進(jìn)行半定量分析，肺腺癌患者癌組織中ROR2蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

A、B：41號(hào)患者的癌組織和癌旁組織，評(píng)分分別為0分和2分；C、D：15號(hào)患者的癌組織和癌旁組織，評(píng)分分別為1分和0分；E、F：5號(hào)患者的癌組織和癌旁組織，評(píng)分分別為2分和0分；G、H：19號(hào)患者的癌組織和癌旁組織，評(píng)分分別為3分和1分。0分為陰性，1分為弱陽(yáng)性，2分為陽(yáng)性，3分為強(qiáng)陽(yáng)性。標(biāo)尺=50 μm

2.3 肺腺癌的臨床特征與癌組織中ROR2蛋白表達(dá)的關(guān)系

TNM分期達(dá)到Ⅲ和Ⅳ期，或者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者癌組織中ROR2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于腫瘤分期為Ⅰ和Ⅱ期或未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(均P<0.05)，且在ROR2蛋白陽(yáng)性表達(dá)的患者中，當(dāng)細(xì)胞增殖指數(shù)Ki67≥50%、癌組織為低分化、TNM分期達(dá)到Ⅲ和Ⅳ期或發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，ROR2蛋白陽(yáng)性或者強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率明顯增加，且隨著ROR2表達(dá)程度的增強(qiáng)而增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。而在性別、年齡、吸煙情況、分化程度、腫瘤大小、是否接受放化療、生存率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率等方面ROR2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)明顯差異(均P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 肺腺癌的臨床特征與癌組織中ROR2蛋白表達(dá)的關(guān)系[例(%)]

2.4 分層分析ROR2蛋白表達(dá)與肺腺癌患者生存情況的關(guān)系

根據(jù)不同的臨床特征進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示，在從不吸煙、腫瘤大小≤3 cm、TNM分期為Ⅰ和Ⅱ期和未接受放化療的患者中，ROR2高表達(dá)是肺腺癌患者發(fā)生死亡的危險(xiǎn)因素，其OR及95%CI分別為3.42(1.11～10.56)、3.39(1.00～11.20)、3.37(1.03～10.97)和2.89(1.03～8.18)，見(jiàn)表3。

表3 分層分析ROR2蛋白表達(dá)與肺腺癌患者生存情況的關(guān)系

3 討論

肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌中較常見(jiàn)的一種亞型，TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響肺腺癌患者預(yù)后的主要因素[13]。本研究結(jié)果顯示，肺腺癌患者的存活情況與細(xì)胞的分化程度、腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，死亡病例中，癌組織為低中分化的類(lèi)型、腫瘤大小>3 cm、TNM分期為Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期以及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的比例明顯高于存活病例。有研究發(fā)現(xiàn)，低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均是肺腺癌總體生存期(OS)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[14]，與本研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，ROR2蛋白在肺腺癌的癌組織和癌旁組織中均有表達(dá)，且癌組織中ROR2蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織。Lu等[15]研究表明ROR2 mRNA在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于匹配的正常組織；Huang等[4]研究發(fā)現(xiàn)ROR2 mRNA在胰腺癌患者癌組織中的表達(dá)量也顯著高于癌旁組織，這與我們的研究結(jié)果一致。但有研究發(fā)現(xiàn)ROR2 mRNA和蛋白在肝癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織或者非癌組織(如慢性肝炎患者組織和肝硬化患者組織)[5，11]。因此，在不同的癌細(xì)胞或組織中，ROR2基因可能具有不同的調(diào)節(jié)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌患者TNM分期達(dá)到Ⅲ和Ⅳ期或發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，ROR2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率較高，且在ROR2陽(yáng)性表達(dá)的肺腺癌組織中，其陽(yáng)性表達(dá)率會(huì)隨著表達(dá)程度的增強(qiáng)而增高。有研究表明在非小細(xì)胞肺癌中ROR2高表達(dá)與TNM分期相關(guān)[15]，這與我們的研究結(jié)果基本一致。此外，在胰腺癌、膽囊鱗癌/腺鱗癌和腺癌及乳腺癌等癌組織中，ROR2的表達(dá)也與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)，且在晚期的表達(dá)量顯著升高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中ROR2陽(yáng)性表達(dá)率也顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織[4，16-17]。早期的研究已發(fā)現(xiàn)，ROR2蛋白高表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[7]，因此，癌組織中ROR2的表達(dá)情況可能與肺腺癌的TNM分期以及是否會(huì)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在ROR2蛋白陽(yáng)性表達(dá)的肺腺癌患者中，當(dāng)細(xì)胞增殖指數(shù)Ki67≥50%、腫瘤為低分化時(shí)，ROR2蛋白為陽(yáng)性或者強(qiáng)陽(yáng)性的表達(dá)率也顯著增加。其中，癌組織的Ki67表達(dá)情況以及癌組織的分化程度與肺腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，Ki67值越大，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)，分化程度越低，患者的預(yù)后越差[18-19]。ROR2蛋白的表達(dá)也可能影響腫瘤細(xì)胞的增殖及惡化程度，但其相關(guān)的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

值得注意的是，在不吸煙患者、腫瘤大小≤3 cm、TNM分期為Ⅰ和Ⅱ期或未接受放化療的肺腺癌患者中，癌組織中ROR2蛋白高表達(dá)是患者出現(xiàn)死亡的危險(xiǎn)因素。有研究表明肺組織中ROR2異常高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后較差[15，20]，與本研究結(jié)果相似。這提示在肺腺癌發(fā)生的早期階段，癌組織中ROR2的表達(dá)量與患者術(shù)后的生存情況有關(guān)，其在評(píng)估肺腺癌患者預(yù)后及是否需要進(jìn)行放化療等方面可能具有潛在的指導(dǎo)作用，為早期干預(yù)和治療肺腺癌提供了新的思路。但由于本研究納入的病例數(shù)量有限，因此ROR2在肺腺癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的作用尚需要進(jìn)一步的探討。

綜上所述，癌組織中ROR2蛋白的表達(dá)情況與肺腺癌患者TNM分期、分化程度以及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，且ROR2蛋白的高表達(dá)可能是肺腺癌患者術(shù)后出現(xiàn)死亡的危險(xiǎn)因素之一。因此，檢測(cè)肺組織中ROR2的表達(dá)情況可能為早期干預(yù)和治療肺腺癌提供新的思路。