金黨琴，龔愛琴，王元有，雍達明，孫 強，朱文軍，孫艷艷

（揚州工業(yè)職業(yè)技術學院 化學工程學院，江蘇 揚州 225127）

毒死蜱（CPF）是一種高效中毒有機磷農藥，可破壞害蟲體內乙酰膽堿酯酶（AChE）活性［1］，對植食性害蟲，如飛虱、稻縱卷葉螟、菜青蟲等具有很好的毒殺效果［2］，在蔬菜、水果、糧食作物中應用十分廣泛。但因過量使用，導致農藥殘留嚴重影響了生態(tài)環(huán)境安全，對人與動物的生命安全構成威脅［3－4］。聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署（UNEP）和糧農組織（FAO）禁用或嚴格限制一些高毒有機磷農藥（如甲基對硫磷和對硫磷）在農業(yè)上使用［4］。泰國政府規(guī)定針對百草枯和毒死蜱從2020年6月1日起實施禁令［5］。日本肯定列表制度中明確毒死蜱在蔬菜中的最高殘留限量為0．01～0．5 mg/kg，我國規(guī)定無公害蔬菜中的毒死蜱最高殘留限量為1 mg/kg［6－7］。

毒死蜱殘留檢測的方法有氣相色譜（GC）［8］和氣相色譜－質譜（GC－MS）［9］、液相色譜（LC）［10］和液相色譜－質譜法（LC－MS）［11］、表面增強拉曼光譜法（SERS）［12］等，但這些方法常要求復雜的前處理、成本昂貴，且不適合現(xiàn)場檢測。光電化學（PEC）技術因其具有成本低、靈敏度高、儀器簡單、易于小型化等特點而得到快速發(fā)展［13－16］。在光照射下，PEC傳感器產生的光電流強度與分析物的濃度成正比，可用于定量分析。光敏材料和選擇性是決定PEC傳感器敏感性的兩個關鍵因素。

作為一種新型三元氧化物半導體，碘氧化鉍（BiOI）因具有獨特的分層結構，內部靜電場垂直于每一層，可以引起光生電子和空穴有效分離，被認為是光捕獲材料［17］。其中，由于最小帶隙（～1．8 eV）和強吸收可見光特性（吸收邊緣為～680 nm），Bi OI在太陽光照射下表現(xiàn)出優(yōu)異的光吸收性能，已成為研究熱點［18］，可作為光電化學傳感器的電極修飾材料。生物酶分子印跡光電化學傳感器因具有高選擇性優(yōu)點，對其研究可進一步提高光電化學傳感器的選擇性［19］。本研究利用分子印跡聚合物對目標分子毒死蜱的選擇性識別能力降低樣品基質干擾，并利用毒死蜱對AChE活性的抑制原理，構建了分子印跡AChE/Bi OINFs/ITO雙識別型光電化學傳感器，為水樣中毒死蜱的痕量檢測提供了一種新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660D電化學工作站（上海辰華儀器有限公司），氘鹵鎢燈光源裝置（250 W，λ=504～624 nm，北京紐比特科技有限公司），光源對著電解池中導電玻璃修飾面進行光照射；Hitachi S－4800掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立公司），加速電壓15 kV進行掃描；所有實驗均在室溫下采用傳統(tǒng)的三電極體系，參比電極是飽和甘汞電極（SCE），輔助電極是鉑絲（φ=1．0 mm），工作電極是氧化銦錫（ITO）導電玻璃（深圳市力科光電玻璃有限公司）。

氯化乙酰硫代膽堿（ATCl，99%）、AChE（C3389，500 U/mg）購自Sigma－Aldrich公司；毒死蜱標準溶液（100μg/mL，乙腈溶解）、Bi（NO3）3·5H2O、KI、2-氨基對苯二甲酸（H2BDC－NH2）、二甲基甲酰胺（DMF）、對巰基苯胺（ATP）、戊二醛、KCl、甲醇（分析純，中國醫(yī)藥集團有限公司）。0．1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）用NaH2PO4和Na2HPO4配制。實驗用水均為超純水。

1.2 MIP/BiOINFs/ITO與MIP/AChE/BiOINFs/ITO電極的制備

用玻璃刀將氧化銦錫（ITO）導電玻璃切成長×寬為5 cm×0．6 cm長方形小片，置于2 mol/L KOH的異丙醇溶液煮沸保持30 min，取出，超聲清洗10 min，放入100℃烘箱中烘干，備用。

BiOINFs/ITO電極的制備［20］：通過連續(xù)的離子層吸附和反應（SILAR）法制得BiOI納米片組（BiOINFs），取2個燒杯用水分別配制5 mmol/L Bi（NO3）3·5H2O和5 mmol/L KI溶液。處理后的ITO浸入Bi（NO3）3溶液中，取出用水沖洗，然后再浸入KI溶液，每一個浸入過程持續(xù)10 s，經(jīng)過一定的SILAR循環(huán)后，制得BiOINFs/ITO在室溫下自然晾干。

MIP/BiOINFs/ITO電極的制備：將上述BiOINFs/ITO電極放入含有5 mmol/L對巰基苯胺和0．1 mmol/L毒死蜱的pH 7．0 PBS中，電位值為－1．5 V，恒電位沉積聚合5 min，毒死蜱被聚合到電極表面，取出電極，用適量0．1%戊二醛滴涂至電極表面，自然晾干，用水沖洗過量的戊二醛，再晾干，制得修飾電極。將修飾電極浸入0．1 mol/L KCl溶液中，循環(huán)伏安掃描30圈洗脫掉模板分子，電位范圍為－1．2~0．5 V，取出電極，自然晾干，制得毒死蜱分子印跡傳感器（MIP/BiOINFs/ITO），其表面留有許多毒死蜱分子識別位點。

MIP/AChE/BiOINFs/ITO電極的制備：將制得的MIP/BiOINFs/ITO浸入含6 mU/mL AChE的5 mmol/LPBS（pH 7．0）溶液中6 h。取出，用PBS沖洗MIP/BiOINFs/ITO電極表面未固定的AChE，沖洗時間持續(xù)15 min，制得MIP/AChE/BiOINFs/ITO電極。

1.3 毒死蜱的分子印跡光電化學測定

取5 mL 0．1 mol/L PBS（pH 7．0），向緩沖溶液中加入一定濃度的毒死蜱，將制得的MIP/AChE/BiOINFs/ITO電極浸入其中，保持10 min，取出后，再將此電極插入含1．0 mmol/L ATCl的0．1 mol/L PBS（pH 7．0）中，測試光電化學反應。采用I－t法，20 s進行光照，持續(xù)10 s，30 s時關閉光源。偏置電壓：0 V。毒死蜱的抑制率計算公式為：抑制率（%）=( )I0-I/I0×100，式中，I0和I分別表示不存在和存在毒死蜱時，MIP/AChE/BiOINFs/ITO電極對ATCl的光電流值。

2 結果與討論

2.1 BiOINFs/AChE的表征

采用掃描電子顯微鏡對制備的BiOINFs納米材料形貌進行表征（如圖1）。從圖1A中可以看出，通過SILAR法制得的BiOINFs納米片均勻地分布在ITO基體上。圖1B顯示BiOINFs/ITO電極表面被毒死蜱分子印跡后，BiOINFs納米片的多孔結構無變化。通常，多孔納米結構基底利于蛋白質的固定，直接影響生物傳感器的最終性能。因此，BiOINFs的這種交錯網(wǎng)絡結構更有利于生物酶分子的固定。隨著AChE的固定化，發(fā)現(xiàn)AChE-BiOINFs的形態(tài)（圖1C）與BiOINFs相似，表明BiOI的結構形態(tài)固定后保持不變。

圖1 BiOINFs/ITO（A）、MIP/BiOINFs/ITO（B）及MIP/AChE/BiOINFs/ITO（C）的SEM圖Fig．1 SEM images of BiOINFs/ITO（A），MIP/BiOINFs/ITO（B）and MIP/AChE/BiOINFs/ITO（C）

在含有2．0×10–3mol/L［Fe（CN）6］3－/4－的0．1 mol/L KCl溶液中，進一步通過電化學阻抗譜法（EIS）研究分子印跡光電化學傳感器的逐步組裝過程（如圖2）。結果顯示，BiOINFs/ITO的交流阻抗最小（圖2a），通過電聚合法制備分子印跡聚合膜后，交流阻抗顯著增加（圖2b），這可能是因為分子印跡聚合膜增加了傳質阻力的緣故。當AChE修飾到MIP/BiOINFs/ITO電極表面后，交流阻抗進一步增加（圖2c），表明AChE的不導電特性會阻礙電子傳遞和電化學探針的大量傳輸，導致阻抗增強。上述研究結果表明基于AChE分子印跡電極修飾的每一步過程都是成功的。

圖2 不同電極在2．0×10–3 mol/L［Fe（CN）6］3?/4?溶液中的交流阻抗圖Fig．2 Electrochemical impedance spectroscopy of differ?ent electrodes in 2．0×10－3 mol/L［Fe（CN）6］3－/4－a：BiOINFs/ITO；b：MIP/BiOINFs/ITO；c：MIP/AChE/BiO?INFs/ITO；0．1 mol/L KCl

2.2 不同修飾電極的光電流實驗

為了研究可見光誘導產生光電流響應情況，對3種修飾電極（Bi OINFs/ITO、MIP/BiOINFs/ITO、MIP/AChE/BiOINFs/ITO）在0．1 mol/L PBS（pH 7．0）中的光電流響應情況進行考察（見圖3A）。結果表明，在可見光照射下，BiOINFs/ITO產生明顯的光電流（曲線a）；由于分子印跡產生的印跡空穴利于電子傳遞，MIP/BiOINFs/ITO的光電流（曲線b）大于Bi OINFs/ITO；MIP/AChE/BiOINFs/ITO（曲線c）的光電流略高于MIP/BiOINFs/ITO。在PBS溶液中加入酶底物ATCl后，MIP/AChE/BiOINFs/ITO（曲線e）的光電流為42．6 nA，為不含ATCl情況下MIP/AChE/BiOINFs/ITO光電流（11．8 nA）的3．6倍。表明酶底物的加入導致光電流顯著提升，可以解釋為：當PBS溶液中加入酶底物ATCl，固定的AChE可以催化ATCl水解為乙酸鹽和硫代膽堿，在可見光照射下，硫代膽堿易捕獲光生空穴，發(fā)生氧化反應，促進光生電子和光生空穴分離，導致光電流強度增強。同樣實驗條件下，未修飾AChE的MIP/BiOINFs/ITO的光電流未見明顯增強。進一步說明BiOINFs提供了良好的固定AChE的基質，且AChE保留了其生物活性。

MIP/AChE/BiOINFs/ITO在不同濃度毒死蜱溶液中浸入10 min后，再放入含有酶底物ATCl的PBS中，考察其光電流響應情況（見圖3B）。結果表明，MIP/AChE/BiOINFs/ITO的光電流隨著毒死蜱濃度的增加（0~20．0 nmol/L）而降低（曲線a~d），且光電流的降低量與毒死蜱濃度成正比。因此，該分子印跡生物傳感器可用于毒死蜱的檢測。

圖3 A：BiOINFs/ITO（a），MIP/Bi OINFs/ITO（b），MIP/AChE/BiOINFs/ITO（c）在0．1 mol/L pH 7．0 PBS中，以及MIP/BiO?INFs/ITO（d），MIP/AChE/Bi OINFs/ITO（e）在含1．0 mmol/L ATCl的0．1 mol/L pH 7．0 PBS中的光電流響應；B：MIP/AChE/BiOINFs/ITO在不同濃度毒死蜱溶液中浸入10 min后，在含1．0 mmol/L ATCl溶液的0．1 mol/L pH 7．0 PBS中的光電流響應Fig．3（A）Photocurrent responses of BiOINFs/ITO（a），MIP/BiOINFs/ITO（b）and MIP/AChE/Bi OINFs/ITO（c）in 0．1 mol/LpH 7．0 PBS，and MIP/Bi OINFs/ITO（d），MIP/AChE/Bi OINFs/ITO（e）in 0．1 mol/L pH 7．0 PBS containing 1．0 mmol/LATCl；（B）photocurrent responses of MIP/AChE/BiOINFs/ITO in PBS containing 1．0 mmol/LATCl after immersion in different concentrations chlorpyrifos solution for 10 minB：concentration of chlorpyrifos（a－d）：0，0．5，1．0，20．0 nmol/L

2.3 ATCl濃度的優(yōu)化

ATCl濃度是毒死蜱分析的重要參數(shù)之一，當其濃度過低時，MIP/AChE/BiOINFs/ITO電極產生的光電流很小，很難檢出毒死蜱含量。然而，ATCl濃度過高時會導致AChE的活性中心被底物占據(jù)，不利于抑制劑的抑制。實驗考察了6種不同ATCl濃度（0．2、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2 mmol/L）對電極光電流的影響。結果顯示，隨著ATCl濃度的增大，體系的光電流強度增強，且在1．0 mmol/L ATCl時達到最高。繼續(xù)增大ATCl濃度，則光電流強度降低（見圖4A）。因此，實驗選擇1．0 mmol/L的ATCl為最佳濃度。

2.4 p H值的優(yōu)化

溶液pH值影響AChE的生物活性，為此考察了不同pH值對MIP/AChE/BiOINFs/ITO電極光電流的影響。為了保持BiOINFs的穩(wěn)定性［17］，溶液pH從6．0~10．0進行實驗。結果表明，當溶液pH值為7．0時，電極的光電流最大（見圖4B）。因此，實驗選擇最佳pH值為7．0。

圖4 不同濃度ATCl（A）及溶液pH值（B）對MIP/AChE/Bi OINFs/ITO光電流的影響Fig．4 Influences of different ATCl concentrations（A）and pH values（B）on photocurrents of MIP/AChE/BiOINFs/ITO

2.5 MIP/AChE/BiOINFs/ITO光電化學檢測毒死蜱

在PBS溶液中，將MIP/AChE/BiOINFs/ITO電極分別浸入不同濃度（0、0．02、0．05、0．1、0．2、0．5、1．0、20．0、50．0、100．0、200．0 nmol/L）毒死蜱中10 min后，進行檢測。結果表明，電極的光電流值隨著毒死蜱濃度的增加而降低，且光電流抑制率和毒死蜱濃度（CCPF）在0．02～1．0 nmol/L和20．0～200．0 nmol/L范圍內呈良好的線性關系，線性方程分別為：抑制率（%）=49．253CCPF+9．433（r2=0．998 6）和抑制率（%）=0．193CCPF+57．599（r2=0．999 1），信噪比（S/N）為3時，檢出限為0．005 nmol/L。相比于GC［6］、GC－MS［7］、HPLC［9］、HPLC－MS［10］、SERS［11］和分子印跡光電化學傳感器［1］等方法，本方法的靈敏度更高（見表1），且本方法的檢出限低于我國規(guī)定的毒死蜱最高殘留限量。因此，該方法適用于實際樣品中毒死蜱的檢測。

表1 對毒死蜱不同分析方法的比較Table 1 Comparison of the analytical performance of different methods for chlorpyrifos detection

2.6 方法的重現(xiàn)性、再現(xiàn)性與穩(wěn)定性

在優(yōu)化實驗條件下，用相同MIP/AChE/BiOINFs/ITO修飾電極重復測量0．5 nmol/L毒死蜱9次，測得相對標準偏差（RSD）為4．2%，表明所制備的電極具有較好的重現(xiàn)性。用相同批次9個MIP/AChE/BiOINFs/ITO修飾電極分別測定0．5 nmol/L毒死蜱，測定結果的RSD為3．9%，表明修飾電極具有良好的再現(xiàn)性。進一步對MIP/AChE/BiOINFs/ITO電極的穩(wěn)定性進行驗證。將該分子印跡電極在4℃下儲存7 d后，通過測定，其光電流保留了原光電流響應值的93．9%，說明該雙識別型傳感器的穩(wěn)定性較好。

2.7 方法的選擇性及其在實際樣品中的應用

在優(yōu)化條件下，選擇一些和毒死蜱結構相似的物質，如：三唑磷（TRI）、氯苯（CHL）、殺螟硫磷（FEN）和甲基對硫磷（MP）作為干擾物，考察了分子印跡傳感器對毒死蜱的選擇性。通過在0．2 nmol/L毒死蜱中加入2．0 nmol/L TRI、CHL、FEN、MP，共存條件下測量光電流信號的強度。結果表明，當毒死蜱中添加上述干擾物時，其光電流信號分別為34．7、34．9、35．1、34．8 nA，相比較僅含毒死蜱（35．0 nA）時無明顯變化，表明該分子印跡傳感器的選擇性較好，具有一定的抗干擾能力。

在優(yōu)化條件下，采用制備的MIP/AChE/BiOINFs/ITO測定地表水樣品中的毒死蜱含量，結果未檢出毒死蜱，進一步對樣品進行不同濃度（0．05、0．1、0．5、1．0、20．0 nmol/L）毒死蜱的加標回收實驗。結果表明水樣中毒死蜱的回收率為96．1%～108%，RSD為2．8%～4．2%。表明傳感器在復雜樣品中具有良好的準確度和回收率。

3 結 論

鑒于分子印跡技術和酶的良好選擇性以及BiOINFs在太陽光照射下優(yōu)異的光吸收性能，本文構建了一種基于BiOINFs納米材料制備雙識別型光電化學傳感器，光電子在毒死蜱、BiOINFs和ITO之間的快速傳遞，使得光電流顯著增強。分子印跡技術和生物酶AChE的固定進一步增強了該傳感器的選擇性。該傳感器靈敏度高、制作簡便、便于攜帶，為水樣中毒死蜱的檢測提供了一種簡便的方法。