白 格，陳茂清，蔡 楠，郭子維，4，張 婷，郭鵬然*

（1．廣東省科學(xué)院，廣東省測(cè)試分析研究所（中國(guó)廣州分析測(cè)試中心），廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水環(huán)境污染在線監(jiān)測(cè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070；2．蘭州理工大學(xué) 石油化工學(xué)院，甘肅蘭州 730000；3．廣東省生產(chǎn)力促進(jìn)中心，廣東 廣州 510070；4．昆明理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，云南昆明 650000）

近年來(lái)，高級(jí)氧化技術(shù)（Advanced oxidation processes，AOPs）因反應(yīng)快速、降解徹底、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，在處理難降解有機(jī)污染物方面應(yīng)用廣泛［1－3］。AOPs主要包括（類）Fenton法［4］、光催化氧化法［5－6］、臭氧氧化法［7］、電化學(xué)氧化法［8］以及各種組合聯(lián)用法［9］等，其基本原理是通過(guò)在反應(yīng)體系中產(chǎn)生氧化性強(qiáng)的活性氧物質(zhì)，將待處理的有機(jī)污染物氧化降解為小分子有機(jī)物［10］，甚至礦化為CO2和H2O［11－12］。產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)包括自由基和非自由基，自由基有羥基自由基（·OH）、硫酸根自由基（·）和超氧陰離子自由基（）等，非自由基有單線態(tài)氧（1O2）等。其中，自由基途徑是各種AOPs技術(shù)中最主要的降解方式［13－14］，因此，對(duì)反應(yīng)過(guò)程中的自由基進(jìn)行定性定量檢測(cè)十分重要。然而，AOPs中的自由基穩(wěn)定性較差，且壽命較短，最為活潑的·OH半衰期為10－9s［15］，SO4－·相比·OH較為穩(wěn)定，半衰期為（3～4）×10－5s［16］，O2·-的存在時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，大約為1 s［17］。因此直接測(cè)定這些自由基較為困難，通常采用間接測(cè)定法，即使用探針或清除劑與活性較高的自由基反應(yīng)，再對(duì)分析試劑或產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析。

本文綜述了目前主要的測(cè)定方法，包括電子自旋/順磁共振法（Electron spin/paramagnetic resonance，ESR/EPR）、高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）、分光光度法、熒光光譜法和電化學(xué)方法（Electrochemical analyses）等。其中ESR和EPR主要用于自由基的定性分析，對(duì)自由基的含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定比較困難；HPLC需與其它檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用，方可進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析；分光光度法、熒光光譜法和電化學(xué)法則分別通過(guò)反應(yīng)前后吸光度、發(fā)光強(qiáng)度和電信號(hào)的變化定量檢測(cè)自由基。

1 自由基檢測(cè)方法

1.1 電子自旋/順磁共振法

電子自旋共振法（ESR）和電子順磁共振法（EPR）基本原理相似，均是將自由基轉(zhuǎn)移到磁場(chǎng)中可以測(cè)量到的含有未配對(duì)電子的化合物中，是定性分析自由基最直接和有效的技術(shù)，但所測(cè)目標(biāo)自由基需要具備一定的穩(wěn)定性和濃度，才能被ESR/EPR波譜儀檢測(cè)到。而AOPs中的自由基不穩(wěn)定，反應(yīng)極快，直接使用波譜儀無(wú)法檢測(cè)到反應(yīng)過(guò)程中的自由基，需要加入捕捉劑與自由基反應(yīng)生成較為穩(wěn)定的自旋加合物，通過(guò)波譜儀檢測(cè)各自旋加合物，再根據(jù)譜圖定性分析AOPs中的自由基。常用的自旋捕捉劑有二甲基吡咯啉氮氧化物（5，5-Dimethyl-1-pyrrolinen-oxid，DMPO）和2，2，6，6-四甲基哌啶（2，2，6，6-Tetramethylpiperidine，TEMP）等。通常使用DMPO測(cè)定·OH、O2·－和SO4－·，自旋加合物DMPO－OH和DMPO－O2·－的特征峰均為4條譜線，強(qiáng)度比分別為1∶2∶2∶1和1∶1∶1∶1（如圖1A和圖1B所示）。DMPO－SO4的特征峰為6條譜線，強(qiáng)度比為1∶1∶1∶1∶1∶1，且DMPO－SO4的特征峰通常與DMPO－OH在同一位置［18］（如圖1C所示）。在某些AOPs過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生非自由基1O2，通常使用TEMP捕獲1O2，自旋加合物TEMP－1O2的特征峰為3條譜線，強(qiáng)度比為1∶1∶1（如圖1D所示）。

圖1 ?OH、O2?－、SO4－?、1O2的ESR/EPR譜圖［19－21］Fig．1 ESR/EPR spectrograms of?OH，O2?－，SO4－?，1O2［19－21］A．DMPO－OH，B．DMPO－O2?－，C．DMPO－OH，DMPO－SO4，D．TEMP-1O2

據(jù)表1，ESR和EPR檢測(cè)技術(shù)在各種AOPs技術(shù)中應(yīng)用均較為廣泛，一方面，可以根據(jù)特征譜圖鑒別自由基種類［22，30］，或根據(jù)需要，只分析主要自由基［18，20］；另一方面，可以通過(guò)比對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的不同，分析自由基的相對(duì)含量［18－19，31］。待測(cè)系統(tǒng)中存在一種或多種未知自由基需要確認(rèn)種類時(shí)，使用ESR/EPR可輕易地通過(guò)各自由基自旋加合物譜圖的特異性確認(rèn)自由基的類型。然而該法不能定量分析，使用的儀器價(jià)格昂貴，成本較高，需要操作人員具有豐富的知識(shí)和專業(yè)的技術(shù)，且靈敏度不高，捕捉劑與自由基反應(yīng)后的衍生物穩(wěn)定性雖強(qiáng)于自由基，但在常溫下穩(wěn)定存在的時(shí)間仍不超過(guò)20 min［32］，無(wú)法準(zhǔn)確、快速、便捷地測(cè)定自由基含量，在實(shí)際應(yīng)用方面存在諸多困難。

表1 ESR/EPR法在不同降解方法中檢測(cè)自由基的應(yīng)用Table 1 Application of ESR/EPR for free radicals detection in different degradation methods

1.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法是高效快速的分離方式，測(cè)定自由基時(shí)需要和不同的檢測(cè)器聯(lián)用?，F(xiàn)在常用的檢測(cè)器有紫外（Ultraviolet，UV）檢測(cè)器、二極管陣列（Diode array detector，DAD）檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器（Electrochemical detect，ECD）、熒光檢測(cè)器（Fluorescence detector，F(xiàn)D）和質(zhì)譜檢測(cè)器（Mass spectrum，MS）等。與ESR/EPR類似的是，因?yàn)樽杂苫嬖趬勖^短，在HPLC分離檢測(cè)前需先進(jìn)行捕捉。而區(qū)別是，ESR/EPR原理為將捕捉劑作為探針，通過(guò)檢測(cè)與自由基反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行定性分析；而HPLC聯(lián)用檢測(cè)器主要用于自由基的定量分析，檢測(cè)原理有兩種［33］：一種與ESR/EPR相似，通過(guò)分離檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，另一種是將捕捉劑作為清除劑，通過(guò)檢測(cè)與自由基反應(yīng)后捕捉劑的濃度變化，對(duì)自由基進(jìn)行定量分析。根據(jù)HPLC的原理，要求捕捉劑不僅能夠捕捉待測(cè)自由基，且捕捉劑本身或反應(yīng)產(chǎn)物能夠使用色譜法分離且較為穩(wěn)定［33］。

常用的探針捕捉劑有水楊酸（Salicylic acid，SA）、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）和4-羥基苯甲酸（p-Hydroxybenzoic acid，4-HBA）等。其中部分探針對(duì)捕捉的自由基具有強(qiáng)選擇性。對(duì)·OH具有選擇性的探針有SA和DMSO［34－35］。SA與·OH的反應(yīng)速率常數(shù)為2．7×1010M－1·s－1［36］，羥基化產(chǎn)物為2，3-二 羥 基 苯 甲 酸（2，3-Dihydroxybenzoic acid，2，3-DHBA）和2，5-二 羥 基 苯 甲 酸（2，5-Dihydroxybenzoic acid，2，5-DHBA），無(wú)中間產(chǎn)物影響，且羥基化產(chǎn)物較為穩(wěn)定，易采用HPLC分離，并可聯(lián)用ECD、UV和FD進(jìn)行檢測(cè)［37］。Zhang等［38］聯(lián)用UV檢測(cè)器，研究了三維蒽醌/聚吡咯改性石墨氈（3D AQS/PPy－GF）陰極電催化氧化反應(yīng)過(guò)程中·OH的產(chǎn)生量。Shimizu等［36］聯(lián)用ECD檢測(cè)器，證實(shí)TiO2的存在可加速聲催化氧化過(guò)程中·OH的產(chǎn)生。Arrojo等［35］聯(lián)用FD檢測(cè)器測(cè)定了超聲催化氧化過(guò)程中的·OH。以上研究均依據(jù)SA羥基化產(chǎn)物與·OH之間的線性關(guān)系對(duì)·OH進(jìn)行定量分析，檢出限可達(dá)5μg/L及以下［39］，定量限為20μg/L［35］。需要注意的是，SA的羥基化產(chǎn)物不止一種，會(huì)使定量分析變得復(fù)雜，而在Fenton相關(guān)的研究中，SA式結(jié)構(gòu)會(huì)與Fe（Ⅱ、Ⅲ）形成絡(luò)合物，且在反應(yīng)過(guò)程中可能會(huì)因?yàn)椤H的快速產(chǎn)生導(dǎo)致SA過(guò)度礦化［40］，故使用SA作為探針會(huì)影響·OH測(cè)定的準(zhǔn)確性。因此在Fenton相關(guān)的·OH檢測(cè)中，需要過(guò)量添加SA或者使用其他與金屬離子不發(fā)生反應(yīng)的捕捉劑。

故在Fenton相關(guān)研究中，探針DMSO的應(yīng)用較多。DMSO具有高溶解性和低揮發(fā)性［41］，與·OH的反應(yīng)速率常數(shù)為6．6×109M－1·s－1［36］。與SA相比，不會(huì)和鐵或其他金屬離子形成絡(luò)合物，對(duì)Fenton和類Fenton中的·OH檢測(cè)無(wú)影響［42］。DMSO與·OH可通過(guò)一系列反應(yīng)（反應(yīng)（1）～（3））定量生成甲醛，加入2，4-二硝基苯肼（DNPH）后反應(yīng)生成相應(yīng)的肼（HCHO－DNPH）［41－42］，然后采用HPLC/UV分離并檢測(cè)HCHO－DNPH，再根據(jù)獲得的線性關(guān)系定量分析·OH。Tai等［42］研究了Fenton和配體－Fenton試劑與H2O2組成的高級(jí)氧化體系中·OH的生成速率，Yuan等［43］研究了Pd電催化氧化工藝降解地下水中三氯乙烯（TCE）的過(guò)程中·OH的產(chǎn)生。以上研究均采用DMSO為捕捉劑，且測(cè)定的HCHO－DNPH與反應(yīng)體系產(chǎn)生的·OH之間存在良好的定量關(guān)系，同時(shí)DNPH易獲得，檢測(cè)方便，易于操作。上述檢測(cè)方法靈敏度高，F(xiàn)enton體系中H2O2檢出濃度低至1．0×10－7mol·L－1［44］。然而，由于有機(jī)底物會(huì)對(duì)甲基自由基的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生重大影響，反應(yīng)底物中存在大量其他有機(jī)物時(shí)，使用該方法檢測(cè)會(huì)產(chǎn)生較大誤差。

在·OH的檢測(cè)中，除SA和DMSO外，還可應(yīng)用其他捕捉劑。Bai等［45］等利用大氣壓強(qiáng)電離放電生成的·OH處理飲用水中的高藻。Tung等［46］研究了光催化和電催化系統(tǒng)中·OH的產(chǎn)生。以上研究均利用4-HBA捕集·OH，生成唯一的產(chǎn)物3，4-二羥基苯甲酸（3，4-DHBA），HPLC分離后使用DAD檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明衍生物3，4-DHBA的濃度和·OH的量存在顯著的線性關(guān)系［46］。

上述·OH的檢測(cè)中以探針式捕捉劑為主，根據(jù)探針的選擇性和羥基化產(chǎn)物與·OH的線性關(guān)系定性定量·OH。而在SO4-·的檢測(cè)中，清除劑式捕捉劑的應(yīng)用更多。常用的作為清除劑的捕捉劑有苯甲酸（Benzoic acid，BA）、硝基苯（Nitrobenzene，NB）、4-對(duì)氯苯甲酸（p-Chlorobenzoic acid，pCBA）和4-硝基苯甲酸（p-Nitrobenaoic acid，pNBA）等。可利用清除劑對(duì)SO4－·和·OH反應(yīng)速率常數(shù)的差別定性檢測(cè)自由基，或根據(jù)清除劑的去除率定量分析自由基。

表2 各指示劑對(duì)·OH和SO4－·的反應(yīng)速率常數(shù)［47－48］Table 2 Reaction rate constants of indicators with·OH and SO4－·［47－48］

如表2所示，清除劑BA和pCBA與·OH和SO4－·均反應(yīng)快速，然而清除劑NB與pNBA僅與·OH快速反應(yīng)，與SO4－·幾乎不反應(yīng)?？衫们宄齽┡c自由基反應(yīng)速率的特性，對(duì)自由基進(jìn)行定性定量檢測(cè)。Zhang等［49］以pCBA和NB作為清除劑，對(duì)MnO2－Co3O4涂覆的陶瓷膜催化過(guò)硫酸鹽進(jìn)行研究。Lutze等［47］以pCBA和pNBA為清除劑，研究了氯化物在以SO4－·為基礎(chǔ)的水處理中的作用。Guan等［50］以NB作為清除劑，制備了磁性多孔CuFe2O4催化過(guò)氧一硫酸鹽氧化降解阿特拉津。Wang等［48］以BA和NB為清除劑，利用亞硫酸氫鹽激活過(guò)硫酸鹽。Guan等［51］以BA和NB為清除劑，研究了pH值對(duì)UV/過(guò)氧一硫酸鹽體系中·OH和SO4

－·形成的影響。以上研究均選擇與·OH和SO4－·反應(yīng)速率常數(shù)差距較大的清除劑，以差距較小的清除劑作為輔助，針對(duì)與自由基反應(yīng)完成后殘留的清除劑，利用HPLC耦合UV檢測(cè)器進(jìn)行分離檢測(cè)，并根據(jù)清除劑濃度的降低定性定量分析反應(yīng)體系中的自由基。對(duì)于AOPs中的測(cè)定，使用HPLC的相關(guān)研究較少。

通過(guò)HPLC聯(lián)用檢測(cè)器檢測(cè)分析自由基靈敏度好，檢出限低，但存在儀器價(jià)格高，測(cè)定較為復(fù)雜的缺點(diǎn)。該檢測(cè)方法的定性分析依賴于捕捉劑的選擇性，選用特異性強(qiáng)的捕捉劑可以滿足同時(shí)定性定量檢測(cè)的要求。

1.3 光譜法

1.3.1 分光光度法 分光光度法原理與HPLC類似，均需要利用捕捉劑，且有兩種檢測(cè)原理：捕捉劑與自由基反應(yīng)后被消耗或生成穩(wěn)定加合物。由于吸光度與反應(yīng)前發(fā)生變化，利用其差值可定量分析自由基產(chǎn)生量。該方法測(cè)定快速，捕捉劑容易獲得，操作簡(jiǎn)單，且儀器的價(jià)格遠(yuǎn)低于ESR/EPR波譜儀和液相色譜儀，因此是目前國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室最常用的分析方法。常用的探針式捕捉劑有SA、DMSO和硝基四氮唑藍(lán)（Nitrotetrazolium blue chloride，NBT）等，清除劑式捕捉劑有結(jié)晶紫（Crystal violet，CV）、亮綠顯色劑、孔雀綠顯色劑、鄰二氮菲、亞甲基藍(lán)等。

探針式捕捉劑SA和DMSO在分光光度法中同樣用于·OH檢測(cè)。SA在分光光度法中應(yīng)用的反應(yīng)原理與HPLC中相同，皆通過(guò)產(chǎn)生羥基化產(chǎn)物2，3-DHBA和2，5-DHBA，使溶液吸光度發(fā)生變化。Peralta等［52］基于鉑電極電化學(xué)氧化過(guò)程中產(chǎn)生的·OH，通過(guò)吸光度的變化定量分析了·OH。然而與HPLC中不同，分光光度法中DMSO的檢測(cè)原理是，DMSO與·OH反應(yīng)定量生成甲醛后，通過(guò)乙酰丙酮法，即與乙酰丙酮、氨發(fā)生Hantzsch反應(yīng)生成黃色化合物3，5-二乙酰-1，4-二氫吡啶，于414 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，通過(guò)與反應(yīng)前進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)差值定量分析·OH。但該法需要高溫環(huán)境，因此目前很多研究使用改進(jìn)的Hantzsch法。其中一種改進(jìn)方法為引入一種新型試劑乙酰乙酰苯胺（Acetoacetanilide，AAA），可使反應(yīng)無(wú)需任何加熱，在室溫下進(jìn)行。Lousada等［53］使用該檢測(cè)方法研究了二氧化皓（ZrO2）顆粒催化H2O2分解過(guò)程中·OH形成的動(dòng)力學(xué)機(jī)理，檢出限可達(dá)1．43×10－6mol/L。

分光光度法中檢測(cè)O2·－常使用的探針有：NBT、XTT四唑鹽、WST-1四唑鈉鹽和NH2OH等。Zhang等［38］以NBT為清除劑，檢測(cè)了3D AQS/PPy－GF陰極活化氧產(chǎn)生的O2·－，NBT與O2·－相遇后得電子形成的不溶于水的藍(lán)色單臜與O2·－的產(chǎn)量呈線性關(guān)系。然而NBT在可見(jiàn)光照射下不穩(wěn)定，使得在光催化氧化反應(yīng)中使用NBT存在一定的困難［54］。NH2OH可將O2·－氧化為NO2－，NO2

－和磺胺酸反應(yīng)后生成一種重氮鹽，最后該重氮鹽與α-苯胺反應(yīng)生成的紅色偶氮染料同樣可以間接反映O2·－的產(chǎn)量。然而該方法在光系統(tǒng)中同樣不適用，因?yàn)楣饷魟┊a(chǎn)生的強(qiáng)還原性的水合電子可以與NO2－反應(yīng)，將其還原為N2［54］。故在光催化反應(yīng)中需要使用其他選擇性強(qiáng)的探針。Agbe等［55］以XTT四唑鹽為探針，檢測(cè)了ZnO納米粒子（ZnO－NPs）光催化過(guò)程產(chǎn)生的O2

·－的含量。XTT四唑鹽與O2·－反應(yīng)后，氮原子環(huán)打開(kāi)，生成深紅色的XTT甲臜，在478 nm處表現(xiàn)出典型的最大吸收，且XTT四唑鹽和XTT甲臜具有不同的振動(dòng)、電子和光學(xué)性質(zhì)，可同時(shí)滿足O2

·－檢測(cè)和定量要求。使用分光光度法檢測(cè)SO4－·的研究較少，在激活過(guò)硫酸鹽的研究中，更多的研究是使用分光光度法測(cè)定過(guò)硫酸鹽含量的變化。

探針式捕捉劑大多為對(duì)自由基具有強(qiáng)選擇性的物質(zhì)，然而分光光度法中的清除劑式捕捉劑一般不具備選擇性。Yin等［56］以CV作為清除劑，研究了超聲協(xié)同電催化氧化反應(yīng)體系中·OH的形成，根據(jù)吸光度的變化測(cè)量了氧化反應(yīng)后溶液中產(chǎn)生的·OH。然而CV不具備選擇性，在陽(yáng)極同樣可以直接被氧化，影響定量分析·OH的準(zhǔn)確度。

1.3.2 熒光光譜法 熒光光譜法同樣需要應(yīng)用捕捉劑捕集自由基，其原理與分光光度法類似，自由基與捕捉劑反應(yīng)后，誘導(dǎo)捕捉劑發(fā)光或發(fā)光減弱，通過(guò)發(fā)光強(qiáng)度的差值可定量分析自由基的數(shù)量［33，57］。該方法靈敏度及分辨率高，操作簡(jiǎn)單，所需設(shè)備及試劑價(jià)格低廉，是實(shí)驗(yàn)室的常用方法。常用的捕捉劑為對(duì)苯二甲酸（p-Phthalic acid，PTA）和香豆素（Coumarin，COU），二者均對(duì)·OH具有選擇性。

PTA不具有熒光特性，與·OH的反應(yīng)速率常數(shù)為4．0×109M－1·s－1，反應(yīng)后會(huì)生成具有高熒光特性的穩(wěn)定有機(jī)物二羥基對(duì)苯二甲酸，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為315 nm和425 nm，可通過(guò)熒光光譜儀檢測(cè)到的熒光差值定量分析自由基。Hou等［22］研究了三維電極-電Fenton反應(yīng)過(guò)程中·OH的含量，Juretic等［58］測(cè)定了超聲催化氧化系統(tǒng)中·OH的產(chǎn)生量，Villeneuve等［59］考察了超聲催化氧化系統(tǒng)中的空化現(xiàn)象與·OH產(chǎn)量的關(guān)系，Jimenez等［60］對(duì)幾種光催化膠凝材料產(chǎn)生的·OH進(jìn)行定量分析。以上研究均使用PTA作為探針。Charbouillot等［61］以硝酸鹽和過(guò)氧化氫作為光化學(xué)中·OH的來(lái)源，研究PTA作為捕捉劑的性能和選擇性，發(fā)現(xiàn)與苯甲酸相比，PTA對(duì)·OH的選擇性更強(qiáng)。

Lin等［62］分析了針鐵礦催化的類Fenton反應(yīng)中陰離子對(duì)·OH產(chǎn)生的影響，Zhang等［63］以各種改性TiO2為光催化劑，光催化氧化降解水懸浮體系中的乙醛，Ohguri等［64－65］研究了由全氟磺酸組成的隔膜電極組構(gòu)成的電化學(xué)體系中·OH的形成，Nagarajan等［66］比較評(píng)估了多種可見(jiàn)光和UV活性光催化劑。這些研究使用的捕捉劑均為COU，與·OH反應(yīng)后生成唯一的高熒光衍生物傘形酮（Umbelliferone，7-HC，圖2），7-HC與系統(tǒng)中生成的·OH呈線性關(guān)系，最低可檢測(cè)到3×10-8mol/L的·OH。

圖2 香豆素與傘形酮［67］Fig．2 Coumarin and umbelliferone

Náfrádi等［68］以TiO2光催化作為·OH的來(lái)源，比較了捕捉劑COU和香豆素-3-羧酸（Coumarin-3-carboxyllic acid，3-CCA）的檢測(cè)能力。發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)·OH的選擇性均較高，反應(yīng)速率常數(shù)分別為6．88×109M－1·s－1和4．9×109M－1·s－1，熒光產(chǎn)物僅通過(guò)與·OH反應(yīng)形成，且產(chǎn)率差異較小。3-CCA吸附性良好，在非均相的反應(yīng)體系中，易吸附于催化劑上，當(dāng)反應(yīng)溶液中存在其他·OH清除劑時(shí)，3-CCA與·OH的反應(yīng)受到的影響很小；而COU因?yàn)槲叫暂^差，與·OH的反應(yīng)容易受到溶液中其他清除劑的影響。

以PTA和COU為捕捉劑的熒光光譜法作為成熟的自由基測(cè)定方法，仍然存在不足，如光穩(wěn)定性較差，激發(fā)和發(fā)射峰寬，斯托克斯位移小使得樣品穿透性不強(qiáng)，靈敏度不高等。為提高熒光光譜法的性能，Cui等［69］設(shè)計(jì)并合成了一種獨(dú)特的Tb3+螯合發(fā)光探針來(lái)測(cè)定硫酸亞鐵銨和過(guò)氧化氫體系中的·OH，該探針是在Tb3+螯合劑中加入一個(gè)富電子的芳香族對(duì)氨基苯氧基，由于對(duì)氨基苯醚的裂解，產(chǎn)生一種高度發(fā)光的Tb3+螯合劑，通過(guò)熒光光譜儀測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度的差值，可計(jì)算出·OH的產(chǎn)量。該探針不僅大大提高了斯托克斯位移，還具有較強(qiáng)的選擇性，與其他活性氧無(wú)法反應(yīng)。Zhuang等［70］開(kāi)發(fā)了一種用于·OH的比例熒光生物傳感器，以牛血清白蛋白保護(hù)的金納米團(tuán)簇（AuNC）為參考熒光團(tuán)，與非熒光的特定分子2-苯甲酸整合，開(kāi)發(fā)了對(duì)·OH具有高選擇性和高靈敏度的比例熒光探針。該比例式探針中，2-苯甲酸產(chǎn)物的熒光信號(hào)位于515 nm處，而AuNC在637 nm處發(fā)射的紅色熒光保持恒定，可提供內(nèi)置校正，作為消除環(huán)境影響的參考信號(hào)，保證探針良好的穩(wěn)定性，該法檢出限達(dá)0．68×10－6mol/L。

使用探針或清除劑與O2·-和SO4-·反應(yīng)并以熒光光譜法進(jìn)行自由基檢測(cè)的研究目前較少，有研究利用O2

·－的還原性，將Fe3+－EDTA還原為Fe2+－EDTA，再與H2O2反應(yīng)生成·OH，最后通過(guò)熒光光譜法對(duì)·OH進(jìn)行定量。該方法過(guò)程復(fù)雜，影響因素較多，不適于廣泛應(yīng)用。

與HPLC和分光光度法類似，熒光光譜法的選擇性高低與捕捉劑性質(zhì)有關(guān)，選用選擇性較強(qiáng)的捕捉劑，其熒光光譜法選擇性相應(yīng)較強(qiáng)。HPLC、分光光度法和熒光光譜法原理相似，但檢測(cè)特點(diǎn)和對(duì)捕捉劑的要求不同。表3列出了3種方法的優(yōu)勢(shì)、應(yīng)用領(lǐng)域以及對(duì)捕捉劑的要求。

表3 HPLC和光譜法的優(yōu)勢(shì)、應(yīng)用領(lǐng)域及對(duì)捕捉劑的要求Table 3 The advantages，application area and requirement of HPLC and spectroscopic methodology

1.4 電化學(xué)法

電化學(xué)技術(shù)已被證明是測(cè)定自由基的高效工具，具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)和操作方便等優(yōu)勢(shì)。應(yīng)用各種化學(xué)修飾電極（Chemically modified electrode，CMEs）是近來(lái)電化學(xué)檢測(cè)自由基的研究熱門，該法依據(jù)自由基對(duì)修飾電極的損傷構(gòu)建電化學(xué)傳感器對(duì)自由基進(jìn)行測(cè)定。

目前經(jīng)常使用的電極修飾劑有DNA（Deoxyribonucleic acid）、疏基己醇（6-Mercapto-1-hexanol，MCH）和導(dǎo)電聚苯胺（Polyaniline，PANI）。Wu等［71］用硫醇化的DNA1和MCH修飾平面Au基底電極，當(dāng)電極浸入含有Fe2+和H2O2的Fenton溶液中時(shí)，會(huì)嚴(yán)重氧化損傷電極表面的DNA1，使之無(wú)法進(jìn)行正常的堿基互補(bǔ)配對(duì)，剩余未損傷的DNA1則與金納米顆粒（AuNPs）上的DNA2雜交，以亞甲基藍(lán)（MB）為電化學(xué)探針，使用方波伏安法（Square wave voltammetry，SWV）進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可達(dá)到測(cè)定·OH的目的（圖3），然而該方法得到的響應(yīng)信號(hào)較弱。Huang等［72］以玻碳電極（Glassy carbon electrode，GCE）作為基底材料，使用DNA和MCH修飾其表面，并負(fù)載氮摻雜多孔碳納米結(jié)構(gòu)（N—C）和AuNPs作為信號(hào)放大器，以六氨（Ⅲ）（Ru（NH3）63+）為電化學(xué)探針，通過(guò)SWV法對(duì)Fenton法生成的·OH進(jìn)行了檢測(cè)。與金基底電極相比，大大提高了電導(dǎo)率，靈敏度進(jìn)一步提升。Wang等［73］用更穩(wěn)定的多壁碳納米管（Multi-walled carbon nanotube，MCNTs）為電Fenton反應(yīng)的陰極材料，將其與Fe@Fe2O3納米鏈的混合物結(jié)合到含有聚二甲基二丁基層氯化銨和完整DNA的膜中，研制了一種新型的電化學(xué)傳感器。電Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH和氧化損傷DNA均在膜中完成。該文以Co（phen）33+和Ru（NH3）63+為電化學(xué)指標(biāo)，通過(guò)測(cè)量DPV的信號(hào)變化實(shí)現(xiàn)了·OH的檢測(cè)。

圖3 依據(jù)自由基對(duì)DNA的損傷構(gòu)建電化學(xué)傳感器的原理示意圖［71］Fig．3 Schematic diagram of electrochemical sensors based on damage of DNA by free radicals

除DNA外，還有其他成本較低的修飾電極。Fang等［74］將PANI涂覆在Si3N4/Si基板上，基于與Fenton反應(yīng)中的·OH反應(yīng)后PANI導(dǎo)電率的降低程度與·OH濃度呈線性關(guān)系的原理進(jìn)行檢測(cè)。該傳感器成本低、體積小，易于操作，僅需要少量樣品，且靈敏度高，檢出限為2×10－7mol/L。Hu等［75］使用4-HBA捕獲羥基自由基，在KH2PO4－K2HPO4緩沖溶液中，碳盤電極上的4-HBA和3，4-DHBA在電化學(xué)上的顯著差異使得可無(wú)需分離直接使用循環(huán)伏安法（Cyclic voltammetry，CV）檢測(cè)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH，檢出限為5．0×10－7mol/L。Gualandi等［76］使用多酚膜修飾GCE，以Fenton反應(yīng)或H2O2光解產(chǎn)生的·OH引起的多酚膜降解為分析信號(hào)，Ru（NH3）63+作為氧化還原探針，基于CV和計(jì)時(shí)電流法（Chronoamperometry，CA）確定經(jīng)·OH降解后電極的未覆蓋面積，再與裸電極進(jìn)行對(duì)比，測(cè)得了·OH的產(chǎn)量。將以上傳感器與以SA為探針的HPLC檢測(cè)法進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩者具有良好的線性相關(guān)性。但電化學(xué)傳感器多為一次性產(chǎn)品，無(wú)法重復(fù)使用。

除使用化學(xué)修飾電極外，Hong等［77］采用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH與DMSO反應(yīng)，定量生成甲醛，然后在pH 6．2下與鹽酸肼反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)單掃示波譜顯示二階導(dǎo)數(shù)陰極波，進(jìn)而確定了·OH的產(chǎn)量。該檢測(cè)系統(tǒng)簡(jiǎn)單、快速，不需要加熱和長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間。電化學(xué)法檢測(cè)O2·－的研究多數(shù)應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞釋放的，對(duì)于AOPs中和·的檢測(cè)目前研究較少。

1.5 其他方法

共振散射法的原理是締合粒子的共振散射效應(yīng)。Liang等［78］基于羅丹明染料締合粒子的共振散射效應(yīng)，提出一種新的測(cè)定Fenton反應(yīng)中·OH的共振散射法。在HCl－NaAc緩沖液中，F(xiàn)enton反應(yīng)的·OH將過(guò)量的I－氧化為I3－。I3－分別與羅丹明B（Rhodamine B，RhB）、丁基羅丹明B（b-Rhodamine B，b-RhB）、羅丹明6G（Rhodamine G，RhG）和羅丹明S（Rhodamine S，RhS）結(jié)合，形成在420 nm和610 nm處具有更強(qiáng)共振散射效應(yīng)的締合粒子。

化學(xué)發(fā)光法的原理是發(fā)光劑被自由基氧化成激發(fā)態(tài)，返回基態(tài)時(shí)放出大量光子，自由基的量與發(fā)光值呈線性相關(guān)。Oguma等［79］研究了二氧化硅涂層對(duì)銳鈦礦型二氧化鈦光催化性能的影響，涉及到的活性氧種類有O2·－和·OH。其中O2·－使用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。王大彬等［80］以魯米諾為探針檢測(cè)了光催化產(chǎn)生的，檢測(cè)限可達(dá)1．95 nmol/L。

2 自由基檢測(cè)方法及捕捉劑的特點(diǎn)與不足

AOPs中的自由基較為活潑，壽命較短，直接檢測(cè)比較困難，因此檢測(cè)方法均為間接方法。各檢測(cè)方法雖應(yīng)用廣泛，但在使用過(guò)程中仍存在諸多問(wèn)題，表4總結(jié)了AOPs中自由基主要檢測(cè)方法的特點(diǎn)及不足。

表4 自由基檢測(cè)方法的特點(diǎn)及不足Table 4 The strengths and weaknesses of determination methods for free radicals

HPLC、分光光度法和熒光光譜法的檢測(cè)原理類似，方法的選擇性完全依賴于捕捉劑的選擇性，表5總結(jié)了這些檢測(cè)方法中常用的選擇性捕捉劑的特點(diǎn)和不足。

表5 部分選擇性探針的特點(diǎn)和不足Table 5 The strengths and weaknesses of several selective probes

3 自由基檢測(cè)方法的研究和應(yīng)用方向

在采用高級(jí)氧化法處理有機(jī)污染物時(shí)，自由基的產(chǎn)生是至關(guān)重要的一環(huán)，自由基的測(cè)定也是必不可少的一部分。目前高級(jí)氧化技術(shù)中自由基的檢測(cè)已有許多方法，然而大多為間接測(cè)定法，步驟較多，選擇性和穩(wěn)定性不夠，無(wú)法滿足對(duì)處理過(guò)程準(zhǔn)確度和精確度的要求。且根據(jù)現(xiàn)有研究，多種高級(jí)氧化技術(shù)中均不是唯一的自由基種類發(fā)揮作用，而是產(chǎn)生多種自由基協(xié)同作用，甚至可能存在更多的未知自由基因?yàn)椴环€(wěn)定等因素未被探索?，F(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)已不能很好適應(yīng)和滿足目前的測(cè)定要求。高級(jí)氧化技術(shù)中的自由基檢測(cè)技術(shù)和方法應(yīng)在以下方向進(jìn)一步探索：

（1）開(kāi)發(fā)新型捕捉劑，不僅要進(jìn)一步提高與自由基反應(yīng)后衍生物的穩(wěn)定性，使捕捉后的加合物更容易更方便保存，還要提高選擇性；籠統(tǒng)地定量分析體系中的活性組分，已無(wú)法滿足現(xiàn)有需求，對(duì)體系中產(chǎn)生的自由基進(jìn)行精準(zhǔn)、精確的定性定量分析逐漸成為研究熱門。現(xiàn)有方法中液相色譜法、分光光度法、熒光光譜法等的選擇性均依賴于捕捉劑的選擇性，提高捕捉劑的選擇性無(wú)疑成為研究重點(diǎn)和難點(diǎn)。

（2）開(kāi)發(fā)新型檢測(cè)方法，以更精準(zhǔn)、精確地定量分析已知自由基，提高定性分析能力，更簡(jiǎn)便、快速地對(duì)體系中同時(shí)存在的多種已知自由基進(jìn)行定性，甚至探索分析未知的自由基或其他活性氧種類。

（3）改進(jìn)已有的分析方法或捕捉劑，提高捕集效率，精簡(jiǎn)方法步驟，使測(cè)定能夠更快速和便捷；在此基礎(chǔ)上，還要提高靈敏度、準(zhǔn)確性、檢出限和抗干擾能力，使檢測(cè)更精確。

（4）目前應(yīng)用廣泛的均為間接法，步驟繁瑣，分析過(guò)程中干擾因素較多，今后的研究應(yīng)向直接檢測(cè)發(fā)展，減少不必要的干擾項(xiàng)。