陳森明,陳偉忠,章耀鴻
(1潮州市人民醫(yī)院腫瘤科 廣東 潮州 521000)
(2潮州市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 廣東 潮州 521000)
在世界范圍內(nèi),食管癌是最常見的惡性腫瘤之一,食管癌發(fā)病有顯著性地域特點(diǎn)。我國(guó)食管癌90%以上為鱗癌,發(fā)病率在全部惡性腫瘤排名第6位(6.78%),死亡排名第4位(8.04%),主要原因還是食管癌早期診斷難,中晚期治療效果差。放射治療是中晚期食管癌治療最主要手段之一[1],蔣曉東等[2]研究提示人類同源的果蠅片段基因1(Protein patched homolog 1, PTCH1)在22例食管癌患者中均有突變,其中rs199476092和rs202111971突變位點(diǎn)僅見于放射抗拒組。本文利用特異性引物(Polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增測(cè)序檢測(cè)食管鱗癌(esophageal cancer, ESCC)患者的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP),分析不同基因型患者放射治療的近期療效,探討的基因多態(tài)性與食管鱗癌患者放療敏感性的關(guān)系。
收集2015年12月—2020年6月在潮州市人民醫(yī)院腫瘤科行放射治療的初治食管鱗癌患者105例,其中98例能成功擴(kuò)增并測(cè)序PTCH1基因位點(diǎn),本文對(duì)該98例患者進(jìn)行分析。所有患者均經(jīng)病理活檢確診為食管鱗狀細(xì)胞癌。其中男性71例,女性27例,平均年齡62.6歲,中位年齡60歲。頸段胸上段8例,胸中段63例,胸下段27例。按《非手術(shù)治療食管癌的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)(草案)》(2010年),Ⅱ期24例,Ⅲ期74例。所有病例治療前一般狀態(tài)好,無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,無重要器官功能障礙,卡氏評(píng)分均≥70分。本次得到汕頭大學(xué)附屬潮州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)許可,所以患者或監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。
所有患者均行三維適形放療(3-Dimensional Conformal Radiatherapy, 3DCRT)或調(diào)強(qiáng)放療(Ⅰntensity-Modulated Radiation Therapy, ⅠMRT),其中三維適形放療40例,調(diào)強(qiáng)放療58例。靶區(qū)勾畫和計(jì)劃評(píng)價(jià)參照第4版腫瘤放射治療學(xué)[3],患者仰臥,雙臂置體側(cè),頭過伸,體部熱塑膜固定。在CT模擬機(jī)上行胸部增強(qiáng)掃描,三維適形放療層厚5 mm,調(diào)強(qiáng)放療層厚3 mm,掃描圖像傳輸至放射性粒子治療計(jì)劃系統(tǒng)進(jìn)行重建和靶區(qū)勾畫,放療劑量:GTV60~64 Gy(Gray),PTV50~54 Gy。全部病例均給予奈達(dá)鉑(20 mg/m2/周)行同步化療。
全組病例治療結(jié)束時(shí)及結(jié)束1月后均行食管鋇餐造影和胸部增強(qiáng)CT。按RECIST標(biāo)準(zhǔn)將療效分CR(Complete Remission)組、PR(Partial Remission)組、SD(Stable Disease)組、PD(Progressive Disease)組。CR和PR為放療敏感組,SD和PD為放療抗拒組。
放療近期療效根據(jù)萬鈞等(1989)提出的《腫瘤放射治療療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》[4],由2位臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的放療科醫(yī)師于放療后1~3個(gè)月分別獨(dú)立評(píng)價(jià)患者的近期療效。
針對(duì)PTCH1基因SNP: rs199476092和rs202111971,根 據(jù)NCBI的PCTH1基 因 系 列(NC_000009.12),采用LightScanner引物設(shè)計(jì)軟件(Ⅰdaho TechnologyⅠdaho Technology,美國(guó))設(shè)計(jì)高分辨熔解曲線(High Resolution Melting, HRM)的引物(圖1)。所有引物由蘇州金唯智公司合成。PCR反應(yīng)體系為:10×PCR反應(yīng)預(yù)混液5.0μL,上下游引物各0.5μL, LC Green 1.0μL,基因組DNA 2.0μL,并用蒸餾水將反應(yīng)體積補(bǔ)足到10.0μL。PCR的擴(kuò)增反應(yīng)為:94℃預(yù)變性3 min,94℃變性10 s,60℃退火10 s,72℃延伸15 s,35個(gè)循環(huán)。
圖1 2個(gè)SNP位點(diǎn)的序列、探針以及引物
完成PCR擴(kuò)增后,按照LightScanner 96分析儀操作步驟,對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析,在70~95 ℃收集熒光信號(hào)數(shù)據(jù)。采集熒光信號(hào)并繪制熔解曲線,進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。熔解溫度相同的歸為同一基因型。
應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計(jì)分析。不同基因型組之間放療敏感性差異以例數(shù)表示,行χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
截至2020年9月30日,隨訪2~49.2個(gè)月,有6例隨訪不到,中位隨訪26.5個(gè)月,隨訪率為93.9%。截止隨訪時(shí)間,98例患者中死亡75例,其中局部復(fù)發(fā)35例,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移10例,復(fù)發(fā)+轉(zhuǎn)移30例。
98例患者中放療敏感組82例,放療近期總有效率為83.7%;其中Ⅱ期患者共24例,放療敏感組23例,放療近期有效率為95.8%;Ⅱ期患者共74例,放療敏感組59例,放療近期有效率為79.7%。全組基本資料與放療療效的關(guān)系見表1。余未見顯著差異(P>0.05),見表1。
表1 98例食管鱗癌放療近期療效比較
98例患者血液中均可見PTCHl表達(dá),PTCHl基因的表達(dá)與患者性別、食管癌分期、年齡、吸煙情況、酗酒均無關(guān),與腫瘤的分化程度(高中分化、低分化)有關(guān),高中分化的食管癌組織中PTCHl表達(dá)量4.86(4.24±1.42)低于低分化腫瘤中PTCHl基因的表達(dá)量5.59(4.64±2.55),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
潮汕地域是全國(guó)有名的食道癌高發(fā)地,發(fā)病率高達(dá)40/10萬人,每年新發(fā)病例估量超越5 000例,是一種嚴(yán)重影響本地人民健康的惡性腫瘤。食管癌早期癥狀不明顯,早期診斷難,在醫(yī)院接受治療的食管癌患者大多數(shù)處于中晚期,治療效果不佳,5年生存率15%~24%,也有報(bào)道單純放療5年生存率不到10%的[4]。放療是治療局部晚期食管癌和其他原因不能手術(shù)的早期食管癌患者的主要手段,在強(qiáng)化局部腫瘤控制,防止局部復(fù)發(fā)中具有重要的作用。研究表明,將治療劑量從50 Gy(Gray)增加到70 Gy并不能相應(yīng)提高療效,說明劑量因素并非影響療效的關(guān)鍵[6]。臨床上,放療結(jié)束后分期相同的患者腫瘤消退程度差距很大,這種差異在很大程度上取決于基因序列上極小的遺傳差異,主要表現(xiàn)在單核苷酸多態(tài)性(SNP)[8]。人群因素是影響基因遺傳多態(tài)性受的一個(gè)重要的因素。相對(duì)于其他地區(qū)的人群,潮汕地區(qū)的人群具有自身獨(dú)特的基因多態(tài)性。
PCTH1是HH(Hedgehog)信號(hào)傳導(dǎo)途徑上的一個(gè)重要基因。有研究表明,HH在多種腫瘤的發(fā)生、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用[7]。而功能性PTCH1等位基因的沉默是HH通路激活和腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵,正常情況下,PTCH1基因?qū)MO(Smoothened)具有抑制作用,因此,有學(xué)者認(rèn)為PTCH1是一種抑癌基因。陳振華等[5]的研究表明:PTCH1基因與食管癌的發(fā)生及惡性程度有關(guān),但對(duì)于該基因與放療敏感性關(guān)系研究極少;蔣曉東等研究PTCH1基因在食管癌患者中均有非同義變異,發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)的2個(gè)SNP位rs199476092和rs202111971位點(diǎn)能影響PTCH1基因功能,啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞的分化和增殖,導(dǎo)致食管癌患者產(chǎn)生放射抗拒性,致其放療療效較差。但其研究?jī)H有22例,樣本量比較小,而且放療采用單純放療,不是目前標(biāo)準(zhǔn)的同步放化療。
本研究針對(duì)潮汕人群的PTCH1基因多態(tài)性與食管癌放療效果的相關(guān)性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示105例食管鱗癌患者中有98例能成功擴(kuò)增并測(cè)序PTCH1基因位點(diǎn)。98例患者全組放療近期有效率為83.7%,進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析顯示,PTCH1在98例患者中均有突變,其中rs199476092和rs202111971突變位點(diǎn)僅見于放射抗拒組。而且PTCHl基因的表達(dá)與患者性別、食管癌分期、年齡、吸煙情況、酗酒均無關(guān),與腫瘤的分化程度(高中分化、低分化)有關(guān),高中分化的食管癌組織中PTCHl表達(dá)量4.86(4.24±1.42)低于低分化腫瘤中PTCHl基因的表達(dá)量5.59(4.64±2.55),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PTCH1編碼區(qū)內(nèi)rs199476092和rs202111971突變位點(diǎn)與食管鱗癌患者的放射敏感性密切相關(guān),可能是放療抗拒的預(yù)測(cè)指標(biāo),這將對(duì)指導(dǎo)患者個(gè)體化治療具有重要意義。