紀(jì)小志

（徐州市中醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 江蘇 徐州 221009）

亞洲胃癌發(fā)病率高，是已知所有癌癥致死的第二大病因[1]。很多患者在早期并未感到明顯不適，部分可無(wú)任何癥狀，而確診時(shí)已達(dá)晚期。胃癌的發(fā)生與環(huán)境、食品污染、幽門螺桿菌感染等多種因素有關(guān)[2]。雖然這些年在診斷、手術(shù)、化療和放療等手段上取得了極大進(jìn)步，但預(yù)后仍然很差。很多因素影響其預(yù)后，其中最主要的當(dāng)屬TNM分期及組織分型。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，基因在腫瘤的發(fā)病及進(jìn)展中起到的影響越來(lái)越大，探討基因影響胃癌的分子機(jī)制，對(duì)胃癌的前期診察及預(yù)后判斷、靶向藥物的研發(fā)有著重要意義。本文以自噬相關(guān)蛋白（mammals rapamycin target protein, mTOR）為研究對(duì)象，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胃癌及癌旁細(xì)胞中mTOR的表達(dá)，分析其與臨床病理因數(shù)的關(guān)系及其臨床應(yīng)用的價(jià)值，為胃組織癌癥的診斷、個(gè)體化治療及預(yù)后評(píng)估提供相關(guān)參考依據(jù)。

1.資料與方法

1.1 一般資料

以江蘇省腫瘤醫(yī)院2013年1月—12月收治胃癌患者的術(shù)后組織標(biāo)本為研究對(duì)象，包括胃癌的標(biāo)本蠟塊145例，癌旁的標(biāo)本蠟塊50例。其中男性112例，女性33例，年齡30～80歲。根據(jù)2010版TNM進(jìn)行分期，符合Ⅰ、Ⅱ期的標(biāo)本59例，符合Ⅲ期的標(biāo)本86例。入選標(biāo)準(zhǔn)：入選患者均未行化療、放療，術(shù)前被相關(guān)檢查診斷為胃癌，在本院行規(guī)范化胃癌切除治療，臨床病例資料完整，病理診斷明確。剔除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后病理為胃肉瘤、淋巴瘤及繼發(fā)性腫瘤等其他組織來(lái)源的腫瘤。遵循相關(guān)的法規(guī)，患者均已對(duì)本研究知情同意。

1.2 主要試劑與方法

兔抗人mTOR單抗，工作濃度為1∶300。SP試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺呈色試劑。采取二步法免疫組化方法，按試劑盒說(shuō)明步驟對(duì)胃癌組織切片進(jìn)行免疫化學(xué)染色。標(biāo)本蠟塊切片厚度為4μm，70℃烘烤1 h，切片脫蠟至水，組織修復(fù)采用高壓法，切片放入乙二胺四乙酸，pH標(biāo)準(zhǔn)溶液中修復(fù)，磷酸緩沖鹽液洗滌3 min×3次，加一抗，4度冰箱孵育過(guò)夜，復(fù)溫20 min，加二抗，37℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，分化，返藍(lán)，干燥后封片，顯微鏡下觀察。以公司供應(yīng)的陽(yáng)性切片為陽(yáng)性對(duì)照，磷酸緩沖鹽液取代一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 染色特征及結(jié)果判定

由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生在100倍、400倍下觀察mTOR蛋白在胞質(zhì)中的表達(dá)，以觀察到黃褐色顆粒為陽(yáng)性染色。按照染色深淺分為：0分為細(xì)胞不顯色；1分為淺黃色；2分為黃色；3分為黃褐色。依照陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)所占比重分為：0分（＜5%），1分（5%～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%）和4分（76%～100%）；通過(guò)將陽(yáng)性細(xì)胞百分比的得分乘以強(qiáng)度分?jǐn)?shù)（0～12）計(jì)算免疫反應(yīng)得分。最終得分為：-（0分，陰性）；+（1～4分，弱陽(yáng)性）；++（5～8分，陽(yáng)性）；+++（9～12分，強(qiáng)陽(yáng)性）。在觀察中，-～+被認(rèn)為是低表達(dá)，++～+++被認(rèn)為是高表達(dá)。

1.4 隨訪

電話或門診復(fù)查等方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，跟蹤隨訪從術(shù)后病理確診日期開始，截至2017年3月31日，無(wú)一例失訪。生存分析的終點(diǎn)事件總生存期（OS），是指從確診截至死亡或隨訪停止的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用（±s）表示，行t檢驗(yàn)，生存分析使用了卡普蘭-梅爾分析方法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 mTOR在標(biāo)本中的表達(dá)情況

mTOR蛋白在胃癌中的陽(yáng)性表達(dá)占比為93.10%，在癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)占比為40.0%，mTOR在胃癌中的表達(dá)顯著高于癌旁組織（P＜0.05。

表1 mTOR在所有病例標(biāo)本中的總體表達(dá)情況[n（%）]

2.2 mTOR高表達(dá)率與各臨床影響因素的關(guān)聯(lián)

145例組織標(biāo)本中，135例（93.10%）mTOR呈陽(yáng)性染色，其中89例mTOR出現(xiàn)高表達(dá)，46例出現(xiàn)低表達(dá)，另外10例未見mTOR陽(yáng)性著色。mTOR高表達(dá)與胃癌的分化程度、脈管侵占顯著相關(guān)（P＜0.05），和性別、年齡、發(fā)生部位、Lauren分型、浸潤(rùn)深度、N分期、TNM分期、復(fù)發(fā)、生存狀況無(wú)顯著相關(guān)（P＞0.05），見表2。

表2 mTOR在各相關(guān)臨床影響因素中的高表達(dá)情況

表2（續(xù)）

2.3 mTOR表達(dá)與患者生存的關(guān)系

跟蹤調(diào)查截至2017年3月31日，145例患者無(wú)一失訪。58例患者呈現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，包括20例mTOR陰性患者和38例mTOR陽(yáng)性患者。44例出現(xiàn)死亡，其中17例為mTOR低表達(dá)，27例為mTOR高表達(dá)。因此，mTOR蛋白表達(dá)與和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及生存狀況無(wú)顯著相關(guān)（P＞0.05）?？ㄆ仗m-梅爾生存分析顯示，mTOR低表達(dá)組、高表達(dá)組的平均生存時(shí)間分別是41.2月（95%CI：37.5～44.9月）和42.5月（95%CI：39.8～45.2月），兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.849），見表3。

表3 mTOR在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和死亡中的表達(dá)情況[n（%）]

3.討論

全球胃癌每年新發(fā)100余萬(wàn)例，死亡70萬(wàn)例，其中40%以上的胃癌患者來(lái)自中國(guó)，如此高的發(fā)病和死亡率，嚴(yán)重威脅人類健康。胃癌是一種高度異質(zhì)性疾病，精準(zhǔn)化及個(gè)體化的治療才能有效的延長(zhǎng)生存期，為延長(zhǎng)患者的生存，應(yīng)全方位考慮抗腫瘤的治療策略。隨著治療水平的不斷進(jìn)步，胃癌患者的生存機(jī)會(huì)也有所提高，但仍有30%～40%患者因耐藥出現(xiàn)病情進(jìn)展，這類患者結(jié)局很差，5年生存率較低。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)為胃癌患者進(jìn)行針對(duì)性治療提供更為有效的手段迫在眉睫。

自噬是細(xì)胞自我清理的過(guò)程，是細(xì)胞的自身保護(hù)手段。自噬功能紊亂與許多病理改變相關(guān)，包括惡性腫瘤增生、感染、自身免疫等疾病情形。與自噬相關(guān)的mTOR是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，處于PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的下端。mTOR能察覺胞質(zhì)中的內(nèi)外環(huán)境的變化，調(diào)控相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，在控制細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝方面起到重要作用。mTOR在某些腫瘤中活性增高，在肺、胃、大腸、子宮內(nèi)膜等部位的惡性腫瘤中，均可出現(xiàn)mTOR的高表達(dá)和持續(xù)活化。研究表明，mTOR在胃癌中的表達(dá)比例約為36.5%～60.8%[3-4],且與部分臨床病理因素密切相關(guān)。胃癌中mTOR陽(yáng)性表達(dá)與分化水平、淋巴轉(zhuǎn)移、病理分期關(guān)系緊密。在出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移的胃癌患者中，腫瘤組織中的mTOR表達(dá)異常升高，晚期患者中的p-mTOR蛋白陽(yáng)性表達(dá)亦異常升高[5]，表明mTOR在胃癌組織中具有促進(jìn)淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的潛能。在早期的研究中發(fā)覺，mTOR在胃癌中表達(dá)水平明顯高于在癌旁組織中，胃癌中mTOR的陽(yáng)性呈現(xiàn)與分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、病理分期有關(guān)，和性別、年齡、浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)[5]。在我們的研究中亦發(fā)現(xiàn)，mTOR蛋白在胃癌中的表達(dá)要顯著高于癌旁組織中，和之前的研究結(jié)果一致。mTOR蛋白表達(dá)與胃癌的分化程度、脈管侵占密切相關(guān)，和性別、年齡、瘤體發(fā)生部位、Lauren分型、浸潤(rùn)深度、T分期、N分期、有無(wú)復(fù)發(fā)、臨床分期、生存狀態(tài)無(wú)關(guān)?？ㄆ仗m-梅爾生存分析顯示，mTOR低表達(dá)組、高表達(dá)組的平均生存時(shí)間無(wú)差異。與文獻(xiàn)報(bào)道存在差異，可能與腫瘤異質(zhì)性、實(shí)驗(yàn)誤差、樣本量較小有關(guān)。mTOR在胃癌組織中表達(dá)明顯增強(qiáng)，可作為檢測(cè)胃癌的生物標(biāo)志，為胃癌診療的靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。本研究成果說(shuō)明，胃癌組織中mTOR蛋白異?；钴S，表明mTOR基因的出現(xiàn)可能促進(jìn)了癌細(xì)胞的侵襲、生長(zhǎng)和分化。因此，我們推測(cè)mTOR可能參與了胃癌的形成和發(fā)展，可能成為胃癌的重要靶向蛋白，并有望成為評(píng)估胃癌預(yù)后的指標(biāo)之一。

綜上所述，mTOR在胃癌組織中表達(dá)明顯增強(qiáng)，且與胃癌的分化程度、脈管侵占相關(guān)，因此可成為推測(cè)患者預(yù)后結(jié)局的重要指標(biāo)，并有可能成為此類惡性腫瘤新的診療靶點(diǎn)。