蘇宏娜，李學(xué)學(xué)，張紹山，孔苑琳，譚 玲，趙雪蓮，李奕松，李 進(jìn)，陳仕勇，劉 圓

1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610225

2.四川省羌彝藥用資源保護(hù)與利用技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610225

3.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610225

4.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610225

5.西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院，四川 成都 610225

滇桂艾納香作為廣西壯醫(yī)中的常用藥材，具有活絡(luò)經(jīng)血、祛風(fēng)除濕、止血、利尿等功效，用于治療經(jīng)期不準(zhǔn)、產(chǎn)后大出血、不孕癥、陰瘡、風(fēng)濕骨痛等癥狀[1-3]?！稄V西省藥材標(biāo)準(zhǔn)（第2 冊(cè)）》1996年版、《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2009年版收載假東風(fēng)草Blumea riparia(Bl.) DC.作為滇桂艾納香的基原植物，別名白花九里明、華艾納香等。課題組實(shí)地考察中發(fā)現(xiàn)和文獻(xiàn)記載的“大花種”—東風(fēng)草B.megacephala(Randeria) Chang et Tseng，別名大頭艾納香、管芽，在廣西壯醫(yī)中也常作為滇桂艾納香使用[4-6]。假東風(fēng)草（小花種）和東風(fēng)草（大花種）均為攀援狀草質(zhì)藤本，依靠形態(tài)特征難以區(qū)分。林雀躍等[7]對(duì)假東風(fēng)草和東風(fēng)草的品種、資源分布等進(jìn)行了系統(tǒng)梳理和調(diào)查，發(fā)現(xiàn)假東風(fēng)草于1836年[1]被正式命名，而東風(fēng)草于1974年[1]被命名并作為假東風(fēng)草的變種，后來(lái)的研究中將二者分列為同屬不同種植物，但仍有學(xué)者認(rèn)為二者為一個(gè)植物種。

近年來(lái)，SCoT 分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展迅速并應(yīng)用于藥用植物的遺傳多樣性研究，評(píng)價(jià)藥用植物種內(nèi)、種間的遺傳多樣性以及親緣關(guān)系，對(duì)藥用植物的種質(zhì)資源保護(hù)、分子育種等方面有重要的價(jià)值；其具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性和重復(fù)性好、多態(tài)性高、遺傳信息豐富等優(yōu)點(diǎn)[8-10]。目前，利用SCoT 分子標(biāo)記對(duì)假東風(fēng)草和東風(fēng)草的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬采用SCoT 分子標(biāo)記研究假東風(fēng)草（小花種）和東風(fēng)草（大花種）的親緣關(guān)系，建立2 個(gè)品種的DNA指紋圖譜，為快速、準(zhǔn)確鑒別壯藥材滇桂艾納香的2 個(gè)?；煜参锛贃|風(fēng)草和東風(fēng)草提供分子鑒定方法，為后續(xù)種質(zhì)資源鑒定提供新的技術(shù)參考，也為滇桂艾納香藥材的開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)保障。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

假東風(fēng)草（小花種）和東風(fēng)草（大花種）均由課題組自采于廣西百色市、南寧市，經(jīng)西南民族大學(xué)劉圓教授、李瑩副教授鑒定為假東風(fēng)草B.riparia(Bl.) DC.和東風(fēng)草B.megacephala(Randeria) Chang et Tseng，標(biāo)本現(xiàn)存于西南民族大學(xué)民族藥材標(biāo)本館，采集信息見(jiàn)表1。

Plant Genomic DNA Kit 植物基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）#S7412（天根生化科技北京有限公司），EDTA 2Na（Siker）和GEL RED 核酸染料（擎科），2×Es Taq Master Mix（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。

1.2 儀器

SCIENTZ-48 高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）、Fresco 17 冷凍高速離心機(jī)（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司）、超微量分光光度計(jì)（thermo scientific 公司）、T100TMPCR 儀（BIO-RAD 公司）、DYY-6C 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、Uhiversal hood II 凝膠成像分體系統(tǒng)儀（BIO-RAD 公司）。

2 方法

2.1 DNA 提取及濃度測(cè)定

取于液氮冷凍存貯的假東風(fēng)草（小花種）和東風(fēng)草（大花種）樣品，剪碎，加液氮研磨，DNA 的提取參照DNA 提取試劑盒操作說(shuō)明書。提取后對(duì)樣品DNA 進(jìn)行核酸純度及濃度的檢測(cè)，并經(jīng)1.3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，于?20 ℃冰箱中貯藏備用。

2.2 SCoT-PCR 擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為2×Es Taq Master Mix 10 μL，10 μmol/L 引物2 μL，模板DNA 2 μL（約20 ng/μL），ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，退火1 min（不同SCoT引物的Tm值不同），72 ℃延伸1.5 min，徹底延伸10 min，共35 個(gè)循環(huán)。取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，用GelRed核酸染料染色，點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠上，在1×TAE 緩沖液中電泳80 min（120 V，400 mA）后攝取擴(kuò)增圖譜。

2.3 數(shù)據(jù)處理

選取條帶清晰且多態(tài)性好的圖譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在同一遷移位置上，有條帶記為“1”，無(wú)條帶記為“0”，在Excel 表中建立1，0 矩陣，參考文獻(xiàn)方法[10-13]構(gòu)建假東風(fēng)草和東風(fēng)草的DNA 指紋圖譜。利用軟件DCFA1.1 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入POPGENE 32中計(jì)算多態(tài)性條帶百分比（PPB）。利用NTSYS-pc 2.10e 軟件進(jìn)行品種間的Dice 遺傳相似性系數(shù)分析，并利用非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）進(jìn)行聚類分析[14-17]，構(gòu)建假東風(fēng)草和東風(fēng)草聚類樹(shù)狀圖。利用SPSS20.0 軟件對(duì)假東風(fēng)草和東風(fēng)草進(jìn)行主成分分析[18-19]，構(gòu)建假東風(fēng)草和東風(fēng)草的主成分分析圖。利用多態(tài)性最好的SCoT 引物構(gòu)建指紋圖譜。利用NTSYS-pc 2.1 分子進(jìn)化軟件計(jì)算假東風(fēng)草和東風(fēng)草的遺傳距離，利用在線經(jīng)緯度距離計(jì)算器（http://www.ab126.com/Geography/1883.html）計(jì)算假東風(fēng)草和東風(fēng)草的地理距離。利用R 語(yǔ)言進(jìn)行Mantel test 分析[20-21]，對(duì)假東風(fēng)草和東風(fēng)草的遺傳距離和地理距離進(jìn)行spearman 相關(guān)性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA 純度及濃度檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)檢測(cè)，所有樣品提取的DNA 的A260nm/A280nm在1.8～2.0，A260nm/A230nm在1.8～2.3，說(shuō)明所有樣品DNA 純度達(dá)到檢測(cè)要求。提取的DNA 質(zhì)量濃度在23.7～256.9 ng/μL，用去離子水稀釋至10 ng/μL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 SCoT 標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性分析

從23 條SCoT 引物中共篩選出11 條（表2）適合于30 個(gè)樣本的SCoT-PCR 擴(kuò)增，其電泳圖見(jiàn)圖1。用11 條SCoT 引物擴(kuò)增30 個(gè)樣本，共獲得213條譜帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出19.4 條譜帶，其中多態(tài)性譜帶209 條，比率為97.5%，表明假東風(fēng)草（小花種）和東風(fēng)草（大花種）的遺傳多樣性比較豐富。

表2 SCoT 引物序列Table 2 Primer information of SCoT

圖1 假東風(fēng)草 (小花種) 和東風(fēng)草 (大花種) SCoT19 DNA 電泳圖Fig.1 SCoT19 DNA electrophoresis of B.riparia (small flower species) and B.megacephala (big flower species)

3.3 SCoT 標(biāo)記UPGMA 聚類分析

按照電泳圖譜中同一位置上條帶的有無(wú)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有記錄為“1”，無(wú)記為“0”，形成Excel 數(shù)據(jù)矩陣。利用NTSYS-pc 2.1 分子進(jìn)化軟件對(duì)假東風(fēng)草（小花種）和東風(fēng)草（大花種）的遺傳相似度進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，當(dāng)遺傳相似性系數(shù)為0.418 時(shí)，假東風(fēng)草（1～10）單獨(dú)成一支，且遺傳性相似度為0.64，表明假東風(fēng)草（小花種）遺傳基礎(chǔ)較窄，基因多樣性較低；東風(fēng)草（20～30）聚為一支，遺傳相似度為0.49，東風(fēng)草（11～19）聚為一支，遺傳相似度為0.41，表明東風(fēng)草（大花種）基因多樣性較高，種內(nèi)變異較大，遺傳基礎(chǔ)較寬泛。當(dāng)遺傳相似性系數(shù)為0.479 時(shí)，可以看出假東風(fēng)草（1～10）與東風(fēng)草（20～30）聚為一支，說(shuō)明假東風(fēng)草（1～10）與東風(fēng)草（20～30）遺傳基礎(chǔ)具有一定的相似性，說(shuō)明部分學(xué)者認(rèn)為的東風(fēng)草作為假東風(fēng)草的一個(gè)變種具有一定依據(jù)，但實(shí)際從分子水平來(lái)看假東風(fēng)草（1～10）和東風(fēng)草（20～30）遺傳相似系數(shù)僅為0.479，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說(shuō)明傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)鑒別具有一定的局限性。假東風(fēng)草和東風(fēng)草的遺傳相似度圖見(jiàn)圖2。

圖2 假東風(fēng)草 (小花種) 和東風(fēng)草 (大花種) UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA clustering graph of B.riparia (small flower species) and B.megacephala (big flower species)

3.4 SCoT 標(biāo)記主成分分析

將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SPSS 20.0 軟件上對(duì)不同樣本進(jìn)行主成分分析，以特征值≥1 為原則提取2 個(gè)主成分，且累積貢獻(xiàn)率達(dá)到87.59%，基本可以客觀反映假東風(fēng)草和東風(fēng)草的樣本信息。以主成分2 為縱 坐標(biāo)，主成分1 為橫坐標(biāo)所形成的假東風(fēng)草和東風(fēng)草的位置分布如圖3 所示。主成分分析結(jié)果表明可以區(qū)分假東風(fēng)草和東風(fēng)草，30 個(gè)假東風(fēng)草和東風(fēng)草樣本被分為2 類。1～10 號(hào)樣本為一類，均為假東風(fēng)草；11～30 號(hào)樣本為一類，均為東風(fēng)草；在第2大類東風(fēng)草中又可以分為2 小類，11～19 號(hào)樣本為一小類，20～30 號(hào)樣本為一小類，主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果相吻合，主成分分析結(jié)果更直觀地表明了假東風(fēng)草和東風(fēng)草之間的親緣關(guān)系，是對(duì)聚類結(jié)果的直觀解釋和佐證。

圖3 假東風(fēng)草 (小花種) 和東風(fēng)草 (大花種) 主成分分析圖Fig.3 PCA clustering graph of B.riparia (small flower species) and B.megacephala (large flower species)

3.5 假東風(fēng)草和東風(fēng)草DNA 指紋圖譜構(gòu)建

從篩選的11 條SCoT 引物中選擇多態(tài)性最好的引物SCoT3 構(gòu)建30 份假東風(fēng)草和東風(fēng)草DNA指紋圖譜，見(jiàn)圖4。由圖可知該引物可鑒別所有假東風(fēng)草和東風(fēng)草的DNA 樣品，因此，可利用SCoT3 引物對(duì)待測(cè)的假東風(fēng)草和東風(fēng)草進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，比對(duì)供試品的多態(tài)性與構(gòu)建的DNA 指紋圖譜，從而區(qū)分鑒定假東風(fēng)草和東風(fēng)草。

圖4 假東風(fēng)草 (小花種) 和東風(fēng)草 (大花種) DNA 指紋圖譜Fig.4 DNA fingerprint map of B.riparia (small flower species) and B.megacephala (big flower species)

3.6 種間遺傳距離與地理距離相關(guān)性分析

利用NTSYS-pc 2.1 分子進(jìn)化軟件對(duì)假東風(fēng)草和東風(fēng)草的遺傳距離進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用在線經(jīng)緯度距離計(jì)算器（http://www.ab126.com/Geography/ 1883.html）計(jì)算假東風(fēng)草和東風(fēng)草的地理距離，假東風(fēng)草和東風(fēng)草遺傳距離、地理距離見(jiàn)表3。遺傳距離和地理距離的范圍分別為0.146 0～1.350 8 和0.010 7～285.978 9 km，其中遺傳距離最大值出現(xiàn)在8 號(hào)假東風(fēng)草和17 號(hào)東風(fēng)草之間，最小值出現(xiàn)在4 號(hào)假東風(fēng)草和28 號(hào)東風(fēng)草之間；地理距離最大值出現(xiàn)在4 號(hào)假東風(fēng)草和11 號(hào)東風(fēng)草之間，最小值出現(xiàn)在19 號(hào)東風(fēng)草和23 號(hào)東風(fēng)草之間。利用R 語(yǔ)言對(duì)假東風(fēng)草和東風(fēng)草的遺傳距離和地理距離進(jìn)行Mantel test 分析，permutations 設(shè)置為99 次，結(jié)果顯示遺傳距離與地理距離呈顯著相關(guān)性（r＝0.392 9，P＝0.01）。

表3 遺傳距離和地理距離Table 3 Genetic distance and geographic distance

4 討論

SCoT 分子標(biāo)記是一種新開(kāi)發(fā)的基于植物基因中的翻譯起始位點(diǎn)（ATG）側(cè)翼保守序列的單引物分子標(biāo)記，目前已廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究[16-17,20-23]。程印虎等[10]利用SCoT 分子標(biāo)記對(duì)陜西產(chǎn)重樓屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，在相似系數(shù)為0.80 時(shí)，6 個(gè)類群重樓可以分為2 個(gè)類群，6 個(gè)類群重樓屬植物在物種水平上具有較高的遺傳多樣性。陳大霞等[8]基于ISSR、SCoT、SRAP 標(biāo)記對(duì)川續(xù)斷屬藥用植物親緣關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，分子標(biāo)記揭示的結(jié)果與形態(tài)標(biāo)記分類也有一定差異，峨眉續(xù)斷與其原變種川續(xù)斷在生境、繁殖方式及葉片形態(tài)上均有較大差異，二者之間的親緣關(guān)系值得進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)SCoT 對(duì)假東風(fēng)草（小花種）和東風(fēng)草（大花種）的遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，在遺傳相似度為0.418 時(shí)，假東風(fēng)草（小花種）和東風(fēng)草（大花種）被分為2 類，但部分東風(fēng)草（大花種）和假東風(fēng)草（小花種）遺傳距離較近，植物形態(tài)有差異，二者之間的親緣關(guān)系需要進(jìn)一步探索和研究。

滇桂艾納香是壯族常用的特色藥材，目前廣西省及湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)只收錄了假東風(fēng)草（小花種）作為其來(lái)源。隨著滇桂艾納香藥材資源的開(kāi)發(fā)，假東風(fēng)草（小花）野外資源形式不宜樂(lè)觀，且因東風(fēng)草（大花種）在外觀形態(tài)和藥用價(jià)值與其具有一定的相似性，因此常出現(xiàn)將二者混淆的情況。本研究對(duì)實(shí)地收集的30 份假東風(fēng)草和東風(fēng)草資源進(jìn)行SCoT-PCR 擴(kuò)增，首次從分子水平建立了鑒別該2個(gè)易混淆品種的方法。本研究篩選的11 條SCoT 引物在假東風(fēng)草（小花種）和東風(fēng)草（大花種）中具有較高的多態(tài)性，平均多態(tài)性比率為98.12%，高于該方法研究地黃種質(zhì)資源[21]和射干、川射干藥材分子鑒別[24]的多態(tài)性百分比。

根據(jù)UPGMA 聚類分析結(jié)果，Dice 遺傳相似性系數(shù)在0.421 處可將30 個(gè)樣本分為3 大類，其中第I 類為假東風(fēng)草，第II 類與第III 類均為東風(fēng)草，可以將2 個(gè)品種區(qū)分開(kāi)；根據(jù)主成分分析結(jié)果顯示可以將30 個(gè)樣本區(qū)分為2 大類，其中東風(fēng)草又可細(xì)分為2 類，主成分分析結(jié)果與聚類結(jié)果一致。東風(fēng)草存在有2 個(gè)分支，推測(cè)可能是由于在分化、進(jìn)化過(guò)程中，東風(fēng)草逐漸有分化出一個(gè)亞種的趨勢(shì)。建議后續(xù)收集數(shù)量更多、分布范圍更廣的假東風(fēng)草（小花種）和東風(fēng)草（大花種）的種質(zhì)資源，對(duì)其分化和進(jìn)化過(guò)程進(jìn)行更進(jìn)一步研究，以期對(duì)假東風(fēng)草（小花種）和東風(fēng)草（大花種）的植物學(xué)分類做出分子水平的解釋和參考。

根據(jù)本研究中SCoT3 引物構(gòu)建的DNA 指紋圖譜，可以區(qū)分30 份假東風(fēng)草（小花種）、東風(fēng)草（大花種），因此SCoT 分子標(biāo)記可以在區(qū)分假東風(fēng)草（小花種）和東風(fēng)草（大花種）有效應(yīng)用，可以達(dá)到快速、準(zhǔn)確的區(qū)分假東風(fēng)草（小花種）和東風(fēng)草（大花種）的目的。假東風(fēng)草（小花種）和東風(fēng)草（大花種）為2 個(gè)同屬獨(dú)立的品種。此外，目前地方標(biāo)準(zhǔn)僅收載了假東風(fēng)草作為滇桂艾納香藥材的植物來(lái)源，但實(shí)際壯醫(yī)臨床使用有假東風(fēng)草（小花種）和東風(fēng)草（大花種）2 個(gè)基原。建議進(jìn)一步開(kāi)展假東風(fēng)草（小花種）和東風(fēng)草（大花種）藥效一致性評(píng)價(jià)等相關(guān)研究，探討制藥企業(yè)是否能夠?qū)|風(fēng)草（大花種）納入滇桂艾納香新的基原植物，擴(kuò)大藥源，保證人民的用藥安全，同時(shí)緩解假東風(fēng)草（小花種）的藥用資源不足的問(wèn)題。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突