陳文杰，胡耀廷，王如鋒,3,4*，趙淑娟,3,4*，王崢濤,3,4

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海 201203

2.中藥新資源與品質(zhì)評(píng)價(jià)國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室，上海 201203

3.中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203

4.上海市中藥復(fù)方重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203

以蟾酥為代表的蟾蜍類藥材是一類傳統(tǒng)動(dòng)物藥[1-5]，藥用歷史悠久，市場(chǎng)需求量大。隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)蟾蜍類藥材研究的深入，發(fā)現(xiàn)其所含蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分在強(qiáng)心、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗病毒、抗輻射、鎮(zhèn)咳、利尿、調(diào)節(jié)免疫等多方面具有顯著的藥理活性[1,6-8]，臨床上廣泛應(yīng)用于冠心病、心臟病等相關(guān)疾病的治療[1]。例如，在麝香保心丸中，臣藥蟾酥在治療心肌缺血引起的心絞痛、胸悶、心肌梗死以及冠心病中發(fā)揮了重要的作用[9-12]。

目前，蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的獲取主要從蟾酥等蟾蜍類藥材中直接提取[1,13]，該方法成本高、收益低。隨著醫(yī)藥及研發(fā)需求的日益增長(zhǎng)，蟾蜍類藥材的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，需要充足的藥用資源作為支撐，僅僅依靠現(xiàn)有的天然蟾蜍資源，必然會(huì)導(dǎo)致蟾蜍野生物種衰退甚至滅絕，嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境平衡。通過(guò)人工規(guī)?；B(yǎng)殖蟾蜍，不僅需要一定的生長(zhǎng)周期，而且還要面臨產(chǎn)品純化難、品種退化及重金屬污染等諸多問(wèn)題[14-16]。一直以來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)蟾酥的研究主要集中在化學(xué)成分和藥理作用[1,17]，而解決其藥用資源短缺難題的研究相對(duì)較少。近年來(lái)，中藥活性成分的生物合成在保護(hù)中藥資源方面發(fā)揮起越來(lái)越要的作用[18]?；诤铣缮飳W(xué)原理，設(shè)計(jì)和改造微生物菌株生產(chǎn)天然產(chǎn)物的方法已被廣泛認(rèn)可，該方法的應(yīng)用需要建立在目標(biāo)產(chǎn)物生物合成途徑完全解析的基礎(chǔ)之上[19-22]。本文全面總結(jié)了蟾酥中主要蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分及其相互間的生物轉(zhuǎn)化關(guān)系，系統(tǒng)回顧了蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分生物合成途徑解析進(jìn)展及其生物轉(zhuǎn)化應(yīng)用，并進(jìn)一步討論了蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分生物合成的發(fā)展前景。

1 蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分結(jié)構(gòu)分類

蟾蜍內(nèi)酯類是珍稀中藥蟾酥的主要活性成分，為中華大蟾蜍Bufo gararizansCantor 或黑眶蟾蜍B.melanostictusSchneider 的次生代謝產(chǎn)物。蟾蜍內(nèi)酯類成分主要分為兩類，即蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類（bufadienolides）和20,21-環(huán)氧蟾蜍內(nèi)酯類[1]。

在新鮮采集的蟾酥中，蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分主要為蟾蜍毒素類化合物，而蟾蜍毒素類化合物又分為蟾毒、蟾毒配基硫酸酯和蟾毒配基脂肪酸酯。而中藥制劑和臨床上使用的是加工炮制過(guò)后的蟾酥制品。鮮蟾酥經(jīng)高溫炮制后，主要成分蟾蜍毒素類化合物會(huì)分解為蟾毒配基類化合物。蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分是一類甾體強(qiáng)心苷，在C-17 位與六元不飽和內(nèi)酯環(huán)（α-吡喃酮環(huán)）相連。根據(jù)配體母核上的取代基的不同，蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分按照其配基上母核取代基的不同分為5 類，分別為蟾毒靈類（I）、脂蟾毒配基類（II）、沙蟾毒精類（III）、假蟾毒精類（IV）、環(huán)氧酯蟾毒配基類（V），母核結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1[1,13,17]。蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的結(jié)構(gòu)特征是A/B 環(huán)順式結(jié)構(gòu)、B/C 環(huán)反式結(jié)構(gòu)和C/D 環(huán)反式結(jié)構(gòu)，同時(shí)還具有諸如3-OH、14β-OH 或14,15-環(huán)氧環(huán)的特征取代基基團(tuán)[17]。

圖1 蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的結(jié)構(gòu)母核Fig.1 Skeletons of bufadienolides

2 蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的生物轉(zhuǎn)化

目前，已分離出142 種蟾蜍內(nèi)酯類化合物，如蟾毒靈（bufalin，1）、酯蟾毒配基（resibufagenin，2）、華蟾毒精（cinobufagin，3）、華蟾毒它靈（cinobufotalin，4）、遠(yuǎn)華蟾毒精（telocinobufagin，5）等。其中蟾毒靈、酯蟾毒配基和華蟾酥毒基作為蟾酥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定的指標(biāo)成分被收錄于《中國(guó)藥典》2020年版。

蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分具有良好的強(qiáng)心、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、消炎等藥理活性[23-24]。游離性蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分水溶性較差，對(duì)人體具有一定毒性[25]。因此，許多研究者嘗試通過(guò)生物轉(zhuǎn)化改變蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分相關(guān)化學(xué)結(jié)構(gòu)，以尋找具有良好生理活性且毒性低的結(jié)構(gòu)新穎的化合物。生物轉(zhuǎn)化（biotransformation）是利用生物體系（細(xì)菌、真菌或植物組織等）或酶為催化劑對(duì)外源性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以實(shí)現(xiàn)化學(xué)轉(zhuǎn)化的生物化學(xué)過(guò)程，具有選擇性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、催化效率高、反應(yīng)類型多、產(chǎn)物成分較為單一、易于分離純化等優(yōu)點(diǎn)，往往可用于有機(jī)合成難以完成的化學(xué)反應(yīng)，易于得到結(jié)構(gòu)新穎的化合物[26]。本文總結(jié)了利用微生物及植物懸浮培養(yǎng)體系對(duì)蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展，生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物見(jiàn)圖2。

圖2 蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的產(chǎn)物Fig.2 Biotransformation products of bufadienolides

2.1 微生物轉(zhuǎn)化

葉敏等[26-28]利用鏈格孢Alternaria alternateAS 3.457 8 對(duì)華蟾毒精（3）進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，分離并鑒定了6 個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中12β-羥基-去乙酰華蟾毒精（12β-hydroxy-desacetylcinobufagin，6）、3-氧代-12β-羥基-華蟾毒精（ 3-oxo-12β-hydroxy- cinobufagin，7）、3-氧代-12β-羥基-去乙酰華蟾毒精（3-oxo-12β-hydroxy-desacetylcinobufagin，8）、12-氧代-華蟾毒精（12-oxo-cinobufagin，9）和3-氧代- 12α-羥基華蟾毒精（3-oxo-12α-hydroxycinobufagin，10）為新化合物，主要的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)為12β-羥基化、3-OH 脫氫和16-位脫乙酰基。該轉(zhuǎn)化過(guò)程的動(dòng)態(tài)考察結(jié)果顯示，華蟾毒精的轉(zhuǎn)化順序?yàn)槿A蟾毒精先全部轉(zhuǎn)化為12β-羥基-華蟾毒精，然后發(fā)生了3-OH 脫氫反應(yīng)，最后是16-位脫乙?；磻?yīng)[26]。銅綠假單孢菌Pseudomonas aeruginosaAS 1.860 對(duì)華蟾毒精（3）表現(xiàn)出特異性的3-OH 脫氫作用[26,29]。刺囊毛霉Mucor spinosusAS 3.3450 對(duì)蟾毒靈（1）的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，分離并鑒定了12 個(gè)產(chǎn)物，其中7β-羥基-蟾毒靈（7β-hydroxy-bufalin，11）、11β-羥基蟾毒靈（11β-hydroxybufalin，12）、16α-羥基-蟾毒靈（16α-hydroxy-bufalin，13）、7β,16α-二羥基-蟾毒靈（7β,16α-dihydroxy-bufalin，14）、1β,7β-二羥基-蟾毒靈（1β,7β-dihydroxy-bufalin，15）、1β,12β-二羥基-蟾毒靈（1β,12β-dihydroxy-bufalin，16）和3-表-7β-羥基-蟾毒靈（3-epi-7β-hydroxy-bufalin，17）為新化合物，主要的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)為7β-、12β- 和16α-位羥基化[26,30-31]。細(xì)孢毛霉Mucor subtilissimusAS 3.2454 對(duì)酯蟾毒配基（2）的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，分離并鑒定了7 個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，主要的轉(zhuǎn)化反應(yīng)是1β-、11β-、12β- 和16α-位羥基化，產(chǎn)物中包括了單羥基化、雙羥基化和糖苷化化合物[26]。絲狀真菌Mucor polymorphosporus生物轉(zhuǎn)化酯蟾毒配基（2）共獲得22 種產(chǎn)物，其中3-表-7β-羥基-酯蟾毒配基（3-epi- 7β-hydroxy-resibufogenin，18）、5β,7β-二羥基-酯蟾毒配基（5β,7β-dihydroxy-resibufogenin，19）、7α-羥基- 酯蟾毒配基（7α-hydroxy-resibufogenin，20）、3-表- 12β- 羥基-酯蟾毒配基（ 3-epi-12β-hydroxy- resibufogenin，21）、5β,12β-二羥基-酯蟾毒配基（5β,12β-dihydroxy-resibufogenin，22）、3-表-12α-羥基-酯蟾毒配基（3-epi-12α-hydroxy-resibufogenin，23）、5β,12α-二羥基-酯蟾毒配基（5β,12α-dihydroxy- resibufogenin，24）、1β,12α-二羥基-酯蟾毒配基（1β,12α-dihydroxy-resibufogenin，25）、3-氧代-12α-羥基-酯蟾毒配基（3-oxo-12α-hydroxy-resibufogenin，26）、12-氧代-酯蟾毒配基（12-oxo-resibufogenin，27）、3-表-16β-羥基-酯蟾毒配基（3-epi-16β-hydroxy- resibufogenin，28）、7β,16α-二羥基-酯蟾毒配基（7β, 16α-dihydroxy-resibufogenin，29）、12β,16α-二羥基-酯蟾毒配基（12β,16α-dihydroxy-resibufogenin，30）、1β,16α-二 羥 基-酯蟾毒配基（1β,16α-dihydroxy- resibufogenin，31）及12α,16α-二羥基-酯蟾毒配基（12α,16α-dihydroxy-resibufogenin，32）為新化合物[32]。轉(zhuǎn)化反應(yīng)涉及1β-、C-5、7α-、7β-、12α-、12β- 和16α-位的羥基化以及3-OH 的差向異構(gòu)化和脫氫化，其中12α-、12β- 和16α-位的羥基化是主要生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)[32]。銅綠假單孢菌對(duì)酯蟾毒配基（2）和12β-羥基-酯蟾毒配基（12β-hydroxy-resibufogenin，33）表現(xiàn)出特異性的3-OH 脫氫作用[26,29]。Fusarium solaniAS 3.1829 菌株對(duì)酯蟾毒配基（2）的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，分離鑒定了5 個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中3-(1,2-二甲基-1,2-乙二醇縮醛)-酯蟾毒配基[3-one-cyclic 3-(1,2-dimethyl-1,2-ethanediylacetal)-resibufogenin，34]、3-二甲氧基-酯蟾毒配基（3-dimethoxyl- resibufogenin，35）和3-表-15α-羥基-7βH-蟾毒靈（3-epi-15α-hydroxy-7βH-bufalin，36）為新化合物[33]。Curvularia lunataAS 3.4381 對(duì)酯蟾毒配基（2）的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，分離并鑒定了4 個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中12-氧代-3-表-16β-羥基-酯蟾毒配基（12-oxo-3-epi-16β- hydroxy-resibufogenin，37）和12β,15-環(huán)氧-3-表-蟾毒 靈-14,15-烯（12β,15-epoxy-3-epi-bufalin-14,15- ene，38）為新化合物，觀察到在生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)過(guò)程中存在異構(gòu)化、羥基化和氧化反應(yīng)[34]。由Actinomucor elegansAS 3.277 8 對(duì)酯蟾毒配基（2）進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，分離并鑒定了5 種產(chǎn)物，反應(yīng)中觀察到了高度立體和區(qū)域特異性異構(gòu)化、羥基化和酯化反應(yīng)，產(chǎn)物中3-表-12-氧代-羥基酯蟾毒配基（3-epi-12-oxo-hydroxy-resibufogenin，39）和3α-乙酰氧基-15α-羥基蟾毒靈（3α-acetyloxy-15α-hydroxy- bufalin，40）未見(jiàn)報(bào)道[35]。鏈格孢對(duì)蟾毒它靈（bufotalin，41）的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，分離并鑒定了3種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中12β-羥基-蟾毒它靈（12β-hydroxy- bufotalin，42）和 3-氧代-12β-羥基-蟾毒它靈（3-oxo-12β-hydroxy-bufotalin，43）為新化合物[36]。鏈格孢對(duì)沙蟾毒精（arenobufagin，44）轉(zhuǎn)化得到3個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中 3-氧代-沙蟾毒精（3-oxo- arenobufagin，45）、3-氧代-異沙蟾毒精（3-oxo- bufarenogin，46）為新化合物[37]。鏈格孢對(duì)華蟾毒它靈（4）的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)得到了4 個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中12β-羥基-華蟾毒它靈（12β-hydroxy-cinobufotalin，47）新化合物[37]。革蘭陽(yáng)性菌芽孢桿菌Bacillussp.CMB-TD29 能特異性羥基化南美蟾毒精（marinobufagenin，66），生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)生了11α-、12β-、17-α 3 種新的羥基化衍生物[38]。

2.2 植物懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化

長(zhǎng)春花Catharanthus roseus(L.) G.Don.細(xì)胞培養(yǎng)體系對(duì)華蟾毒精（3）的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)獲得了8個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中5 個(gè)為新化合物，分別為1β-羥基- 去乙酰華蟾毒精（ 1β-hydroxy-desacetyl- cinobufagin，48）、華蟾毒精 3-O-β-D-葡萄糖苷（cinobufagin-3-O-β-D-glucoside，49）、3-氧代-去乙酰華蟾毒精-16-O-β-D-葡萄糖苷（3-oxo-desacetyl- cinobufagin-16-O-β-D- glucoside，50）、去乙酰華蟾毒精-16-O-β-D-葡萄糖苷（desacetyl-cinobufagin- 16-O-β-D-glucoside，51）和3-表-去乙酰華蟾毒精- 16-O-β-D-葡萄糖苷（3-epi-hydroxy-desacetylcinobufagin- 16-O-β-D-glucoside，52）[26,39-40]。長(zhǎng)春花細(xì)胞培養(yǎng)體系能使華蟾毒精（3）的3-OH 和16-OH 發(fā)生糖基化反應(yīng)，證明長(zhǎng)春花細(xì)胞培養(yǎng)體系能特異性糖苷化華蟾毒精，其他轉(zhuǎn)化反應(yīng)還包括C-5、C-1β位羥基化，3-OH 脫氫反應(yīng)及C-16 位脫乙?；磻?yīng)等[26,39-40]。桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.) A.DC.細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系對(duì)華蟾毒精（3）的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)得到了3 個(gè)產(chǎn)物，其中去乙酰華蟾毒它靈（desacetylcinobufotalin，53）為主產(chǎn)物[26,39]。長(zhǎng)春花和桔梗體系對(duì)華蟾毒精（3）的生物轉(zhuǎn)化具有一定的相似性，轉(zhuǎn)化反應(yīng)以C-5 位羥基化和C-16 位脫乙?；鶠橹鱗26,39-40]。桔梗懸浮培養(yǎng)體系對(duì)蟾毒靈（1）的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)得到2 個(gè)產(chǎn)物，分別為3-表-遠(yuǎn)華蟾毒精（3-epi-telocinobufagin，54）和3-表-蟾蜍靈-3-O-β-D-葡萄糖苷（3-epi-bufalin-3-O-β-D-glucoside，55）[41]。銀杏Ginkgo bilobaL.葉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系生物轉(zhuǎn)化酯蟾毒配基（2），轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為3-表-酯蟾毒配基（3-epi-resibufogenin，56）[42]。李莉欣[43]研究結(jié)果顯示，桔梗懸浮培養(yǎng)體系對(duì)酯蟾毒配基（2）的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)得到了4 個(gè)產(chǎn)物，其中1β-羥基-酯蟾毒配基（1β-hydroxy-resibufogenin，57）和3-表-南美蟾毒精（3-epi-marinobufagenin，58）為新化合物。雪蓮Saussurea involucrate(Kar.et Kir.) Sch.-Bip.懸浮細(xì)胞對(duì)蟾毒它靈（41）有較好的生物轉(zhuǎn)化能力，從中分離并鑒定了5 個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中3-表-蟾毒它靈（3-epi-bufotalin，59）、3-表-去乙酰蟾毒它靈（3-epi-desacetylbufotalin，60）、3-表-蟾毒它靈-3-O-β-D-葡萄糖苷（3-epi-bufotalin-3-O-β-D-glucoside，61）和1β-羥基蟾毒它靈（1β-hydroxy-bufotalin，62）為新化合物[37]。雪蓮懸浮細(xì)胞體系對(duì)遠(yuǎn)華蟾毒精（5）的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，分離并鑒定了4 個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，但是轉(zhuǎn)化率較低，可能遠(yuǎn)華蟾毒精水溶性較差以致反應(yīng)不完全[37]。雪蓮懸浮細(xì)胞對(duì)日蟾毒它靈（gamabufotalin，63）的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，分離并鑒定了 4 個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中 3-表-日蟾毒它靈（3-epi-gamabufotalin，64）和3-氧代-Δ1-日蟾毒它靈（3-oxo-Δ1-gamabufotalin，65）為新化合物[37]。

3 蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的生物合成

3.1 蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的生物合成途徑解析進(jìn)展

蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分為乙型強(qiáng)心苷，強(qiáng)心甾類成分為甲型強(qiáng)心苷，它們的區(qū)別為強(qiáng)心苷元C-17位上的不飽和內(nèi)酯環(huán)。蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分為六元不飽和內(nèi)酯環(huán)，強(qiáng)心甾類成分為五元不飽和內(nèi)酯環(huán)。蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類化合物在植物和動(dòng)物體內(nèi)均有，動(dòng)物中主要存在于蟾蜍毒腺內(nèi)。植物體內(nèi)的蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類化合物生物合成途徑與蟾蜍體內(nèi)的并不一致，前者更接近與強(qiáng)心甾的生物合成途徑。與蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類不同，強(qiáng)心甾類成分大多存在于在植物體內(nèi)，如洋地黃類植物。

在洋地黃植物中，強(qiáng)心甾類成分的生物合成途徑：甲羥戊酸→膽固醇→孕烯醇酮→孕酮→強(qiáng)心甾類[44-48]（圖3）。可以為動(dòng)植物中蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的生物合成途徑解析提供一些借鑒。類似的，膽固醇也是植物來(lái)源蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的生物合成前體[49]。后續(xù)其反應(yīng)過(guò)程大致如下：首先是膽固醇的側(cè)鏈發(fā)生斷裂，依次在C-22 位和C-20 位發(fā)生羥基化反應(yīng)，隨后C-20/22 鍵斷裂生成孕烯醇酮，孕烯醇酮氧化生成孕酮，孕酮還原得到3β-羥基- 5β-20-孕酮，最后發(fā)生14β-羥基化反應(yīng)[50-52]。對(duì)于六元不飽和內(nèi)酯環(huán)的形成過(guò)程，首先側(cè)鏈C-21 位發(fā)生羥基化反應(yīng)，形成草二酰酯中間體，通過(guò)如圖3所示的羥醛加成過(guò)程和脫羧反應(yīng)，生成含有六元不飽和內(nèi)酯環(huán)的蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分[50-52]。

在蟾蜍中，Siperstein 等[53]利用同位素示蹤法揭示marinobufotxin 和南美蟾毒精的生物合成前體為膽固醇。膽固醇在動(dòng)物中被代謝成孕烯醇酮和羥基膽汁酸鹽，這可能是蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分生物合成的重要中間體。Chen 等[54]通過(guò)給予蟾蜍14C或氘標(biāo)記的類固醇，發(fā)現(xiàn)5α-和3β,5β-羥基膽酸鹽衍生物是比膽固醇更有效的前體；但是給予標(biāo)記的孕烯醇酮時(shí)不能檢測(cè)到放射性。這與已報(bào)道的植物中強(qiáng)心甾類生物合成前體是孕烯醇酮的結(jié)果正好相反[54]。

為了找到動(dòng)植物來(lái)源蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分生物合成途徑之間的相關(guān)性，Porto 等[49]同時(shí)給蟾蜍和紅海蔥Scilla marilima(L.) Stearn 接種孕烯醇酮- 20-14C，結(jié)果發(fā)現(xiàn)孕烯醇酮是scilliroside 的良好前體，但是它沒(méi)有被合成到南美蟾毒精。該實(shí)驗(yàn)表明Chen 等[54]實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能是正確的，即在蟾蜍體內(nèi)，膽固醇被代謝為孕烯醇酮的情況下，后者不能用來(lái)合成蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分。進(jìn)一步，Porto 等[55]和Dmitrieva 等[56]研究結(jié)果證實(shí)了蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類的生物合成不依賴于膽固醇側(cè)鏈的切割。膽固醇可能先轉(zhuǎn)化為膽汁酸鹽中間體，后者可以通過(guò)其他步驟轉(zhuǎn)化為蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分。從蟾蜍毒液中分離出來(lái)的7α-羥基膽固醇和7β-羥基膽固醇（膽汁酸生物合成中的關(guān)鍵中間體）將支持這一假設(shè)[49]。另外，F(xiàn)edorova等[57-58]發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物的marinobufagenin是由膽固醇通過(guò)新型酸性膽汁酸途徑合成的，而marinobufageni 與南美蟾毒精具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在新型酸性膽汁酸途徑中，膽固醇側(cè)鏈的切割由細(xì)胞色素P450（CYP）27A1 酶啟動(dòng)，該酶在肝外組織中表達(dá)，包括腎上腺[58-62]。因此，蟾蜍可能通過(guò) 一種類似于哺乳動(dòng)物中marinobufagenin 的肝外酸性膽汁酸途徑合成蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分。

圖3 蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的下游生物合成途徑 (植物)[50-52]Fig.3 Downstream biosynthetic pathways of bufadienolides (plant)[50-52]

孕烯醇酮在強(qiáng)心甾類及其相關(guān)化合物的生物合成中起著非常重要的作用[49]。Garraffo 等[63]研究結(jié)果顯示，具有完整的膽固醇型側(cè)鏈的膽固醇及其類固醇能夠穿透到蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分生物合成的位點(diǎn)并且通過(guò)未知機(jī)制轉(zhuǎn)化為蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分。孕烯醇酮在蟾蜍中作為蟾蜍烯二烯內(nèi)酯類成分前體的失敗原因可能是由于其不能滲透到蟾蜍烯二烯內(nèi)酯類成分的生物合成位點(diǎn)[63]。Santa Coloma 等[64]將乙酸鈉-1-14C和甲羥戊酸-5-3H接種到蟾蜍的耳后腺和肝臟，發(fā)現(xiàn)肝臟產(chǎn)生的膽固醇中含有這樣2 種標(biāo)記，而耳后腺產(chǎn)生的膽固醇不含任何標(biāo)記。推測(cè)蟾蜍中用于合成的膽固醇前體主要在肝臟或腸道產(chǎn)生，并通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)移到皮膚腺和耳后腺?gòu)亩l(fā)揮前體的作用。

3.2 蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的生物合成途徑總結(jié)與推測(cè)

如圖4 所示，推測(cè)蟾蜍中蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的生物合成可能分為3 個(gè)階段。第1 階段是類異戊二烯前體和膽固醇中間體的形成。無(wú)論是在植物中還是在蟾蜍中，蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的生物合成起點(diǎn)都是類異戊二烯前體[56]。類異戊二烯前體經(jīng)過(guò)甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4- phosphate，MEP/DOXP）途徑生成異戊焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（dimenthylallylpyrophosphate，DMAPP）[65]。IPP 和DMAPP 經(jīng)過(guò)一系列酶的作用下，生成香葉草基焦磷酸（geranyl pyrophosphate，GPP）和焦磷酸法尼酯（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）[65]。兩分子FPP 在鯊烯合酶（squalene synthase，SQS）的作用下合成角鯊烯（squalene）。角鯊烯為甾體化合物的前體。下一步，角鯊烯在鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SQE）的作用下，生成中間體2,3-氧化角鯊烯（2,3-oxiaosqualene）[65]。該中間體可啟動(dòng)角鯊烯的環(huán)化反應(yīng)，即在2,3-氧化角鯊烯在羊毛甾醇合酶（lanosterol synthase，LS）的作用下環(huán)化成羊毛甾醇（lanosterol），其主要作用是合成甾體骨架[65-66]。最后，羊毛甾醇經(jīng)過(guò)一系列酶的作用下合成酵母甾醇（zymosterol）和膽固醇[65]。

蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的生物合成第2 階段涉及膽固醇甾體母核A/B 環(huán)的脫氫異構(gòu)化、母核14β-OH 或14,15-環(huán)氧化以及膽固醇側(cè)鏈的修飾環(huán)合。對(duì)于這一階段的反應(yīng)機(jī)制、反應(yīng)順序以及相關(guān)酶基因的研究報(bào)道很少（圖3）。第2 階段中，蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的母核A/B 環(huán)發(fā)生一系列氧化、脫氫、異構(gòu)化和還原過(guò)程，并且3-羥基-5-烯結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為3-羥基-5-βH結(jié)構(gòu)形成順式配置的A/B 環(huán)[67]。3β-HSD 屬于短鏈脫氫酶/還原酶超家族[68]。其催化甾體的Δ5-3-羥基構(gòu)型氧化轉(zhuǎn)化為Δ4-3-羰基構(gòu)型。該轉(zhuǎn)化反應(yīng)是在2 個(gè)獨(dú)立的順序反應(yīng)中進(jìn)行的，在需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的第1 個(gè)反應(yīng)中，該酶催化3β-羥基類固醇脫氫為3-氧代類固醇中間體；在第2 個(gè)反應(yīng)中，還原的輔酶（仍保持附著在酶上）激活還原反應(yīng)，使Δ5構(gòu)型異構(gòu)化為Δ4構(gòu)型[67-68]。這些結(jié)果表明3β-HSD 可能在蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分A/B 環(huán)順式構(gòu)型的形成中發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究表明[69-70]，3β-HSD 可以催化膽固醇轉(zhuǎn)化為4-cholesten-3-one，后者可以先后7α-羥基化為4-cholesten-7α-ol-3-one，這是重要的膽汁酸生物合成中間體。而膽汁酸可能是蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分生物合成的最重要的中間體之一[56,71]。Xu 等[67]從中華大蟾蜍中克隆了一個(gè)Bbg-3βHSD 脫氫酶，發(fā)現(xiàn)其能氧化孕烯醇酮和脫氫表雄酮，但卻對(duì)膽固醇和谷固醇沒(méi)有脫氫活性；原因可能是Bbg-3βHSD 脫氫酶的催化口袋無(wú)法容納C27類固醇的長(zhǎng)側(cè)鏈。3β-HSD7 脫氫酶對(duì)具有Δ5-雙鍵的3β,7β-二羥基-C27-類固醇具有高度特異性[72-73]。所以，膽固醇可能先經(jīng)過(guò)CYP27A1 啟動(dòng)的酸性膽汁酸途徑形成27-羥基膽固醇和3β-羥基-5-膽甾烯酸酯，然后膽汁酸鹽被3β-HSD7 催化形成順式配置的A/B 環(huán)[71]。

蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分生物合成的第3 階段是相關(guān)基因家族對(duì)母核上多種取代基的修飾（圖4）。這也是蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性的原因。由于絕大多數(shù)的蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分母核結(jié)構(gòu)為蟾毒靈類（I）和酯蟾毒配基類（II）。所以本文總結(jié)了這2 類母核結(jié)構(gòu)的蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分，并根據(jù)母核上取代基的類型、數(shù)量和位置，推斷它們相互間結(jié)構(gòu)的生物轉(zhuǎn)化關(guān)系和繪制了可能轉(zhuǎn)化路線圖（圖5）?？偨Y(jié)發(fā)現(xiàn)，蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分化學(xué)結(jié)構(gòu)差異的原因主要是取代基的類型、數(shù)量、位置和立體異構(gòu)。蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的甾體母核上具有多種取代基，如羥基、環(huán)氧基、乙?；?、糖基、酮基等。因此，參與蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分生物合成有關(guān)的基因家族可能包括CYP450s、糖基轉(zhuǎn)移酶[74]（glycosyltransferases，UGTs）、?；D(zhuǎn)移酶（acyltransferases，ATs）和脫氫酶（dehydrogenases，DHs）等。涉及的羥基化反應(yīng)主要位于C-1β、3β、5β、11α、12α/β、14β、16β 和19 位；乙?；吞腔磻?yīng)主要位于C-3β、16β 位；氧代反應(yīng)主要位于在C-3、11、12 和19 位。

圖4 蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分可能的生物合成途徑 (蟾蜍)Fig.4 Possible biosynthetic pathways of bufadienolides (B.gararizans)

圖5 蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分的生物轉(zhuǎn)化路線圖Fig.5 Roadmap of bufadienolides biotransformation

5β-OH、14β-OH 和14,15-環(huán)氧化的先后順序：首先，14β-OH 和14,15-環(huán)氧化是蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的特征基團(tuán)，目前從自然界分離并鑒定的蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分都含有14β-OH 或者14,15-環(huán)氧化。其次，由于在C-5 沒(méi)有羥基的蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類已經(jīng)存在，所以14β-OH 或14,15-環(huán)氧化應(yīng)該在5β-OH 之前[54]。而對(duì)于蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分中α- 吡喃酮環(huán)的生物合成，Porto 等[75]結(jié)果顯示，蟾蜍中蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的α-吡喃酮環(huán)可能直接來(lái)源于膽固醇的側(cè)鏈。另外，內(nèi)酯環(huán)應(yīng)該是在內(nèi)核氧化之后產(chǎn)生的[54]。最后，Chen 等[54]討論了不同蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分之間生物合成的可能順序，其推測(cè)酯蟾毒配基首先通過(guò)還原為蟾毒靈或進(jìn)一步羥基化成為南美蟾毒精，接著通過(guò)相似的還原或羥基化反應(yīng)，南美蟾毒精和蟾毒靈分別被代謝為遠(yuǎn)華蟾毒精。

4 總結(jié)與展望

目前，蟾酥藥用資源需求量與日俱增，使得蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分成為研究熱點(diǎn)。除了人工養(yǎng)殖蟾蜍以外，獲取蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的途徑還包括生物轉(zhuǎn)化和生物合成等。生物轉(zhuǎn)化在獲取天然蟾蜍類藥材中不存在的蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分方面具有較為突出的優(yōu)勢(shì)?；诤铣缮飳W(xué)原理，設(shè)計(jì)和改造微生物菌株來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)天然產(chǎn)物，是一種極具潛力的稀有天然活性成分獲取辦法。迄今為止，蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分生物合成途徑的解析已獲得較大的進(jìn)展。本文總結(jié)蟾蜍體內(nèi)可能的蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分生物合成途徑。推測(cè)蟾蜍中蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的生物合成可能分為3 個(gè)階段，首先是類異戊二烯前體和膽固醇中間體的形成；然后是膽固醇或膽汁酸鹽甾體母核A/B 環(huán)的脫氫異構(gòu)化、母核14β-OH 或14,15-環(huán)氧化以及膽固醇側(cè)鏈修飾環(huán)合；最后是蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類母核上取代基的修飾，其涉及的基因家族可能包括CYP450s、UGTs、ATs 等。現(xiàn)階段，蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類生物合成第2、3 階段的反應(yīng)機(jī)制、反應(yīng)順序以及相關(guān)酶基因發(fā)現(xiàn)的研究報(bào)道很少。隨著高通量測(cè)序及組學(xué)技術(shù)發(fā)展，未來(lái)應(yīng)該多學(xué)科聯(lián)系攻關(guān)以推進(jìn)蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的合成生物學(xué)發(fā)展，革新傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式，使蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類成分的生物合成成為蟾酥藥用資源可持續(xù)利用的重要途徑之一。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突