李 霞，曹 旺，劉彩霞，鄧常清,*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410028

2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 血管生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410028

血管內(nèi)膜增生（intimal hyperplasia，IH）是多種心血管疾病的基本病理機(jī)制[1-2]。IH 是一種獨(dú)特的血管重塑狀態(tài)，涉及內(nèi)皮細(xì)胞損傷、成纖維細(xì)胞激活、細(xì)胞外基質(zhì)重建以及血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）遷移、增殖和分化等血管的所有組成部分。VSMC 遷移至血管內(nèi)膜并不斷增殖，血管管腔逐漸縮小，為造成動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)、冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)等血管狹窄的主要原因[3]。

黃芪和當(dāng)歸藥對(duì)為臨床常用的氣血雙補(bǔ)藥對(duì)，也是常用的益氣活血藥對(duì)。黃芪味甘而薄，具補(bǔ)氣之功；當(dāng)歸味甘而重，故專(zhuān)能補(bǔ)血，其氣輕而辛，故又能行血。黃芪-當(dāng)歸配伍具有保護(hù)心血管[4]、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腦缺血、抗臟器纖維化等作用，可以干預(yù)血管內(nèi)膜增生多個(gè)相關(guān)的病理機(jī)制[5-7]。本課題組前期研究表明，黃芪-當(dāng)歸配伍能夠抑制大鼠血管內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生，其作用機(jī)制與抑制VSMC 增殖、炎性反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)沉積等有關(guān)[8]。目前對(duì)于黃芪-當(dāng)歸配伍抗血管內(nèi)膜增生的配伍形式、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不明確。由于中藥治療疾病具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，本課題組前期采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討了黃芪-當(dāng)歸配伍改善血管內(nèi)膜增生的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和可能的作用靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)黃芪-當(dāng)歸配伍可能通過(guò)20 個(gè)活性成分，作用于193 個(gè)潛在靶點(diǎn)，調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、絲裂原活化蛋白激酶（mitrogen-acitivated protein kinase，MAPK）、Ras等信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗血管內(nèi)膜增生的作用[9]。本研究以黃芪和當(dāng)歸配伍益氣活血功效為基礎(chǔ)，以VSMC 功能為切入點(diǎn)，探討黃芪-當(dāng)歸配伍抗血管內(nèi)膜增生的作用，并從VSMC 表型轉(zhuǎn)化和增殖研究其作用機(jī)制，旨在揭示其抗血管內(nèi)膜增生的有效配伍，為臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)新西蘭兔，雌雄各半，3～4月齡，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXX（湘）2020-0005。動(dòng)物于清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，溫度25 ℃、濕度45%～65%，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)LL219102002）。

1.2 藥材

黃芪、當(dāng)歸由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科左亞杰教授鑒定分別為豆科植物膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根、傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels 的干燥根，符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定。

1.3 藥品與試劑

阿托伐他汀鈣片（批號(hào)20190411B，10 mg/片）購(gòu)自浙江樂(lè)普藥業(yè)有限公司；Masson 改良三色染色試劑盒（批號(hào)20190613）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；二步法免疫組化法試劑盒（批號(hào)2015G0115）、DAB 顯色試劑盒（批號(hào)K196721D）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PI3K 抗體（批號(hào)LS-C312573）購(gòu)自美國(guó)LSBio 公司；Akt 抗體（批號(hào)bs69512）、磷酸化PI3K（p-PI3K）抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（批號(hào)GR3257713-3）、p-Akt 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體（批號(hào)10003678）、β-actin 抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；骨橋蛋白（osteopontin，OPN）抗體（批號(hào)NB110-89062）購(gòu)自美國(guó)Novus 公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）檢測(cè)試劑盒（批號(hào) 20201028）、三酰甘油（triglycerides，TG）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20101034）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20200820）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20201024）購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號(hào)PQ0012）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF 膜（批號(hào)IPV00010）、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)WBKLS0100）購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司。

1.4 儀器

石蠟切片機(jī)（英國(guó)Shado 公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；水平電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備（美國(guó)Bio-Rad 公司）；高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman 公司）；低溫臺(tái)式高速離心機(jī)（赫西儀器裝備有限公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；脫色搖床（上海新波公司）；超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）。

2 方法

2.1 黃芪-當(dāng)歸配伍和制備

本課題組前期研究表明，黃芪-當(dāng)歸（1∶1）配伍時(shí)具有較好的抗血管內(nèi)膜增生的作用[8]，而傳統(tǒng)的黃芪-當(dāng)歸配伍（當(dāng)歸補(bǔ)血湯）多為5∶1 配伍，因此本研究設(shè)置黃芪-當(dāng)歸（1∶1）、黃芪-當(dāng)歸（1∶5）、黃芪-當(dāng)歸（5∶1）3 個(gè)比例的配伍。按以上比例分別取藥材，加入8 倍量水，回流提取1 h，濾過(guò)；再加入6 倍量水，回流提取1 h，濾過(guò)；再加入6倍量水，回流提取1 h，濾過(guò)；合并3 次濾液，真空減壓濃縮至1 g/mL（以生藥量計(jì)）。

2.2 造模、分組與給藥

新西蘭兔隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、黃芪（1 g/kg）組、當(dāng)歸（1 g/kg）組、黃芪-當(dāng)歸（1∶1，2 g/kg）組、黃芪-當(dāng)歸（1∶5，6 g/kg）組、黃芪-當(dāng)歸（5∶1，6 g/kg）組和阿托伐他?。? mg/kg）組，每組10 只。按頸總動(dòng)脈套管法改良制備頸總動(dòng)脈血管內(nèi)膜增生模型[10]，新西蘭兔術(shù)前12 h 禁食不禁水，耳緣iv 2.5%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉，仰臥固定，頸部正中切口，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈；將1個(gè)無(wú)活性的柔軟的硅橡膠管（長(zhǎng)20 mm、內(nèi)徑1.0 mm）沿長(zhǎng)軸剪開(kāi)后，套在分離的兩側(cè)頸總動(dòng)脈外面，用絲線(xiàn)結(jié)扎固定；術(shù)后im 青霉素，1 次/d，連續(xù)7 d。對(duì)照組只分離頸總動(dòng)脈，不進(jìn)行血管套管。自術(shù)后第1 天起喂養(yǎng)高脂飼料（2%膽固醇＋3%橄欖油＋95%普通飼料），對(duì)照組喂養(yǎng)普通飼料。自術(shù)后第1 天起，各給藥組ig 相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組ig 等體積蒸餾水（15 mL/kg），1 次/d，連續(xù)28 d。

2.3 黃芪-當(dāng)歸配伍對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生模型血清中TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平的影響

給藥結(jié)束后，新西蘭兔腹主動(dòng)脈采血，3000 r/min 離心15 min，取上層血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平。

2.4 黃芪-當(dāng)歸配伍對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生模型頸總動(dòng)脈病理變化的影響

新西蘭兔腹主動(dòng)脈采血后，取損傷段頸總動(dòng)脈，在PBS 中將血管剝離干凈，于4%多聚甲醛中固定7 d，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，每段血管間斷均勻切取8 片（厚4～6 μm）；按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Masson 染色，于顯微鏡下觀(guān)察并拍照，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件測(cè)定中膜面積（media area，MA）、內(nèi)膜面積（intimal area，IA）、內(nèi)膜中線(xiàn)周長(zhǎng)、中膜中線(xiàn)周長(zhǎng)，計(jì)算中膜厚度（media thickness，MT）、內(nèi)膜厚度（intimal thickness，IT）、內(nèi)膜面積增生率（hyperplasia ratio of intimal area，HRIA）、內(nèi)膜厚度增生率（hyperplasia ratio of intimal thickness，HRIT），評(píng)價(jià)血管內(nèi)膜增生程度。

MA＝外彈力膜內(nèi)面積－內(nèi)彈力膜內(nèi)面積

IA＝內(nèi)彈力膜內(nèi)面積－管腔面積

MT＝(外彈力膜內(nèi)面積/π)1/2－(內(nèi)彈力膜內(nèi)面積/π)1/2

IT＝(外彈力膜內(nèi)面積/π)1/2－(管腔面積/π)1/2

HRIA＝內(nèi)膜面積/(內(nèi)膜面積＋中膜面積)

HRIT＝內(nèi)膜厚度/(內(nèi)膜厚度＋中膜厚度)

2.5 黃芪-當(dāng)歸配伍對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生模型頸總動(dòng)脈α-SMA、OPN 和PCNA 表達(dá)的影響

免疫組化法測(cè)定損傷段頸總動(dòng)脈增生內(nèi)膜中VSMC 收縮表型標(biāo)志物α-SMA、合成表型標(biāo)志物OPN 和增殖標(biāo)志物PCNA 表達(dá)。取各組損傷段頸總動(dòng)脈，于4%多聚甲醛中固定7 d，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片（厚4 μm）；60 ℃烤片過(guò)夜，脫蠟水化，微波抗原修復(fù)，冷卻至室溫，分別滴加50 μL α-SMA 抗體（1∶2000）、PCNA 抗體（1∶300）、OPN 抗體（1∶300），4 ℃孵育過(guò)夜；滴加HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔IgG 抗體，37 ℃孵育30 min；DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明后封片，于顯微鏡下觀(guān)察并拍照，陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色點(diǎn)狀或纖維狀染色，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件測(cè)定吸光度（A）值并計(jì)算陽(yáng)性染色面積。

2.6 黃芪-當(dāng)歸配伍對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生模型頸總動(dòng)脈PI3K/Akt 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

取各組損傷段頸總動(dòng)脈，加入RIPA 裂解液，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，100 ℃加熱變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉90 min；分別加入PI3K 抗體（1∶1000）、p-PI3K抗體（1∶500）、Akt 抗體（1∶1000）、p-Akt 抗體（1∶1000）和β-actin 抗體（1∶5000），4 ℃孵育過(guò)夜；加入HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔IgG 抗體（1∶1000），室溫孵育90 min；加入ECL 化學(xué)發(fā)光液顯影，采用Image J 軟件分析條帶。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。先將各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者用LSD檢驗(yàn)；方差不齊者用Dunnett’sT3 檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 黃芪-當(dāng)歸配伍對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生模型血清中TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平的影響

如表1 所示，與對(duì)照組比較，模型組家兔血清中TC、TG 和LDL-C 水平顯著升高（P＜0.01），HDL-C 水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪-當(dāng)歸（1∶1、5∶1）組及阿托伐他汀組血清中TC、TG 和LDL-C 水平顯著降低（P＜0.05、0.01），HDL-C 水平顯著升高（P＜0.01）；當(dāng)歸組血清中TG 和LDL-C 水平顯著降低（P＜0.05、0.01）。

表1 黃芪-當(dāng)歸配伍對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生模型血清中TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平的影響 ( ± s , n=5)Table 1 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on levels of TC, TG, LDL-C and HDL-C in serum of vascular intimal hyperplasia rabbit model ( ± s , n=5)

表1 黃芪-當(dāng)歸配伍對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生模型血清中TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平的影響 ( ± s , n=5)Table 1 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on levels of TC, TG, LDL-C and HDL-C in serum of vascular intimal hyperplasia rabbit model ( ± s , n=5)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：△P＜0.05 △△P＜0.01，下表同*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group; △P < 0.05 △△P < 0.01 vs model group, same as below tables

組別 劑量/(g·kg?1) TC/(mmol·L?1) TG/(mmol·L?1) HDL-C/(mmol·L?1) LDL-C/(mmol·L?1) 對(duì)照 — 2.95±0.41 0.64±0.05 4.49±0.13 0.52±0.18 模型 — 64.24±13.12** 6.39±1.55** 0.87±0.05** 15.83±3.34** 黃芪 1 53.56±11.60 5.13±1.37 0.64±0.26 18.57±3.94 當(dāng)歸 1 50.31±8.88 3.98±0.91△△ 0.54±0.31 11.94±2.62△ 黃芪-當(dāng)歸（1∶1） 2 25.92±10.02△ 2.91±0.98△△ 4.30±1.83△△ 6.11±1.97△△ 黃芪-當(dāng)歸（1∶5） 6 54.90±10.02 6.22±1.32 1.27±0.60 15.12±2.25 黃芪-當(dāng)歸（5∶1） 6 29.15±2.85△ 2.38±0.73△△ 6.16±3.44△△ 6.53±1.65△ 阿托伐他汀 0.005 9.04±2.44△△ 2.11±0.62△△ 5.95±1.31△△ 2.87±1.83△△

3.2 黃芪-當(dāng)歸配伍對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生模型頸總動(dòng)脈病理變化的影響

如圖1 所示，對(duì)照組家兔血管內(nèi)彈力膜完整，呈單層，未見(jiàn)明顯增生；模型組血管內(nèi)膜呈均一或不均一增厚，并有大量增生的VSMC 存在，排列紊亂，內(nèi)膜增生明顯；各給藥組血管內(nèi)膜呈增生性改變，但增生程度較模型組減輕。

圖1 黃芪-當(dāng)歸配伍對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生模型頸總動(dòng)脈病理變化的影響 (Masson, ×100)Fig.1 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on pathological changes of common carotid artery in vascular intimal hyperplasia rabbit model (Masson, × 100)

如表2 所示，與對(duì)照組比較，模型組IA、IT、HRIA、HRIT 均顯著升高（P＜0.01），表明兔頸總動(dòng)脈不完全性狹窄后出現(xiàn)明顯的內(nèi)膜增生；與模型組比較，黃芪-當(dāng)歸（1∶1、5∶1）組及阿托伐他汀組IA、IT、HRIA、HRIT 均顯著降低（P＜0.01）。

表2 黃芪-當(dāng)歸配伍對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生模型頸總動(dòng)脈IA、IT、HRIA 和HRIT 的影響 ( ± s , n=5)Table 2 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on IA, IT, HRIA and HRIT of common carotid artery in vascular intimal hyperplasia rabbit model ( ± s , n=5)

表2 黃芪-當(dāng)歸配伍對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生模型頸總動(dòng)脈IA、IT、HRIA 和HRIT 的影響 ( ± s , n=5)Table 2 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on IA, IT, HRIA and HRIT of common carotid artery in vascular intimal hyperplasia rabbit model ( ± s , n=5)

組別 劑量/(g·kg?1) IA/μm2 IT/μm HRIA/% HRIT/% 對(duì)照 — 6 711.80±1 583.54 2.92±0.58 0.06±0.01 0.07±0.01 模型 — 43 150.40±10 544.20** 25.69±9.09** 0.35±0.03** 0.37±0.02** 黃芪 1 37 335.00±7 316.51 19.53±3.57 0.32±0.05 0.37±0.05 當(dāng)歸 1 44 011.00±9 800.04 19.33±0.72 0.29±0.04 0.36±0.05 黃芪-當(dāng)歸（1∶1） 2 15 493.00±5 119.52△△ 4.43±0.98△△ 0.18±0.06△△ 0.18±0.03△△ 黃芪-當(dāng)歸（1∶5） 6 45 310.20±16 247.25 22.29±12.54 0.33±0.07 0.34±0.11 黃芪-當(dāng)歸（5∶1） 6 11 904.60±9 971.65△△ 5.00±1.98△△ 0.23±0.08△△ 0.22±0.10△△ 阿托伐他汀 0.005 22 196.00±10 451.97△△ 7.12±3.19△△ 0.23±0.10△△ 0.20±0.09△△

3.3 黃芪-當(dāng)歸配伍對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生模型頸總動(dòng)脈α-SMA、OPN 和PCNA 表達(dá)的影響

α-SMA 是VSMC 的收縮表型標(biāo)志物，能夠反映VSMC 的收縮狀態(tài)；OPN 是VSMC 合成表型標(biāo)志物，能夠反映VSMC 的合成和分泌狀態(tài)；PCNA能夠反映VSMC 的增殖活性。如圖2～4 和表3 所示，與對(duì)照組比較，模型組頸總動(dòng)脈α-SMA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05），OPN 和PCNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪-當(dāng)歸（1∶1、5∶1）組及阿托伐他汀組頸總動(dòng)脈α-SMA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05、0.01），OPN 和PCNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；黃芪-當(dāng)歸（1∶5）組頸總動(dòng)脈PCNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。

圖2 黃芪-當(dāng)歸配伍對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生模型頸總動(dòng)脈α-SMA 表達(dá)的影響 (×200)Fig.2 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on α-SMA expression in common carotid artery of vascular intimal hyperplasia rabbit model (× 200)

圖3 黃芪-當(dāng)歸配伍對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生模型頸總動(dòng)脈OPN 表達(dá)的影響 (×200)Fig.3 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on OPN expression in common carotid artery of vascular intimal hyperplasia rabbit model (× 200)

3.4 黃芪-當(dāng)歸配伍對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生模型頸總動(dòng)脈PI3K/Akt 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖5 所示，與對(duì)照組比較，模型組頸總動(dòng)脈p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪-當(dāng)歸（1∶1、1∶5、5∶1）組及阿托伐他汀組頸總動(dòng)脈p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01）。

圖4 黃芪-當(dāng)歸配伍對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生模型頸總動(dòng)脈PCNA 表達(dá)的影響 (×200)Fig.4 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on PCNA expression in common carotid artery of vascular intimal hyperplasia rabbit model (× 200)

圖5 黃芪-當(dāng)歸配伍對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生模型頸總動(dòng)脈PI3K/Akt 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 ( ± s , n=6)Fig.5 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on PI3K/Akt pathway related protein expressions in common carotid artery of vascular intimal hyperplasia rabbit model ( ± s , n=6)

表3 黃芪-當(dāng)歸配伍對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生模型頸總動(dòng)脈α-SMA、OPN 和PCNA 表達(dá)的影響 ( ± s , n=5)Table 3 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on expression of α-SMA, OPN and PCNA in common carotid artery of vascular intimal hyperplasia rabbit model ( ± s , n=5)

表3 黃芪-當(dāng)歸配伍對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生模型頸總動(dòng)脈α-SMA、OPN 和PCNA 表達(dá)的影響 ( ± s , n=5)Table 3 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on expression of α-SMA, OPN and PCNA in common carotid artery of vascular intimal hyperplasia rabbit model ( ± s , n=5)

組別 劑量/(g·kg?1) α-SMA/μm2 OPN/μm2 PCNA/μm2 對(duì)照 — 0.40±0.05 0.22±0.02 0.24±0.03 模型 — 0.23±0.01* 0.33±0.02** 0.33±0.03** 黃芪 1 0.26±0.02 0.32±0.06 0.31±0.02 當(dāng)歸 1 0.26±0.03 0.29±0 0.31±0.02 黃芪-當(dāng)歸（1∶1） 2 0.39±0.03△△ 0.24±0.02△△ 0.23±0.01△△ 黃芪-當(dāng)歸（1∶5） 6 0.25±0.03 0.30±0.03 0.29±0.03△△ 黃芪-當(dāng)歸（5∶1） 6 0.38±0.05△ 0.21±0.01△△ 0.23±0.01△△ 阿托伐他汀 0.005 0.34±0.02△ 0.22±0.01△△ 0.24±0.03△△

4 討論

血管成形術(shù)后的6 個(gè)月內(nèi)，55%患者會(huì)發(fā)生血管再狹窄[11]。血管成形術(shù)和支架植入后再狹窄主要由IH 引起，VSMC 活化在IH 的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。當(dāng)血管成形術(shù)和支架植入后，血管內(nèi)皮受損，導(dǎo)致VSMC 由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化，具有增殖、分化和合成的能力；VSMCs 由血管中膜向內(nèi)膜遷移并增殖，并合成大量細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致血管內(nèi)膜增生，管腔逐漸縮小[12-13]。中藥具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的調(diào)控作用，可以通過(guò)多成分調(diào)節(jié)血管內(nèi)膜增生的病理機(jī)制，從而抑制或延緩血管內(nèi)膜增生的發(fā)生發(fā)展。由于VSMC 遷移和增殖是血管內(nèi)膜增生的主要病理機(jī)制，因此基于VSMC 功能來(lái)研究中藥防治血管內(nèi)膜增生具有重要的意義。

本研究通過(guò)建立家兔頸總動(dòng)脈血管內(nèi)膜增生模型，考察黃芪和當(dāng)歸不同比例配伍對(duì)血管內(nèi)膜增生的作用，結(jié)果顯示，單用黃芪或當(dāng)歸對(duì)血管內(nèi)膜增生無(wú)顯著抑制作用，黃芪-當(dāng)歸配伍能夠抑制兔血管內(nèi)膜增生，黃芪和當(dāng)歸不同配伍顯著降低IA、IT、HRIA、HRIT，其中黃芪-當(dāng)歸（1∶1、5∶1）配伍的療效最佳，提示黃芪-當(dāng)歸配伍具有抑制血管內(nèi)膜增生的作用，以黃芪-當(dāng)歸（1∶1、5∶1）配伍為宜。

血脂是誘發(fā)血管內(nèi)膜增生的重要因素，高脂水平易引起機(jī)體代謝與功能紊亂，導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損、發(fā)生炎性反應(yīng)及氧化損傷，從而直接或間接參與IH的病理過(guò)程[14]。血清炎性因子水平與血脂水平密切相關(guān)，調(diào)節(jié)血脂有助于改變機(jī)體的炎性反應(yīng)[15]。研究表明，黃芪當(dāng)歸合劑具有調(diào)脂作用，療效與他汀類(lèi)藥物相似且更持久[16]。本研究結(jié)果顯示，單用黃芪對(duì)血脂水平無(wú)顯著影響，單用當(dāng)歸僅降低TG 水平，黃芪-當(dāng)歸（1∶1、5∶1）配伍能夠降低血清中TC、TG、LDL-C 水平，升高HDL-C 水平，表明黃芪-當(dāng)歸配伍可能通過(guò)調(diào)節(jié)血脂水平，抑制脂質(zhì)向血管壁沉積，從而抑制血管內(nèi)膜增生。

VSMC 向血管內(nèi)膜遷移和增殖在血管增生性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[17]。VSMC 是一種高度分化的細(xì)胞，可以形成血管壁的中層，通過(guò)收縮和舒張血管從而控制血壓。與其他終末分化的肌細(xì)胞不同，VSMC 保留了分化（或收縮）和去分化（或合成）表型之間相互轉(zhuǎn)換的獨(dú)特能力，能夠響應(yīng)血管損傷、機(jī)械拉伸或生長(zhǎng)因子刺激等生理和病理信號(hào)[18-20]。收縮型VSMC 呈細(xì)長(zhǎng)的紡錘形形態(tài)，表現(xiàn)為極低的增殖活性，表達(dá)α-SMA、平滑肌22α（smooth muscle 22α，SM22α）等VSMC 特異性收縮基因。合成型VSMC 形態(tài)與成纖維細(xì)胞類(lèi)似，體積較收縮型VSMC 大，其遷移、增殖活性增加，合成膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的能力增強(qiáng)，收縮基因的表達(dá)減少[19]，表達(dá)OPN、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）等合成型標(biāo)志物[21]。PCNA 是一種核蛋白，參與細(xì)胞增殖相關(guān)的DNA 合成，只在增殖細(xì)胞中合成和表達(dá)[22]。本研究結(jié)果顯示，模型組頸總動(dòng)脈中VSMC 收縮表型的標(biāo)志物α-SMA 表達(dá)降低，合成表型標(biāo)志物OPN和細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA 表達(dá)升高，表明在血管狹窄模型中，VSMC 活化，由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化增多，細(xì)胞向內(nèi)膜遷移并增殖，促進(jìn)新生內(nèi)膜的形成；與模型組比較，單用黃芪或當(dāng)歸對(duì)α-SMA、OPN 和PCNA 表達(dá)無(wú)明顯作用，黃芪-當(dāng)歸（1∶1、5∶1）配伍能夠上調(diào)α-SMA 表達(dá)水平，下調(diào)OPN和PCNA 表達(dá)水平，提示黃芪-當(dāng)歸配伍可以抑制VSMC 活化，抑制VSMC 由收縮型向合成型轉(zhuǎn)換和細(xì)胞增殖。

PI3K-Akt 信號(hào)通路是EGFR 下游信號(hào)通路的重要組成部分，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PI3K/Akt 磷酸化激活是刺激VSMC 增殖和遷移的主要信號(hào)通路[23-25]。在血管內(nèi)膜增生性疾病中，PI3K/Akt被激活，從而抑制VSMC收縮表型標(biāo)記基因的表達(dá)[26-28]。本研究結(jié)果顯示，模型組頸總動(dòng)脈中p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明PI3K/Akt 信號(hào)被激活；與模型組比較，黃芪-當(dāng)歸（1∶1、5∶1）組p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明黃芪-當(dāng)歸（1∶1、5∶1）配伍能夠抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路，從而抑制VSMC增殖及表型轉(zhuǎn)化，發(fā)揮抗血管內(nèi)膜增生的作用。

綜上所述，血管成形術(shù)后再狹窄的發(fā)生涉及血管重構(gòu)、血管內(nèi)膜增生、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管平滑肌細(xì)胞遷移和過(guò)度增殖等病理過(guò)程。黃芪-當(dāng)歸配伍能夠調(diào)節(jié)血脂、抑制血管內(nèi)膜增生、緩解管腔狹窄，其機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路、抑制VSMC 表型轉(zhuǎn)化和增殖有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突