楊顯娟，付 尹，王佳俊，王 建*，肖琳萱，徐 卓，王立映，龔道銀

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137

2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610075

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種炎癥性腸病，發(fā)病部位僅限于結(jié)腸和直腸，病因尚不明確[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球UC 總患病率為0.4%[2-4]。黃連、厚樸為2 種傳統(tǒng)的中草藥，具有抗菌、抗氧化、止瀉和消炎的作用，臨床常將2 藥配伍聯(lián)用，厚樸制約黃連苦寒藥性，二者又可協(xié)同增效，且安全性更高。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃連的主要活性成分小檗堿對(duì)UC 具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)腸黏膜屏障和維持腸道菌群平衡的作用[5-6]；厚樸的主要活性成分厚樸酚對(duì)UC 也具有較好的保護(hù)作用[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃連、厚樸單獨(dú)或配伍使用對(duì)UC 均具有保護(hù)作用[8]。本研究采用生物信息學(xué)分析技術(shù)預(yù)測(cè)黃連-厚樸活性成分與活動(dòng)性UC 之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，系統(tǒng)性地評(píng)估黃連與厚樸治療UC的生物學(xué)過(guò)程和可能調(diào)控的信號(hào)通路，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為闡明黃連-厚樸配伍的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1 靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）[9]下載GSE75214 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，以P＜0.05 且|log2FC|≥1 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異基因，其中l(wèi)og2FC≥1 代表上調(diào)的差異表達(dá)基因，log2FC≤?1 代表下調(diào)的差異表達(dá)基因。

通過(guò)中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）[10]收集黃連、厚樸的活性成分，根據(jù)口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug likeness，DL）≥0.15篩選活性成分，同時(shí)利用SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction.ch/）[11]預(yù)測(cè)活性成分的作用靶點(diǎn)。

1.1.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和功能富集分析 利用R 語(yǔ)言將黃連-厚樸活性成分靶點(diǎn)與UC特異性差異基因取交集，繪制韋恩圖，采用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org）[12]構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)。采用CytoScape 軟件[13]對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 大鼠48 只，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量（220±20）g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（川）2020-030。動(dòng)物于成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，溫度（25.0±0.5）℃、濕度50%，通風(fēng)良好，保持明暗交替，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臨床委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)TCM-2016-312）。

1.2.2 藥材 黃連、厚樸購(gòu)自成都荷花池中藥材市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)李敏教授鑒定分別為黃連Coptis chinensisFranch.的干燥根莖、厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.的干燥干皮、枝皮及根皮。采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)得黃連中小檗堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.44%（以鹽酸小檗堿計(jì)），厚樸中厚樸酚與和厚樸酚的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.19%，均符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定。

1.2.3 藥品與試劑 2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS，批號(hào)P2297）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；柳氮磺胺吡啶腸溶片（批號(hào)09180709，0.25 g/片）購(gòu)自上海信宜天平藥業(yè)有限公司；白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)YX-091201R）、IL-6 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)YX-091221R）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)YX-201406R）、髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)YX-131615R）購(gòu)自上海優(yōu)選生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號(hào)202001）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；β-actin抗體（批號(hào)T0022）購(gòu)自美國(guó)Affinity 公司；蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體（批號(hào)4685S）、剪切型半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）抗體（批號(hào)9661S）購(gòu)自美國(guó)CST 公司；磷酸化Akt（p-Akt）抗體（批號(hào)AB38449）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）抗體（批號(hào)AB182651）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；B 淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抗體（批號(hào)109683）購(gòu)自美國(guó)GeneTex 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)143146）購(gòu)自美國(guó)Jackson Immuno Research 公司。

1.2.4 儀器 L3-5K 型高速離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；XD30型顯微鏡（日本Olympus 公司）；DG5032 型酶標(biāo)儀（上海珂淮儀器有限公司）；TSY-B 型搖床（天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司）；JB-P5 型包埋機(jī)（常州派斯杰醫(yī)療設(shè)備有限公司）；RM2235 型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）。

1.2.5 造模、分組與給藥 SD 大鼠禁食不禁水24 h后，取40 只大鼠采用TNBS/乙醇法[14]制備UC 模型。聚乙烯軟管經(jīng)石蠟潤(rùn)滑后插入大鼠直腸，深度約8 cm，向聚乙烯軟管中緩慢注入的TNBS/乙醇溶液（1 mL/kg），為防止藥液停留在軟管中，藥液注入完畢后，繼續(xù)注入0.4 mL 空氣，并將大鼠倒立，保持肛門高位2 min，以防止藥液倒流，使藥液均勻分布在直腸中；取8 只大鼠作為對(duì)照組，注入等體積0.9%氯化鈉溶液。黃連、厚樸和黃連-厚樸配伍水提物的制備及劑量設(shè)置參照本課題組前期研究方法[8]，將造模成功的40 只大鼠隨機(jī)分為模型組、黃連（2 g/kg）組、厚樸（2 g/kg）組、黃連-厚樸配伍（4 g/kg）組和柳氮磺胺吡啶（0.4 g/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量）組，每組8 只。造模24 h 后，各給藥組ig 相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig 等體積0.9%氯化鈉溶液，1 次/d，持續(xù)6 d。

1.2.6 黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平和MPO 活性的影響 末次給藥24 h 后，稱定大鼠體質(zhì)量，深度麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3500 r/min離心10 min，收集上清液，按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平和MPO 活性。

1.2.7 黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠結(jié)腸質(zhì)量/長(zhǎng)度、脾臟指數(shù)和腸黏膜損傷指數(shù)（colon macroscopic damage index，CMDI）評(píng)分的影響 大鼠腹主動(dòng)脈取血后，取結(jié)腸和脾臟組織，稱定質(zhì)量，將結(jié)腸平鋪在方格紙上測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度，并進(jìn)行CMDI評(píng)分[15]：0 分為黏膜無(wú)損傷、充血；1 分為局部黏膜充血水腫，但無(wú)糜爛、潰瘍形成；2 分為黏膜有潰瘍形成、充血，但炎性反應(yīng)與潰瘍僅顯點(diǎn)狀不顯著；3 分為在2分的基礎(chǔ)上，黏膜潰瘍、充血范圍直徑超過(guò)4 mm，炎性反應(yīng)顯著；4 分為在3 分的基礎(chǔ)上，黏膜潰瘍、充血、炎性反應(yīng)更嚴(yán)重，并有結(jié)腸增厚現(xiàn)象；5 分為在4 分的基礎(chǔ)上，潰瘍面積直徑超過(guò)1 cm，結(jié)腸明顯充血、增厚；6 分為在5 分的基礎(chǔ)上，潰瘍形成超過(guò)2 cm 且糜爛，結(jié)腸增厚。

1.2.8 黃連-厚樸配伍對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織病理變化的影響 各組大鼠取靠近直腸的結(jié)腸組織，于4%多聚甲醛中固定48 h，經(jīng)脫水、透明、包埋、切片、貼片、烤片后，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下結(jié)腸組織病理變化，并進(jìn)行病理?yè)p傷程度評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 結(jié)腸組織病理?yè)p傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring criteria of colonic histopathological damage

結(jié)腸組織病理?yè)p傷評(píng)分＝(炎性細(xì)胞浸潤(rùn)＋組織結(jié)構(gòu)的完整性)/2

1.2.9 黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠結(jié)腸組織PI3K、Akt 和cleaved Caspase-3 表達(dá)的影響 取各組大鼠結(jié)腸組織，包埋后切片（厚2 μm），脫蠟、水化、抗原修復(fù)、阻斷、封閉后，分別滴加Akt 抗體（1∶100）、PI3K 抗體（1∶100）、cleaved Caspase-3 抗體（1∶400），4 ℃孵育過(guò)夜；加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體孵育，于顯微鏡下觀察并拍照，使用Image J 軟件分析結(jié)腸組織PI3K、Akt 和cleaved Caspase-3 表達(dá)情況。

1.2.10 黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠結(jié)腸組織p-Akt、Bcl-2 和cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)的影響 取大鼠結(jié)腸組織，加入預(yù)冷的RIPA 裂解液（含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑），提取蛋白，采用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉后，分別加入p-Akt、Akt、Bcl-2、cleaved Caspase-3 和β-actin 抗體，孵育過(guò)夜；加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體，孵育后加入ECL 發(fā)光液顯影，采用Image J 軟件分析條帶。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，使用單因素方差分析（One-way ANOVA）結(jié)合事后檢驗(yàn)進(jìn)行組間分析。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 UC 差異基因的表達(dá) GSE75214 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)包括11 例正常結(jié)腸組織樣本和74 例活動(dòng)性UC 結(jié)腸組織樣本，根據(jù)P＜0.05 且|log2FC|≥1 共篩選出1243 個(gè)差異表達(dá)基因，包括794 個(gè)表達(dá)上調(diào)的差異基因和449 個(gè)表達(dá)下調(diào)的差異基因，見圖1。

圖1 UC 結(jié)腸組織差異表達(dá)基因的火山圖Fig.1 Volcano map of differentially expressed genes in UC colon tissue

2.1.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 如表2 所示，TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到黃連-厚樸活性成分22 個(gè)，其中黃連14 個(gè)、厚樸8 個(gè)。如圖2、3 所示，共預(yù)測(cè)出260 個(gè)靶點(diǎn)，將篩選的黃連-厚樸活性成分靶點(diǎn)與UC差異基因靶點(diǎn)取交集，得到49 個(gè)共同靶點(diǎn)。

表2 黃連-厚樸的活性成分Table 2 Active components of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex

圖2 黃連-厚樸活性成分靶點(diǎn)與UC 差異基因靶點(diǎn)的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of targets of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex active components and UC differential genes

2.1.3 GO 功能和KEGG 通路富集分析 GO 功能富集分析如圖4 所示，生物過(guò)程（biological process，BP）主要集中在對(duì)細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞程序性死亡的正向調(diào)節(jié)等；細(xì)胞 組成（cellular component，CC）主要集中在細(xì)胞膜、肥大細(xì)胞顆粒、基底外側(cè)質(zhì)膜等；分子功能（molecular function，MF）主要表現(xiàn)在碳酸鹽脫水酶活性、蛋白激酶活性、氧化還原酶活性等。KEGG通路富集分析如圖5 所示，主要參與過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）信號(hào)通路、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和PI3K-Akt 信號(hào)通路等。

2.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平和MPO 活性的影響 如表3所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平和MPO 活性顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平和MPO 活性顯著降低（P＜0.01），尤其以黃連-厚樸配伍組最佳，提示黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠的抗炎作用優(yōu)于單用黃連、厚樸。

2.2.2 黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠結(jié)腸質(zhì)量/長(zhǎng)度、脾臟指數(shù)和CMDI 評(píng)分的影響 如表4 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸質(zhì)量/長(zhǎng)度、脾臟指數(shù)和CMDI 評(píng)分均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組結(jié)腸質(zhì)量/長(zhǎng)度、脾臟指數(shù)和CMDI評(píng)分均顯著降低（P＜0.01），尤其以黃連-厚樸配伍組最佳，提示黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠結(jié)腸黏膜的保護(hù)作用優(yōu)于單用黃連、厚樸。

圖3 黃連-厚樸活性成分靶點(diǎn)與UC 特征性基因靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of targets of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex active components and UC characteristic genes

圖4 GO 功能富集分析Fig.4 GO function enrichment analysis

圖5 KEGG 通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

表3 黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平和MPO 活性的影響 ( ± s , n=8)Table 3 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on IL-1β, IL-6, TNF-α levels and MPO activity in serum of UC rats ( ± s , n=8)

表3 黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平和MPO 活性的影響 ( ± s , n=8)Table 3 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on IL-1β, IL-6, TNF-α levels and MPO activity in serum of UC rats ( ± s , n=8)

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01，下表同##P < 0.01 vs control group; **P < 0.01 vs model group, same as below tables

組別 劑量/(g·kg?1) IL-1β/(pg·mL?1) IL-6/(pg·mL?1) TNF-α/(pg·mL?1) MPO/(U·L?1) 對(duì)照 — 447.56±31.04 23.84±1.92 184.50±14.80 306.20±46.31 模型 — 865.38±15.48## 57.93±2.76## 389.28±17.91## 675.79±42.78## 黃連 2 577.95±26.93** 34.89±3.50** 275.14±25.03** 450.71±59.64** 厚樸 2 585.65±26.93** 38.10±3.13** 295.30±15.35** 502.74±34.04** 黃連-厚樸配伍 4 537.26±45.96** 31.72±3.05** 249.44±25.19** 394.63±19.20** 柳氮磺胺吡啶 0.4 623.49±32.17** 45.41±3.21** 318.04±14.72** 546.85±38.44**

表4 黃連-厚樸對(duì)UC 大鼠結(jié)腸質(zhì)量/長(zhǎng)度、脾臟指數(shù)和CMDI 評(píng)分的影響 ( ± s , n=8)Table 4 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on colon weight/length, spleen index and CMDI score in UC rats ( ± s , n=8)

表4 黃連-厚樸對(duì)UC 大鼠結(jié)腸質(zhì)量/長(zhǎng)度、脾臟指數(shù)和CMDI 評(píng)分的影響 ( ± s , n=8)Table 4 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on colon weight/length, spleen index and CMDI score in UC rats ( ± s , n=8)

組別 劑量/(g·kg?1) 結(jié)腸質(zhì)量/長(zhǎng)度/(g·cm?1) 脾臟指數(shù)/% CMDI 評(píng)分 對(duì)照 — 0.12±0.01 0.18±0.04 0.25±0.46 模型 — 0.25±0.04## 0.32±0.04## 5.75±0.46## 黃連 2 0.14±0.01** 0.24±0.02** 2.25±0.46** 厚樸 2 0.15±0.02** 0.25±0.02** 2.38±0.52** 黃連-厚樸配伍 4 0.13±0.01** 0.24±0.04** 1.75±0.46** 柳氮磺胺吡啶 0.4 0.14±0.02** 0.25±0.02** 2.63±1.19**

2.2.3 黃連-厚樸配伍對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織病理變化的影響 如圖6 所示，對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織腺體排列整齊，組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)充血、壞死和水腫等組織病理?yè)p傷變化；模型組大鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)嚴(yán)重腸上皮損傷、隱窩萎縮或缺失，黏膜壞死，壞死區(qū)域原有組織結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞水腫并伴有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；各給藥組大鼠結(jié)腸組織上皮損傷和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，隱窩炎、組織水腫和壞死現(xiàn)象改善，其中黃連-厚樸配伍組大鼠結(jié)腸組織僅出現(xiàn)輕度的腸上皮損傷和少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。如表5 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠組織病理?yè)p傷評(píng)分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組組織病理?yè)p傷評(píng)分顯著降低（P＜0.01），尤其以黃連-厚樸配伍組最佳，提示黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠結(jié)腸黏膜的保護(hù)作用優(yōu)于單用黃連、厚樸。

圖6 黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠結(jié)腸組織病理變化的影響 (HE, ×100)Fig.6 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on colonic pathological changes in UC rats (HE, × 100)

表5 黃連-厚樸配伍對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織病理?yè)p傷評(píng)分的影響 ( ± s , n=5)Table 5 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on pathological damage score of colon in UC rats ( ± s , n=5)

表5 黃連-厚樸配伍對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織病理?yè)p傷評(píng)分的影響 ( ± s , n=5)Table 5 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on pathological damage score of colon in UC rats ( ± s , n=5)

組別 劑量/(g·kg?1) 組織病理?yè)p傷評(píng)分 對(duì)照 — 0.80±0.25 模型 — 5.80±0.12## 黃連 2 3.00±0.16** 厚樸 2 4.00±0.16** 黃連-厚樸配伍 4 2.80±0.25** 柳氮磺胺吡啶 0.4 2.90±0.29**

2.2.4 黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠結(jié)腸組織PI3K、Akt 和cleaved Caspase-3 表達(dá)的影響 如圖7～9 和表6 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠PI3K、Akt、cleaved Caspase-3 陽(yáng)性表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠PI3K、Akt、cleaved Caspase-3 陽(yáng)性表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。

圖7 黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠結(jié)腸組織PI3K 表達(dá)的影響 (×400)Fig.7 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on PI3K expression in colon of UC rats (× 400)

2.2.5 黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠結(jié)腸組織p-Akt、Bcl-2 和cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)的影響 如圖10 和表 7 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠p-Akt/Akt 和cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠p-Akt/Akt 和cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。

3 討論

UC 是一種慢性非特異性炎性疾病[16]，主要病理特征為結(jié)腸黏膜的炎性反應(yīng)[17]，其病因可能與遺傳、免疫、環(huán)境刺激等多種因素有關(guān)[18-20]。治療UC的主要藥物包括5-氨基水楊酸藥物、類固醇和免疫抑制劑等[21-22]，但長(zhǎng)期使用不良反應(yīng)大且費(fèi)用昂貴，因此需要尋找新的治療策略。黃連-厚樸配伍源自《普濟(jì)方》中的“黃連厚樸湯”，方中僅有黃連、厚樸2 味藥，對(duì)胃腸道疾病具有確切的療效。本研究結(jié)果顯示，黃連、厚樸單獨(dú)或配伍使用均能夠顯著降低TNBS 誘導(dǎo)的UC 大鼠結(jié)腸質(zhì)量/長(zhǎng)度、CMDI評(píng)分、脾臟指數(shù)和組織病理評(píng)分，且黃連-厚樸配伍療效最佳。本研究結(jié)合基因組學(xué)和生物信息學(xué)分析方法，構(gòu)建生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)的集成模型，從全基因組層面和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)層面對(duì)藥物與疾病相互關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)全面的分析[23]，從而闡明黃連-厚樸配伍對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的UC 大鼠的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，通過(guò)GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)篩選活動(dòng)性UC 與健康人結(jié)腸組織之間的差異表達(dá)基因，共確定了794 個(gè)上調(diào)的差異表達(dá)基因和449 個(gè)下調(diào)的差異表達(dá)基因；KEGG 通路富集分析顯示，黃連-厚樸配伍主要通過(guò)作用于PPAR 信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路和PI3K/Akt 信號(hào)通路治療UC。

圖8 黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠結(jié)腸組織Akt 表達(dá)的影響 (×400)Fig.8 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on Akt expression in colon of UC rats (× 400)

圖9 黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠結(jié)腸組織cleaved Caspase-3 表達(dá)的影響 (×400)Fig.9 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on cleaved Caspase-3 expression in colon of UC rats (× 400)

表6 黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠結(jié)腸組織PI3K、Akt 和cleaved Caspase-3 表達(dá)的影響 ( ± s, n = 3)Table 6 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on expressions of PI3K, Akt and cleaved Caspase-3 in colon of UC rats ( ± s, n = 3)

表6 黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠結(jié)腸組織PI3K、Akt 和cleaved Caspase-3 表達(dá)的影響 ( ± s, n = 3)Table 6 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on expressions of PI3K, Akt and cleaved Caspase-3 in colon of UC rats ( ± s, n = 3)

組別 劑量/(g·kg?1) A 值 PI3K Akt cleaved Caspase-3 對(duì)照 — 1.13±0.80 2.21±0.16 0.54±0.05 模型 — 10.03±1.67## 7.77±0.68## 2.81±0.55## 黃連 2 4.13±0.98** 4.11±0.05** 1.61±0.18** 厚樸 2 5.00±0.53** 5.02±0.33** 2.10±0.10** 黃連-厚樸配伍 4 2.42±0.11** 3.09±0.40** 1.11±0.08** 柳氮磺胺吡啶 0.4 4.18±0.78** 4.13±1.09** 1.81±0.13**

圖10 黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠結(jié)腸組織p-Akt、Bcl-2 和cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)的影響Fig.10 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on expressions of p-Akt, Bcl-2 and cleaved Caspase-3 proteins in colon of UC rats

表7 黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠結(jié)腸組織p-Akt、Bcl-2 和cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)的影響 ( ± s , n=6)Table 7 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on expressions of p-Akt, Bcl-2 and cleaved Caspase-3 proteins in colon of UC rats ( ± s , n=6)

表7 黃連-厚樸配伍對(duì)UC 大鼠結(jié)腸組織p-Akt、Bcl-2 和cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)的影響 ( ± s , n=6)Table 7 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on expressions of p-Akt, Bcl-2 and cleaved Caspase-3 proteins in colon of UC rats ( ± s , n=6)

組別 劑量/(g·kg?1) 蛋白相對(duì)表達(dá)量 p-Akt/Akt Bcl-2/β-actin cleaved Caspase-3/β-actin 對(duì)照 — 0.21±0.08 7.63±1.66 0.23±0.12 模型 — 1.00±0## 1.00±0## 1.00±0## 黃連 2 0.46±0.19** 2.41±0.59** 0.28±0.07** 厚樸 2 0.54±0.22** 3.99±1.90** 0.26±0.13** 黃連-厚樸配伍 4 0.28±0.12** 7.38±2.23** 0.19±0.07** 柳氮磺胺吡啶 0.4 0.24±0.14** 4.79±1.84** 0.11±0.14**

炎性細(xì)胞因子的釋放和中性粒細(xì)胞的分泌是UC 的重要特征，常用于評(píng)估UC 的疾病活動(dòng)[24]。促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6 和IL-1β 的分泌在UC的發(fā)展中起著重要作用[25]。本研究結(jié)果顯示，黃連、厚樸單用及配伍均能夠顯著抑制UC 大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 水平和MPO 活性，且黃連-厚樸配伍療效最佳，表明黃連-厚樸配伍能夠抑制促炎細(xì)胞因子和相關(guān)炎性標(biāo)志物的表達(dá)。細(xì)胞因子的釋放與PI3K/Akt 信號(hào)通路密切相關(guān)[26-27]。PI3K 由催化結(jié)構(gòu)域P110 和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域P85 組成，活化后進(jìn)一步磷酸化Akt，從而發(fā)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[28-30]。本研究結(jié)果顯示，黃連、厚樸單用及配伍能夠抑制大鼠結(jié)腸組織中PI3K、Akt 的陽(yáng)性表達(dá)，并抑制p-Akt 蛋白表達(dá)水平。PI3K/AKT 參與細(xì)胞凋亡、自噬和增殖等多種生物學(xué)過(guò)程[31-32]。本研究結(jié)果顯示，黃連、厚樸單用及配伍能夠上調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)水平，降低cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平，從而發(fā)揮抗凋亡作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)黃連、厚樸單用或配伍使用能夠通過(guò)抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路，從而發(fā)揮對(duì)UC 大鼠的腸黏膜保護(hù)、抗炎和抗凋亡作用，其中黃連-厚樸配伍療效最佳，體現(xiàn)了中藥“相使”增效的配伍關(guān)系。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突