何 瀟 劉 興 辛正琦 謝海艷 辛余鳳 吳能表,*

半夏基因的克隆、表達(dá)與酶動(dòng)力學(xué)分析

何 瀟1,2劉 興3辛正琦1,2謝海艷1,2辛余鳳1,2吳能表1,2,*

1西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重慶 400715;2三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715;3重慶市大足中學(xué), 重慶 402360

本研究以半夏為研究對象, 基于其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆獲得1個(gè)苯丙氨酸解氨酶基因, 命名為, 通過DNAMAN、MEGA等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)進(jìn)化分析表明, 該基因核酸序列長度為2289 bp, 編碼762個(gè)氨基酸, 終止密碼子為TAA, PtPAL與單子葉植物百合PAL相似度達(dá)78%, 具有PAL-HAL、PLN02457、phe_am_lyase、Lyase_aromatic及HutH結(jié)構(gòu)域, 屬于苯丙氨酸解氨酶家族成員(Lyase_I_like Superfamily)。半夏PtPAL與單子葉植物百合、菠蘿和油棕親緣關(guān)系較近, 歸于單子葉植物。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析在不同組織間的表達(dá)情況表明,基因在葉中表達(dá)量最高, 其次是塊莖和根, 花中表達(dá)量最低。通過對半夏基因進(jìn)行功能表達(dá)分析發(fā)現(xiàn), PtPAL重組蛋白可以高效催化L-Phe生成-CA, 且催化反應(yīng)最適pH與溫度分別為9.0、70℃; PtPAL的m、max、cat和cat/m分別為0.89 mmol L-1、63.96 nKat mg–1、6.56 s–1和7.37×103s–1M–1。進(jìn)一步探究金屬離子對PtPAL酶活性的影響表明, Ba2+顯著增強(qiáng)了PtPAL酶活性, Mn2+、Co2+、Cu2+及Zn2+抑制了PtPAL酶活性。本研究為進(jìn)一步研究的功能特點(diǎn)及半夏苯丙胺類生物堿代謝途徑奠定基礎(chǔ)。

半夏; 麻黃堿; 苯丙氨酸解氨酶; 基因克隆; 表達(dá)分析; 酶動(dòng)力學(xué)分析

半夏源于天南星科植物半夏()的干燥塊莖, 屬于多年生草本植物, 是我國傳統(tǒng)中藥材, 其藥用功效為燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)半夏含有眾多化學(xué)成分, 主要包括生物堿、黃酮類、甾醇類、揮發(fā)油、芳香族成分、有機(jī)酸類、半夏蛋白、鞣質(zhì)以及多種微量元素等, 其中, 生物堿為半夏藥理作用的主要有效成分之一[1]。麻黃堿是半夏生物堿的主要活性成分, 屬于苯丙胺類生物堿, 因具有止喘、增加心輸出量、興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用及升血壓緩慢、溫和的特點(diǎn), 而具有較高的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值[2-3]。從代謝合成途徑看, 植物麻黃堿生物合成屬于苯丙氨酸代謝途徑, 其前體物質(zhì)為L-苯丙氨酸(L-Phe), 但其生物合成機(jī)制并未完全研究清楚, 因此, 研究苯丙烷類代謝途徑, 對研究半夏麻黃堿合成代謝機(jī)制具有重要意義, 而研究代謝途徑上的關(guān)鍵酶基因又是重要步驟之一。

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)是催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的酶, 催化L-苯丙氨酸(L-Phe)生成反式-肉桂酸(-CA)和氨, 再進(jìn)一步代謝轉(zhuǎn)化為一系列苯丙素類化合物, 如黃酮體、木質(zhì)素、生物堿等; 此外, 也是聯(lián)系初級代謝和次級代謝的限速酶和關(guān)鍵酶[4]。自1961年Koukol和Conn在高等植物、1966年在微生物首次分離純化PAL以來, 該酶引起了人們廣泛研究, 至今已從裸子、被子、苔蘚、蕨類等植物和真菌中分離得到大量的PAL家族基因[5]。目前針對PAL家族基因的結(jié)構(gòu)、編碼信息及功能已得到廣泛研究。研究表明, PAL作為一個(gè)基因家族, 其數(shù)量因物種不同而存在差異[6-7]; PALDNA序列也相對保守, 在多數(shù)植物中僅由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成; 其編碼的蛋白酶分子量大小約為275~330 kD, 亞基分子量大小為55~88 kD[8], 多數(shù)植物PAL上包含PAL-HAL、PLN02457、phe_am_lyase和Lyase_aromatic保守結(jié)構(gòu)域, 少部分植物PAL包含HutH結(jié)構(gòu)域, 但PAL 酶活性位點(diǎn)主要位于PAL-HAL結(jié)構(gòu)域上。PAL催化L-Phe脫氨生成反式肉桂酸(-CA)屬于非氧化還原反應(yīng)。在大多數(shù)雙子葉植物中, L-phe是PAL的最適底物, 而在一些單子葉植物和酵母中PAL還可以催化L-酪氨酸(L-Tyr)形成對香豆酸[9]。Yu等[10]在大腸桿菌中異源表達(dá)附生苔草(liverwort) PAL重組蛋白表明, PaPAL催化L-Phe轉(zhuǎn)化為-CA具有較高的酶活性, 而在催化L-Tyr形成對香豆酸時(shí)表現(xiàn)出的酶活性較低。Ma等在對五倍子RcPAL的最適底物研究中發(fā)現(xiàn), 將Phe126突變?yōu)镠is126后, 導(dǎo)致RcPAL酶活性降低了75%, 但TAL酶活性卻增加了22倍, 這進(jìn)一步為L-Phe是PAL的最適底物提供了直接證據(jù)。PAL家族基因的表達(dá)一方面受植物體內(nèi)自身代謝產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié), 一方面受外界因子如病原菌、溫度、重金屬、機(jī)械損傷、及外源植物激素等生物和非生物脅迫的誘導(dǎo)。高濃度-CA抑制了銀杏[11]和山藥()[12]PAL活性, 一定濃度的阿魏酸抑制了山藥PAL活性。玉米絲黑穗病菌可以導(dǎo)致玉米PAL活性升高[13], 美洲南瓜() PAL受灰霉病菌誘導(dǎo)表達(dá)[14]; PAL在黃芩中參與脅迫誘導(dǎo)黃酮類化合物的合成[15]。外源噴施植物激素茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、脫落酸(abscisic acid, ABA)及水楊酸(salicylic acid, SA)后, 植物PAL表達(dá)量也增加[16-17]。盡管目前PAL家族基因已經(jīng)在多類植物中得到克隆分析, 但半夏中尚未見報(bào)道。本研究以半夏為試驗(yàn)材料, 根據(jù)半夏轉(zhuǎn)錄組測序, 通過RT-PCR方法首次成功克隆得到半夏基因, 經(jīng)過生物學(xué)信息分析、組織表達(dá)分析以及酶動(dòng)力學(xué)分析, 旨在為后續(xù)深入研究基因功能以及研究半夏麻黃堿代謝途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試半夏塊莖購自湖北荊州, 經(jīng)西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院吳能表教授鑒定為半夏()。選取生長健壯且大小一致的半夏塊莖, 經(jīng)自來水流水沖洗干凈后, 種植于盛有河沙的培養(yǎng)盆里進(jìn)行萌芽, 期間保持河沙濕潤。待萌芽后, 挑選長勢基本一致的幼苗移栽至盛有沙質(zhì)土壤(土壤∶河沙=3∶1)的營養(yǎng)缽中, 每缽3株, 培養(yǎng)至60 d用于試驗(yàn)分析。培養(yǎng)條件: 溫度25℃, 光照強(qiáng)度為80~220 μmol m-2s-1, 置于光照時(shí)間16 h/8 h (光/暗)人工氣候室進(jìn)行培養(yǎng)。取60 d齡半夏幼苗的根、塊莖、葉和花于液氮中迅速冷凍, 置于–80℃冰箱凍存?zhèn)溆? 用于半夏組織特異性分析。

1.2 試劑

Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、Dnase I酶購于北京貝洛生物科技有限公司; RNA PCR Kit (AMV) ver 3.0逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ex聚合酶、PrimeSTAR Max高保真酶、pMD19-T Vector載體均購于TaKaRa (大連)有限公司; DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購于Axygen公司; Hiafair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix for qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Hieff TM qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒均購于上海翊圣生物科技有限公司; 由Invitrogen公司合成PCR引物; 由擎科生物技術(shù)有限公司完成DNA測序。

1.3 半夏總RNA提取和cDNA合成

取適量半夏組織樣品于液氮中研磨成細(xì)粉, 按照Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(Cat#BSC65S1)的使用說明提取半夏總RNA, 用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性, 并用Thermo Nanodrop 2000C超微量分光光度計(jì)檢測RNA的濃度和純度, 合格RNA置于–80℃保存?zhèn)溆?。參照TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) 3.0 (RR019A)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書, 以提取的總RNA為模板, 反轉(zhuǎn)錄合成第1條互補(bǔ)鏈cDNA。

1.4 半夏PtPAL基因擴(kuò)增和克隆

在半夏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中本地BLASTP基因中, 以擬南芥模式植物的基因家族保守序列為參考, 篩選出1個(gè)含完整讀碼框的候選unigene基因并命名為。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物(表1)。以半夏cDNA為模板, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 切膠回收與pMD19-T vector連接, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中, 菌落經(jīng)PCR檢測為陽性后, 送擎科生物科技有限公司測序。

表1 本研究所用引物

1.5 半夏PtPAL基因生物學(xué)信息分析

利用DNAMAN 8.0軟件將測序所得的編碼區(qū)序列翻譯成氨基酸序列, 在InterProScan軟件中進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析和ORF Finder查找基因的完整開放閱讀框(open reading frame, ORF)。采用ExPASy提供的在線工具ProtParam預(yù)測PtPAL蛋白的理化性質(zhì)。在SOPMA軟件上進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。采用SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)同源建模。根據(jù)NCBI BLASTP的比對結(jié)果, 找出同源性較高的其他物種的氨基酸序列, 在DNAMAN 8.0軟件上進(jìn)行氨基酸多重序列比對, 并用MEGA 5.05軟件采用鄰接法(neighbor joining method, NJ) (bootstrap 1000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRFPCR)

同上方法提取半夏葉、塊莖、根和花的總RNA, 參照Hiafair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 同時(shí)進(jìn)行qPCR反應(yīng)。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物(表1), 以半夏為內(nèi)參基因, 使用Bio-Rad IQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)檢測。所有處理均設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 根據(jù)2–ΔΔCt法分析基因的相對表達(dá)量, 使用SPSS 22.0軟件分析顯著性, 采用GraphPad Prism 7.0軟件繪圖。

1.7 半夏PtPAL基因原核表達(dá)

通過對基因編碼區(qū)序列的限制酶切位點(diǎn)和pET32a(+)原核表達(dá)載體上的多克隆酶切位點(diǎn)進(jìn)行SnapGene軟件分析, 選擇dIII和I作為酶切位點(diǎn)進(jìn)行載體構(gòu)建, 引物序列見表1。將pET32a(+)-重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá), 經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測分析蛋白表達(dá)情況; 根據(jù)Proteinlso Ni-NTA Resin (北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書進(jìn)行半夏PtPAL重組蛋白Ni柱純化, 采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法), 按照Easy Protein Quantitative Kit (北京全式金生物技術(shù)有限公司)的操作說明繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定蛋白濃度。

1.8 半夏PtPAL重組蛋白酶活性鑒定

配置不同pH值的0.1 mol L-1硼酸緩沖液和100 μL 0.01 mol L-1L-Phe (溶于0.1 mol L-1硼酸緩沖液, pH 9.0), 對照組為1 mL 0.1 mol L-1硼酸緩沖液(pH 9.0)進(jìn)行PtPAL重組蛋白催化反應(yīng)最適pH測定, 于紫外可見分光光度計(jì)290 nm處測定其吸光值; 在上述最適pH值條件下, 測定PtPAL重組蛋白在不同溫度下的OD290值。每個(gè)樣品重復(fù)3次, 分別制作酶活性隨pH、溫度變化曲線, 將最高酶活定義為100%,計(jì)算不同pH與溫度下PtPAL的相對活力。在0.1 mol L-1硼酸緩沖液(pH 9.0)中, 通過加入不同濃度的L-Phe為底物, 加入100 μL (約10 μg) PtPAL重組蛋白, 總體積為1 mL, 在70℃和37℃下反應(yīng)5 min, 測定PtPAL酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 半夏PtPAL基因克隆

根據(jù)擬南芥、玉米及煙草等植物基因編碼的氨基酸序列, 利用BioEdit軟件進(jìn)行本地BLASTP檢索, 從半夏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出1個(gè)含完整讀碼框的候選unigene基因, 再利用NCBI中的BLASTX進(jìn)行序列比對分析, 確定其為半夏基因。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)出特異性引物, 以半夏葉和塊莖的cDNA為模板, 進(jìn)行擴(kuò)增, 得到一條主帶, 大小為2289 bp, 與預(yù)期目的條帶大小一致。

2.2 半夏PtPAL基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 半夏核酸序列分析 經(jīng)分析測序獲得半夏基因的核酸序列(圖1)?；虼笮?289 bp, 編碼762個(gè)氨基酸, 終止密碼子為TAA, 預(yù)測蛋白分子量為83.44 kD, 蛋白理論等電點(diǎn)(pI)為6.42。

2.2.2 半夏PtPAL氨基酸序列多重比對與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 通過NCBI的BLASTR對PtPAL氨基酸序列進(jìn)行在線同源比對分析發(fā)現(xiàn), PtPAL與大多數(shù)植物的PAL氨基酸序列具有較高的相似性, 相似度達(dá)58%~78%。從中選擇相似度較高的百合、葡萄和銀杏等植物的PAL氨基酸序列與PtPAL氨基酸序列進(jìn)行多重比對(圖2)發(fā)現(xiàn), 半夏PtPAL與單子葉植物百合PAL氨基酸序列相似度最高, 為78%; 其次, 與雙子葉植物葡萄PAL氨基酸序列相似度也較高, 為75%; 與裸子植物銀杏、蕨類植物問荊以及苔蘚植物背苔的相似度分別為58%、66%、59%。然后, 對PtPAL做進(jìn)一步的保守結(jié)構(gòu)域和活性位點(diǎn)分析表明, PtPAL具有PAL-HAL、PLN02457、phe_am_lyase、Lyase_aromatic及HutH結(jié)構(gòu)域, 屬于解氨酶類家族(Lyase_I_like Superfamily)。研究發(fā)現(xiàn), PtPA具有保守的酶活性中心序列(GTITASGDLVPLSYIAG, 209~ 225 aa), 其中包含高度保守的Ala-Ser-Gly氨基酸三聯(lián)體(213~215 aa), 除與百合存在1個(gè)氨基酸殘基差異外, 與擬南芥、葡萄、銀杏和白及等植物的酶活性中心序列一致[17]。此外, PtPAL還含有保守活性位點(diǎn)(Y124、F151、L152、N270、Q358、Y361、R364、F410、Q497), 與背苔和歐芹報(bào)道中的一致[18], 說明PtPAL是苯丙氨酸解氨酶家族成員。

本研究從NCBI中收集到17條完整的PAL氨基酸序列, 其中包括麻風(fēng)樹、油棕、馬尾松及白樺等植物, 通過MEGA 5.05軟件中Clustal W進(jìn)行氨基酸序列比對, 采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,對半夏進(jìn)行聚類分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 可大致將來源于18種不同物種的PAL氨基酸序列分為5類(圖3), 分別為雙子葉植物、單子葉植物、蕨類植物、苔蘚植物以及裸子植物; 本研究中克隆的半夏PtPAL歸于單子葉植物一類, 且與單子葉植物菠蘿、百合和油棕的PAL氨基酸序列遺傳距離最短。

2.2.3 半夏PtPAL蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測 運(yùn)用SOPMA對半夏PtPAL蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn), PtPAL包含53.41% α-螺旋(alpha helix)、6.43% β-轉(zhuǎn)角(beta turn)、8.53%延伸鏈(extended strand)和31.63%無規(guī)則卷曲(random coil), 表明PtPAL蛋白主要以α-螺旋為形式的二級結(jié)構(gòu)。

采用同源建模的方法, 在SWISS-MODEL在線軟件中進(jìn)行PtPAL蛋白的三維結(jié)構(gòu)建模, PtPAL蛋白以雙子葉植物歐芹PcPAL (PDB:1w27)[19]的晶體結(jié)構(gòu)為模版, 如圖4所示。建模覆蓋范圍為70~713位氨基酸殘基, PtPAL與PcPAL氨基酸序列同源性為61.79%。PtPAL的單個(gè)亞基呈“海馬”狀, 由MIO域(MIO domain)、中心區(qū)域(core domain)及可插入屏蔽區(qū)域(inserted shielding domain) 3個(gè)部分組成(圖4-A)。已有研究表明, PAL是由4個(gè)相同亞基構(gòu)成的同源四聚體蛋白; 而本研究中同源建模分析結(jié)果顯示, PtPAL與歐芹PcPAL均是由4個(gè)相同亞基構(gòu)成的同源四聚體, 且每個(gè)亞基與其他2個(gè)亞單位以頭尾相連的方式結(jié)合, 從而增加相鄰亞基間的相互作用, 產(chǎn)生緊密結(jié)合地同源四聚體(圖4-B)。另外, PtPAL含有植物中高度保守的Ala-Ser-Gly (ASG)氨基酸三聯(lián)體, ASG氨基酸三聯(lián)體可以通過自身環(huán)化脫水而自動(dòng)轉(zhuǎn)化為MIO作為PAL的重要輔助因子發(fā)揮作用, 進(jìn)一步說明PtPAL屬于苯丙氨酸解氨酶家族。

編碼區(qū)核酸序列和翻譯的氨基酸序列用大寫字母表示。終止密碼子用*表示, 起始密碼子和終止密碼子用橫線表示。

The coding sequence and the deduced amino acid sequence are shown in uppercase letters in bold. Termination code is denoted by the asterisk; initiation code and termination code are denoted by underlines.

一致氨基酸殘基用白色字體黑色背景表示, 保守氨基酸殘基用黑色字體紅色背景表示。保守的Ala-Ser-Gly催化三聯(lián)體用表示實(shí)心三角, 其他保守活性位點(diǎn)用空心三角表示, 保守活性基序用紅色方框表示。AtPAL: 擬南芥(NP_187645.1); VvPAL: 葡萄(RVW44079.1); LrPAL: 百合(ASV46344.1); GbPAL: 銀杏(ABU49842.1); EaPAL: 問荊(AAW80639.1); PaPAL: 背苔(AIU99853.1)。

The identical amino acids are shown in white with black background, the conserved amino acids are shown in black with red background. The conserved active site motif (Ala-Ser-Gly) is indicated by ?lled triangles under the sequences, the other active site residues are indicated by open triangle asterisk, the conserved active site motif is denoted by red box. AtPAL:(NP_187645.1); VvPAL:(RVW44079.1); LrPAL:(ASV46344.1); GbPAL:(ABU49842.1); EaPAL:(AAW80639.1); PaPAL:(AIU99853.1).

2.3 半夏PtPAL基因組織表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)(qRTPCR), 以半夏作為內(nèi)參基因, 對基因進(jìn)行組織表達(dá)譜分析(圖5): 在轉(zhuǎn)錄水平上,基因在葉中大量表達(dá), 其次在塊莖、根中有少量表達(dá), 在花中表達(dá)量相對較微弱。

各節(jié)點(diǎn)處數(shù)值表示Bootstrap值百分比(重復(fù)1000次)。半夏PtPAL用紅色點(diǎn)表示。

The number of each interior Branch is the percentage of bootstraps value (1000 replicates). PtPAL is denoted by red dot.

A: 單體; B: 同源四聚體。MIO: 3,5-二氫-5-亞甲基-4H-咪唑-4-酮。

A:monomer; B:homotetramer. MIO: 3,5-dihydro-5-methylene-4H-imidazol-4-one.

不同小寫字母表示不同組織間在0.05水平差異顯著。

Values with different lowercase letters show significant difference among different tissues at the 0.05 probability level.

2.4 半夏PtPAL基因原核表達(dá)和分離純化

以pET32a(+)載體作為原核表達(dá)載體, 通過在大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行異源表達(dá)PtPAL重組蛋白, 獲得分子量大小(MW)為102.3 kD的融合His標(biāo)簽的PtPAL重組蛋白。將BL21-pET32a(+)-工程菌誘導(dǎo), 經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測, 結(jié)果如圖6-A所示: 在1 h時(shí), PtPAL在102 kD大小位置上有明顯加粗的條帶; 隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長, 條帶逐漸加粗。說明有目的蛋白產(chǎn)生且隨誘導(dǎo)時(shí)間逐漸增加, 表明PtPAL重組蛋白可以被誘導(dǎo)。采用Ni-NTA親和層析柱純化, 用不同咪唑濃度的PBS平衡緩沖液進(jìn)行洗脫, 收集蛋白, 經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn), PtPAL重組蛋白在150 mmol L-1咪唑濃度洗脫時(shí), 目的蛋白較多而雜蛋白較少且純化的PtPAL重組蛋白約為102.3 kD (圖6-B)。

M為蛋白marker。A: PtPAL重組蛋白時(shí)間梯度誘導(dǎo)表達(dá); B: 融合His標(biāo)簽PtPAL重組蛋白純化。

M: protein molecular weight standards. A: time gradient induced of reconstructive PtPAL; B: the purified His-tagged PtPAL.

2.5 半夏PtPAL重組蛋白活性鑒定

2.5.1 半夏PtPAL重組蛋白功能鑒定 已知PAL催化L-Phe脫氨形成反式肉桂酸(-CA)。通過LC-MS檢測PtPAL反應(yīng)對照樣品、反應(yīng)樣品和反式肉桂酸的分析標(biāo)準(zhǔn)品(圖7)發(fā)現(xiàn), 藍(lán)色峰線為反式肉桂酸標(biāo)品, 保留時(shí)間為22.638 min; 紅色峰線為反應(yīng)樣品, 保留時(shí)間為22.630 min, 與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間基本一致; 黑色蜂線為反應(yīng)對照樣品, 無明顯波峰, 即無反式肉桂酸生成。表明PtPA催化L-Phe生成了-CA。

2.5.2 半夏PtPAL重組蛋白催化反應(yīng)最適條件和酶動(dòng)力學(xué)分析 為探究半夏PtPAL重組蛋白催化反應(yīng)的最適條件, 本研究在不同pH值與不同溫度條件下分別測定PtPAL催化活性。PtPAL催化活性在pH為7.4~9.8范圍內(nèi)先升高后下降, 且當(dāng)pH為9時(shí), 催化活性最大, 即為最適pH (圖8-A)。當(dāng)溫度在30~70℃之間時(shí), PtPAL活性呈逐漸升高的趨勢; 當(dāng)溫度大于70℃時(shí), PtPAL活性逐漸降低; 而PtPAL在溫度為90℃時(shí), 基本完全失活(圖8-B)。

在pH為9.0和溫度為70℃、37℃的條件下, 通過測定PtPAL對底物L(fēng)-Phe酶動(dòng)力學(xué)參數(shù), 擬合PtPAL的米曼氏動(dòng)力學(xué)曲線(圖9), 再計(jì)算得到酶動(dòng)力學(xué)參數(shù), 最后與其他物種的PAL酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行比對分析(表2)發(fā)現(xiàn), 最適溫度70℃下, PtPALm為0.89 mmol L-1,max為63.96 nKat mg-1,cat為6.56 s-1,cat/m為7.37×103s-1M-1; 當(dāng)反應(yīng)溫度為37℃時(shí), PtPALm為0.80 mmol L-1,max為37.67 nkat mg-1,cat為3.75 s-1,cat/m為4.69×103s-1M-1; 且較于其他物種, PtPAL的m較大, 但從catm參數(shù)來看, PtPAL對L-Phe的催化效率較高。

藍(lán)色、紅色和黑色峰圖分別表示反式肉桂酸標(biāo)品、反應(yīng)樣品、反應(yīng)對照樣品。

The blue, red, and black peak maps arecinnamic acid standard, reaction, and control reaction sample, respectively.

A: 不同pH下PtPAL催化活性測定; B: 不同溫度下PtPAL催化活性測定。誤差線表示生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差(= 3)。

A: the activity of PtPAL under changing pH levels; B: the activity of PtPAL across a range of temperatures. Bars indicate the standard errors of the means (= 3).

表2 不同植物PAL酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

Es: 草麻黃; Bo: 綠竹; Cd: 肉蓯蓉; Rg: 黏紅酵母; Rc: 五倍子。

Es, Sv, Rg, Cd, and Rc are,,JN-1,, and, respectively.

誤差線表示生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差(= 3)。

Bars indicate the standard errors of the means (= 3).

2.5.3 金屬離子對PtPAL重組蛋白酶活性影響

本研究通過添加不同外源金屬鹽離子, 探究金屬離子對催化活性的影響(圖10)發(fā)現(xiàn), Na+、K+、Ca2+對PtPAL催化活性的沒有顯著影響; Ba2+對PtPAL催化活性具有顯著的激活作用, 相對酶活性達(dá)到110.20%; Mg2+、Mn2+、Co2+、Zn2+及Cu2+金屬離子對PtPAL催化活性具有顯著的抑制作用。

**表示在0.01水平差異顯著。

**means significant difference at the 0.01 probability level.

3 討論

隨著人們對野生半夏的不斷挖掘、開發(fā)利用, 導(dǎo)致野生半夏資源幾近枯竭, 又因?yàn)橐吧胂闹猩飰A含量較低, 而市場需求有增無減[25], 麻黃堿是半夏生物堿的主要活性成分, 含量低, 化學(xué)合成復(fù)雜且成本高昂, 而苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物苯丙胺類生物堿生物合成途徑的第1個(gè)關(guān)鍵酶, 因此研究苯丙氨酸解氨酶(PAL)對進(jìn)一步探究麻黃堿生物合成途徑中的具有重要價(jià)值與意義。

本研究基于半夏轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果, 從半夏中成功克隆獲得1個(gè)基因, 編碼762個(gè)氨基酸, 具有PAL-HAL、PLN02457、phe_am_lyase、Lyase_ aromatic及HutH結(jié)構(gòu)域, 屬于苯丙氨酸解氨酶家族成員。研究表明, PAL是多基因家族, 一個(gè)染色體組中往往含有2~6個(gè)基因, 其基因個(gè)數(shù)因不同物種而不同; 但對已報(bào)道的不同物種中PAL家族基因進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn), 其具有較高的同源性[26]。通過氨酸序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹等分析表明, 半夏PtPAL與多種單子葉植物PAL聚為一類, 不與雙子葉植物、蕨類植物、苔蘚植物以及裸子植物PAL聚集在一起, 這符合植物分類學(xué)研究結(jié)果?；谕唇７?gòu)建的PtPAL蛋白結(jié)構(gòu)含有在苯丙氨酸解氨酶家族成員中高度保守的Ala-Ser-Gly (ASG)氨基酸三聯(lián)體及保守的脫氨位點(diǎn)(L、V、L、A)和催化活性位點(diǎn)(N、G、H、NDN及HNDQV), 與已報(bào)道的歐芹一樣, 表明PtPAL是苯丙氨酸解氨酶家族成員且可能具有催化苯丙氨酸(L-Phe)生成反式肉桂酸(-CA)的功能。

為進(jìn)一步鑒定PtPAL的功能, 在大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行異源表達(dá)發(fā)現(xiàn), PtPAL重組蛋白能夠高效地催化L-Phe生成-CA。在大腸桿菌中異源表達(dá)附生苔草PaPAL重組蛋白發(fā)現(xiàn), PaPAL催化L-Phe轉(zhuǎn)化為-CA具有較高的酶活性, 而在催化L-Tyr形成對香豆酸時(shí)表現(xiàn)出較低的酶活性[10]。Chen等[27]研究發(fā)現(xiàn), 在擬南芥中, AtPAL的最適底物是L-Phe, 當(dāng)?shù)孜飺Q成L-Tyr時(shí), AtPAL1、AtPAL2和AtPAL4催化效率極低, 然而AtPAL1對L-Tyr沒有酶活性。本研究中PtPAL并不能催化L-Tyr生成對香豆酸, 這說明半夏體內(nèi), PtPAL只具有催化L-Phe生成-CA的活性。對PtPAL進(jìn)行最適酶促反應(yīng)條件探究發(fā)現(xiàn), PtPAL催化反應(yīng)最適pH值為9.0, 介于研究已報(bào)道的PAL最適pH范圍內(nèi)[28-29]; PtPAL催化反應(yīng)最適溫度為70℃, 與已報(bào)道的油茶PAL最適溫度一致[30], 略高于其他已報(bào)道植物中PAL的最適溫度, 如擬南芥AtPAL2、AtPAL3最適溫度分別為48℃、31℃, 附生苔草PaPAL最適溫度為60℃, 表明物種不同, PAL的最適溫度也會(huì)不同, 在同一物種中, PAL家族不同成員的最適溫度也存在一定差異。酶動(dòng)力學(xué)分析表明, 在最適條件下, PtPAL催化L-Phe反應(yīng)m為0.89 mmol L-1,max為63.96 nKat mg-1,cat為6.56 s-1,cat/m為7.37×103s-1M-1。m參數(shù)顯示, PtPAL對底物L(fēng)-Phe的親和力較高, 但低于已報(bào)道的綠竹(BoPAL)[30]和酵母(RgPAL、RaPAL)[21]; 從catm來看, PtPAL對L-Phe的催化效率較高, 且高于草麻黃(EsPAL1、EsPAL2)、肉蓯蓉(CdPAL)。探究重金屬鹽離子對PtPAL酶活影響, 結(jié)果表明Ba2+顯著增強(qiáng)半夏PtPAL酶活。

PAL家族基因在不同植物組織中的表達(dá)模式已得到廣泛研究。胡永勝等[31]研究發(fā)現(xiàn), 丹參在根莖葉中都有表達(dá), 但在根中表達(dá)量最多, 其可能參與木質(zhì)素的合成; 劉俊頻等[32]從膜莢黃芪中克隆獲得、、基因, 其中在根中表達(dá)量最高, 與毛蕊異黃酮葡萄糖苷積累一致,也可能與毛蕊異黃酮葡萄糖苷的合成有關(guān); 李炳國等[33]研究發(fā)現(xiàn),在地黃葉中表達(dá)量明顯高于花和根中; 而基因在水稻中卻主要在莖中得以表達(dá)[34]。這說明基因在不同植物中具有表達(dá)部位特異性。在本研究中,基因在半夏葉中的表達(dá)量最高, 其次在塊莖與根中, 而一直以來, 半夏以塊莖用藥, 半夏塊莖也被認(rèn)為是生物堿合成主要器官, 這可能是因?yàn)槁辄S堿合成所需的前體物質(zhì)主要位于半夏葉片, 然后運(yùn)輸至塊莖中合成麻黃堿。綜上所述,可能在半夏葉中參與麻黃堿的生物合成, 為開展半夏麻黃堿工程提供候選基因。

4 結(jié)論

從半夏中克隆得到基因, 編碼762個(gè)氨基酸, 含有高度保守的Ala-Ser-Gly氨基酸三聯(lián)體, 與其他已報(bào)道的植物PAL具有較高的相似度?；蛟诎胂娜~中表達(dá)量較高, 塊莖、根中次之, 在花中表達(dá)量較少。純化的PtPAL重組蛋白具有催化L-Phe生成-CA的功能, 且具有較高的催化效率, PtPALm為0.89 mmol L-1,max為63.96 nkat mg-1,cat為6.56 s-1,cat/m為7.37×103 s-1M-1; PtPAL催化反應(yīng)最適pH為9.0, 最適溫度為70℃。但在相同催化條件下, PtPAL不能催化L-酪氨酸生成對香豆酸。探究重金屬離子對PtPAL酶活性的影響表明, Ba2+增強(qiáng)了PtPAL酶活性, Mn2+、Co2+、Cu2+及Zn2+抑制了PtPAL酶活性。

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Molecular cloning, expression, and enzyme kinetic analysis of a phenylalanine ammonia-lyase gene in

HE Xiao1,2, LIU Xing3, XIN Zheng-Qi1,2, XIE Hai-Yan1,2, XIN Yu-Feng1,2, and WU Neng-Biao1,2,*

1School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China;2Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Region, Ministry of Education, Chongqing 400715, China;3Chongqing Dazu Middle School, Chongqing 402360, China

In this study, based on the transcriptome data, a phenylalanine ammonia lyase gene was cloned and namedusingas the experimental material. The analysis of sequence structure and systematic evolution revealed that the length of the gene was 2289 bp, encoding 762 amino acids, and the termination codon was TAA. PtPAL was the similarity of 78% compared with monocotPAL, with PAL-HAL, PLN02457, phe_am_lyase, Lyase_aromatic, and HutH domains that belonging to the Lyase_I_like superfamily. Phylogenetic tree analysis showed that PtPAL was closely related to the monocotyledon,, and, and thus belonging to Moncotyledons. Real-time fluorescent qPCR indicated that the relative expression level ofgene was the highest in leaves, followed by tubers and roots, and the lowest in flowers. The functional expression analysis ofgene revealed that the PtPAL recombinant protein could efficiently catalyze L-Phe to-CA, and the optimal pH and temperature of the reaction were 9.0℃ and 70℃, respectively.m,max,cat, andcat/mof PtPAL were 0.89 mmol L-1, 63.96 nKat mg-1, 6.56 s-1, and 7.37×103s-1M-1. Further exploration of the effect of metal ions on PtPAL enzyme activity showed that Ba2+could significantly enhance PtPAL enzyme activity, and Mn2+, Co2+, Cu2+, and Zn2+inhibit the activity of PtPAL enzyme. This study lays the foundation for further research of the functional characteristics ofand the metabolic pathways of amphetamine alkaloids in

; ephedrine; phenylalanine ammonia-lyase; gene cloning; expression analysis; enzyme kinetics analysis

10.3724/SP.J.1006.2021.04227

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30500041)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (30500041).

吳能表, E-mail: wunb@swu.edu.cn

E-mail: 992651097@qq.com

2020-10-14;

2021-03-19;

2021-04-01.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210401.1048.004.html