李國銓，郭峰，王敏，葉鳳，鄭顏萍

海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，海南 ?？?570100

系統(tǒng)性硬化癥(systemic sclerosis，SSc)是一種異質(zhì)性自身免疫疾病，其主要特征包括皮膚及內(nèi)臟纖維化、免疫異常、閉塞性微血管損傷等，隨著疾病的進(jìn)展，可導(dǎo)致機(jī)體多器官纖維化，危及患者生命安全[1]。間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)是SSc患者常見的并發(fā)癥之一，也是最為嚴(yán)重的繼發(fā)病癥。有資料顯示[2]，系統(tǒng)性硬化癥并間質(zhì)性肺疾病(systemic sclerosis associated interstitial lung disease，SSc-ILD)患者發(fā)病后的10年內(nèi)致死率高達(dá)40%。目前，關(guān)于SSc-ILD的具體發(fā)病機(jī)制尚無報(bào)道明確闡述，但國內(nèi)外諸多相關(guān)研究推動(dòng)了SSc-ILD的發(fā)展，也增加了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)υ摬“Y的認(rèn)知。2016年雷玲等[3]報(bào)道指出SSc患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例增加，不同表型CD4+CD25+Foxp3+、CD4+CD25+CD127-細(xì)胞比例與肺纖維化病變呈正相關(guān)性。VOLKMANN等[4]也指出SSc患者T淋巴細(xì)胞免疫功能紊亂、持續(xù)炎癥反應(yīng)等是導(dǎo)致SSc-ILD發(fā)病的重要因素?；诖?，本研究分析了SSc-ILD與外周血T細(xì)胞亞群的相關(guān)性，以期為SSc-ILD的診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年12月期間海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科收治的40例SSc患者為研究對(duì)象，其中男性8例，女性32例；年齡24～78歲，平均(47.38±9.75)歲；病程6個(gè)月～19年，平均(3.12±0.92)年；臨床癥狀表現(xiàn)：指端潰瘍8例，雷諾現(xiàn)象27例，關(guān)節(jié)腫脹11例。入組標(biāo)準(zhǔn)：①均符合美國風(fēng)濕協(xié)會(huì)SSc的分類標(biāo)準(zhǔn)[5]；②近半年內(nèi)未使用過免疫抑制劑的已確診患者或新發(fā)SSc患者；③患者及家屬對(duì)檢測內(nèi)容、注意事項(xiàng)知情，且簽署自愿參與書；④臨床資料齊全；⑤依從性高。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤者；②存在急性感染者；③合并其他結(jié)締組織病者；④因其他原因?qū)е碌乃幬镄曰蛱匕l(fā)性間質(zhì)性肺病；⑤肝臟、心臟、腦、血液等重要臟器或系統(tǒng)患有嚴(yán)重疾病者。本研究已獲得本院倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 外周血T細(xì)胞亞群水平檢測 采用EDTA-K2抗凝真空采血管抽取患者清晨空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈血2 mL。取一支流式專用管，加入20μL的CD4-FITC/CD8-PE/CD3-APC/CD45-PC7四色試劑和100μL全血，充分混勻，在溫室下避光孵育15 min。隨后加入2 mL的FACELysing溶血液，避光孵育10 min，在1 500 r/min條件下離心處理5 min，棄上清液。用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，再離心處理5 min，棄上清液。最后加入PBS緩沖液重懸，以流式細(xì)胞儀測定各細(xì)胞比例，包括CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞及CD4+/CD8+比值。

1.2.2 高分辨率CT(HRCT)檢查 采用西門子公司的64排螺旋CT掃描儀對(duì)所有入組患者進(jìn)行HRCT檢查?；颊呷⊙雠P位，雙手抱頭，在靜息狀態(tài)下深吸氣后屏氣，從胸廓入口至肺底進(jìn)行掃描。參數(shù)設(shè)置：管電壓120 kV，管電流200 mAs，掃描層厚5 mm，層距5 mm。檢查完成后將獲得的影像信息傳輸至后臺(tái)工作站以iDose4迭代算法、Y-Detail方式、Standard(B)方式進(jìn)行圖像重建，觀察肺部、縱隔及雙肺門表現(xiàn)。根據(jù)HRCT征象可將ILD分為0級(jí)、1級(jí)、2級(jí)、3級(jí)。具體評(píng)價(jià)方式為：0級(jí)表示未合并ILD，檢查結(jié)果無明顯異常；1級(jí)表示疑似合并ILD，出現(xiàn)局部或單側(cè)的磨玻璃、網(wǎng)狀或斑片狀陰影，累及區(qū)域＜5%；2級(jí)表示合并輕度ILD，出現(xiàn)非依賴性磨玻璃或網(wǎng)狀陰影、彌漫性小葉中心結(jié)節(jié)、非肺氣腫性囊腫、支氣管擴(kuò)張等改變，且這些改變可分布于任何肺葉區(qū)域，累及范圍≥5%；3級(jí)表示合并重度ILD，胸膜下多葉纖維化，伴有蜂窩狀和牽引性支氣管擴(kuò)張。為確保檢查結(jié)果的客觀性，所有患者HRCT評(píng)分均由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的影像學(xué)醫(yī)師單獨(dú)進(jìn)行，若兩者評(píng)分結(jié)果一致則納入數(shù)據(jù)庫，若兩者意見相左，則加入第3名影像學(xué)醫(yī)師進(jìn)行討論確定結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo) (1)基本臨床特征：根據(jù)SSc患者是否合并ILD分為SSc-ILD組和SSc-Non-ILD組，比較兩組基本臨床特征，包括性別、年齡、病程、吸煙史、臨床表現(xiàn)等；(2)外周血T細(xì)胞亞群水平：比較SSc-ILD組和SSc-Non-ILD組患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞及CD4+/CD8+比值；(3)ILD分級(jí)與外周血T細(xì)胞亞群水平的相關(guān)性：分析HRCT征象下ILD分級(jí)與外周血T細(xì)胞亞群水平的相關(guān)性，評(píng)價(jià)SSc-ILD與外周血T細(xì)胞亞群的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson檢驗(yàn)分析SSc患者ILD分級(jí)與外周血T細(xì)胞亞群的相關(guān)性；繪制受試者工作特性(receiver operating characteristic，ROC)曲線，計(jì)算外周血T細(xì)胞亞群的曲線下面積(areas under curve，AUC)，并分析其對(duì)SSc-ILD的敏感性和特異性；均以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的基本臨床特征比較 根據(jù)HRCT檢查結(jié)果，40例SSc患者中合并ILD者16例，未合并ILD者24例，SSc-ILD的發(fā)病率為40.0%(16/40)。兩組患者的年齡、性別、臨床表現(xiàn)等基本特征比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但SSc-ILD組患者病程長于SSc-Non-ILD組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組患者的基本臨床特征比較

2.2 兩組患者外周血T細(xì)胞亞群水平比較 兩組患者的CD4+水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；SSc-ILD組患者的CD8+水平明顯高于SSc-Non-ILD組，CD3+、CD4+/CD8+水平明顯低于SSc-Non-ILD組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。+

表2 兩組患者的外周血T細(xì)胞亞群水平比較(±s)

表2 兩組患者的外周血T細(xì)胞亞群水平比較(±s)

組別SSc-ILD組SSc-Non-ILD組t/χ2值P值例數(shù)16 24 CD3+(%)66.73±11.32 70.51±10.84 4.013 0.001 CD4+(%)36.61±8.74 37.24±7.95 0.428 0.556 CD8+(%)33.64±7.28 29.56±6.52 4.957 0.001 CD4+/CD8 1.13±0.25 1.58±0.35 4.435 0.001

2.3 SSc患者HRCT下ILD分級(jí)與外周血T細(xì)胞亞群的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性檢查結(jié)果顯示，SSc患者ILD分級(jí)與CD3+呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.755，P=0.000)，與CD4+無明顯相關(guān)性(r=-0.020，P=0.351)，與CD8+呈正相關(guān)性(r=0.845，P=0.000)，與CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.659，P=0.000)，見圖1～圖4。

圖1 SSc患者ILD分級(jí)與外周血CD3+水平分布散點(diǎn)圖

圖2 SSc患者ILD分級(jí)與外周血CD4+水平分布散點(diǎn)圖

圖3 SSc患者ILD分級(jí)與外周血CD8+水平分布散點(diǎn)圖

圖4 SSc患者ILD分級(jí)與外周血CD4+/CD8+水平分布散點(diǎn)圖

2.4 外周血T細(xì)胞亞群對(duì)SSc-ILD診斷的敏感度和特異度 經(jīng)ROC曲線分析結(jié)果顯示，CD3+、CD8+、CD4+/CD8的AUC分別為0.745、0.797、0.667，具有良好的陽性參考價(jià)值。CD3+最佳截?cái)嘀禐?7.65，敏感度為79.2%，特異度為68.4%；CD8+最佳截?cái)嘀禐?2.70，敏感度為83.8%，特異度為71.1%；CD4+/CD8+最佳截?cái)嘀禐?.29，敏感度為75.0%，特異度為73.7%，見表3、圖5。

圖5 SSc-ILD中外周血CD3+、CD8+、CD4+/CD8+的ROC曲線圖

表3 SSc-ILD中外周血CD3+、CD8+、CD4+/CD8+的ROC曲線分析結(jié)果

3 討論

作為一種彌漫性結(jié)締組織病，SSc常累及肺部、消化道等重要臟器，其中合并ILD的發(fā)生率高達(dá)25%～90%，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[6]。受限于SSc-ILD發(fā)病機(jī)制仍不明確，臨床在治療SSc-ILD時(shí)往往沒有準(zhǔn)確的目標(biāo)，不但增加醫(yī)療支出，并且可能出現(xiàn)各種藥物相關(guān)的不良反應(yīng)。目前，SSc-ILD的治療方案主要包括免疫抑制劑、抗纖維化藥物等，實(shí)際治療效果和用藥安全性欠佳[7]。因此，有學(xué)者提出，了解SSc-ILD患者機(jī)體各細(xì)胞因子、信號(hào)通路、免疫系統(tǒng)之間的相互聯(lián)系，提高SSc-ILD的認(rèn)知和理解，對(duì)尋求新的治療靶點(diǎn)、治療方向至關(guān)重要[8]。

本研究主要探討了SSc-ILD與外周血T細(xì)胞亞群之間的關(guān)系，分析T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答對(duì)SSc-ILD發(fā)病的影響，并評(píng)估其機(jī)體免疫狀態(tài)，以期為SSc-ILD患者制定科學(xué)、合理的治療方案。通常而言，人體正常情況下的T淋巴細(xì)胞亞群水平維持在一個(gè)平衡狀態(tài)，發(fā)揮著正常的免疫功能，當(dāng)機(jī)體發(fā)生病變時(shí)，可能導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞亞群發(fā)生不同程度的改變，客觀地反映出機(jī)體免疫狀況。AYANO等[9]學(xué)者指出，ILD發(fā)生與自身免疫損傷有關(guān)，在彌漫性肺疾病時(shí)，CD8+被認(rèn)為可依據(jù)抗原刺激發(fā)揮細(xì)胞毒性或抑制作用。另外，在國內(nèi)的一項(xiàng)研究中，張亮等[10]學(xué)者分析了結(jié)締組織病并間質(zhì)性肺病變(CTD-ILD)患者外周血T細(xì)胞亞群，指出CTD-ILD患者的CD8+水平明顯升高，認(rèn)為體內(nèi)發(fā)生免疫功能的紊亂是導(dǎo)致CTD-ILD發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，這與本研究結(jié)果相似。在免疫學(xué)上，CD3表示總T細(xì)胞水平，CD4+/CD8+則是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的核心環(huán)節(jié)，一旦失衡說明機(jī)體細(xì)胞免疫功能發(fā)生異常改變[11]。但是，在國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道中，關(guān)于外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平與SSc-ILD的相關(guān)性尚無系統(tǒng)性研究，這也是本研究的主要目的之一。通過對(duì)確診SSc患者進(jìn)行胸部薄層CT及外周血T細(xì)胞亞群檢測，評(píng)價(jià)T細(xì)胞研究在SSc-ILD發(fā)病中的作用。

本研究中，SSc-ILD組患者的CD8+水平明顯高于SSc-Non-ILD組，CD3+、CD4+/CD8+水平低于SSc-Non-ILD組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明SSc-ILD患者免疫細(xì)胞分布異常，T細(xì)胞亞群失衡，導(dǎo)致體內(nèi)發(fā)生明顯的免疫功能紊亂。此外，國內(nèi)諸多學(xué)者研究了淋巴細(xì)胞免疫分型與間質(zhì)性肺疾病的關(guān)系[12-13]，指出SSc-ILD、單純SSc以及健康對(duì)照組之間的CD3+、CD4+/CD8+均存在顯著性差異，說明T細(xì)胞亞群失衡可能參與了該疾病的進(jìn)展。但上述研究并沒有對(duì)SSc-ILD疾病分級(jí)與T細(xì)胞亞群的關(guān)系進(jìn)行探究，也缺少這類指標(biāo)對(duì)SSc-ILD臨床診療的價(jià)值評(píng)估。為了進(jìn)一步探討外周血T細(xì)胞亞群水平與SSc-ILD的關(guān)系，本研究基于HRCT對(duì)SSc患者進(jìn)行ILD分級(jí)，并分析了其與外周血T細(xì)胞亞群的相關(guān)性。結(jié)果顯示，SSc患者ILD分級(jí)與CD3+、CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.755、-0.659，P＜0.05)，與CD8+呈正相關(guān)性(r=0.845，P=0.000)，由此可見機(jī)體免疫功能狀況與SSc-ILD的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)，這在王妞[14]的研究中也得以體現(xiàn)。該結(jié)果無疑為臨床治療SSc-ILD提供了有建設(shè)性的參考依據(jù)：SSc合并ILD時(shí)，機(jī)體外周血T細(xì)胞亞群數(shù)量或功能發(fā)生改變，若在該階段進(jìn)行針對(duì)性的免疫學(xué)異常干預(yù)，可能有利于提高系統(tǒng)性硬化病和肺部病變的治療效果，進(jìn)而改善患者預(yù)后。

SSc-ILD起病隱匿，患者在發(fā)病初期缺乏特異性臨床表現(xiàn)，容易出現(xiàn)誤診、漏診，部分患者在確診時(shí)已發(fā)展為不可逆的肺纖維化，造成嚴(yán)重的肺功能損傷。因此，早期給予有效的臨床診斷具有重要的意義。HRCT是診斷SSc-ILD的有效手段，可取得與ILD病理學(xué)檢查一致的結(jié)果。也有學(xué)者證實(shí)了血清趨化因子-4[15]、中性粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比率[16]在SSc-ILD中的診斷價(jià)值。本研究通過繪制ROC曲線分析顯示，CD3+、CD8+、CD4+/CD8+水平的對(duì)SSc-ILD的AUC分別為0.745、0.797、0.667，具有良好的陽性參考價(jià)值(AUC均＞0.5)，且敏感度、特異度良好，提示外周血T細(xì)胞亞群水平檢測可作為臨床診斷SSc-ILD的有效指標(biāo)，對(duì)早期篩查SSc-ILD可能具有輔助性作用。劉培培等[17]研究了淋巴細(xì)胞免疫分型對(duì)ILD的臨床價(jià)值，指出外周血T淋巴細(xì)胞亞群改變有助于臨床識(shí)別免疫性損傷引發(fā)的結(jié)締組織病相關(guān)間質(zhì)性肺病變，與本研究結(jié)論相符。

綜上所述，SSc患者免疫功能紊亂與其并發(fā)ILD密切相關(guān)，外周血CD3+、CD8+、CD4+/CD8+水平改變不僅對(duì)SSc-ILD病情評(píng)估和臨床診斷具有重要的價(jià)值，同時(shí)對(duì)該疾病的治療和預(yù)后有一定的指導(dǎo)性意義。但本研究存在一定的不足之處，如病例納入數(shù)較少，且為單中心研究，病例均來自海南省，可能存在統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差及地域性差異；此外，未深入探究外周血T細(xì)胞亞群與SSc-ILD患者臟器受累、療效檢測及預(yù)后之間的關(guān)系，需要后續(xù)繼續(xù)深入研究。