蔣昊辰 宋春鳳 朱文潤 龐之楹 白 楊 曹 露 陳及非 郭常安

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨科 上海 200032）

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療終末期關(guān)節(jié)病的有效方法，人工關(guān)節(jié)感染（periprosthetic joint infection，PJI）是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后嚴(yán)重的并發(fā)癥［1-2］，會增加致殘風(fēng)險和經(jīng)濟負擔(dān)。PJI的治療難點在于早期及時診斷病原體［3］。常規(guī)病原培養(yǎng)是目前最常用的PJI病原體的檢測手段，因為取樣前使用抗生素、取樣及培養(yǎng)過程污染、培養(yǎng)條件不當(dāng)、存在生物膜等情況，現(xiàn)有培養(yǎng)陰性率高達20%～40%，無法確診致病菌可能導(dǎo)致PJI治療失?。?］。

宏基因組二代測序技術(shù)（metagenomic nextgeneration sequencing，mNGS）是應(yīng)用最為廣泛的二代測序技術(shù)。mNGS是運用生物信息分析技術(shù)檢測出樣本中所有微生物的種類及序列數(shù)量的方法，因其可以無偏倚檢測所有核酸，從而在不依賴病原學(xué)培養(yǎng)技術(shù)的前提下，能夠同時檢測細菌、真菌、病毒和寄生蟲。理論上mNGS可無偏倚、快速診斷PJI，尤其可解決培養(yǎng)陰性PJI的診斷難題。

目前國內(nèi)應(yīng)用mNGS診斷PJI尚處于起步階段，本研究通過傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法和mNGS技術(shù)檢測PJI標(biāo)本，比較兩者診斷效能，評估m(xù)NGS對PJI病原學(xué)診斷的臨床價值。

資料和方法

研究對象收集2017年1月—2019年12月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后出現(xiàn)疑似PJI癥狀而住院的患者。根據(jù)2011版美國骨骼肌肉感染協(xié)會（Musculoskeletal Infection Society，MSIS）診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］進行診斷（圖1）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床資料完善，可行MSIS診斷；（2）配合隨訪；（3）知情同意；（4）關(guān)節(jié)液與假體周圍組織均行病原培養(yǎng)與mNGS測序。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）因各種原因不能配合者；（2）取材過程中存在明確污染；（3）臨床取樣量不足；（4）資料不全無法進行MSIS診斷。

圖1 研究流程圖Fig 1 Research flowchart

取樣操作所有患者手術(shù)過程中均進行關(guān)節(jié)液和假體周圍組織取樣。

關(guān)節(jié)液取樣：術(shù)中切開關(guān)節(jié)囊前，用無菌針筒進行關(guān)節(jié)腔穿刺，抽取關(guān)節(jié)液，避免混入血液。取樣分為兩部分，一部分直接注射進需氧、厭氧、真菌和血培養(yǎng)瓶中，30 min內(nèi)運送至我院檢驗科微生物室，另一部分裝入無脫氧核糖核酸酶的無菌凍存容器中，30 min內(nèi)置于-80℃冰箱保存。

假體周圍組織取樣：翻修術(shù)中使用無菌手術(shù)刀在3處不同部位（存在炎癥的部位）切取假體周圍組織，避免混入液體。裝入無菌容器中，30 min內(nèi)行傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)；在微生物室無菌條件下，與3 mL腦心浸液肉湯混合研磨1 min，形成組織勻漿后進行培養(yǎng)，剩余組織勻漿裝入無脫氧核糖核酸酶的無菌凍存容器中，于-80℃冰箱保存。

病原體培養(yǎng)于我院檢驗科行病原體培養(yǎng)，分別于血瓊脂平板、巧克力平板、念珠菌顯色平板、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板、分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)行細菌、真菌和分枝桿菌培養(yǎng)。應(yīng)用鑒定藥敏系統(tǒng)和飛行時間質(zhì)譜鑒定以確認病原體。

mNGS檢測與數(shù)據(jù)分析按照華大基因BGISEQ-100平臺標(biāo)準(zhǔn)測序流程進行測序。

提取核酸：室溫下解凍標(biāo)本，取0.6 mL關(guān)節(jié)液/組織勻漿，混合1 g玻璃珠（半徑0.5 mm），在破壁管中以16 000×g高速離心10 min，取0.3 mL破壁產(chǎn)物，根據(jù)天根試劑盒步驟操作，提取核酸。取500 ng核酸，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化操作指南行超聲，破碎至200～300 bp的片段。

高通量測序：架構(gòu)文庫后進行測序，核酸濃度與插入片段的長度符合生物分析儀（Agilent 2100）質(zhì)量控制庫的要求，環(huán)化處理后變成環(huán)形單鏈構(gòu)造的文庫。對文庫進行滾環(huán)復(fù)制操作，產(chǎn)生DNA納米球。使用BGISEQ-100測序平臺對加載DNA納米球的測序芯片進行高通量測序。

數(shù)據(jù)處理：對測序平臺輸出的數(shù)據(jù)進行處理，排除35 bp以下和質(zhì)量過低的數(shù)據(jù)，獲得高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。然后選擇Burrows-Wheeler Alignment（http：//bio-bwa.sourceforge.net/）進行比對，與人源參考基因組一致的序列數(shù)據(jù)將被排除。最終合格的數(shù)據(jù)在刪除低復(fù)雜度數(shù)據(jù)后，使用美國國家生物信息中心數(shù)據(jù)庫（包括3 446種細菌、4 152種病毒、206種真菌和140種寄生蟲的微生物數(shù)據(jù)庫）與處理所得數(shù)據(jù)進行比對，從而獲得匹配病原體的序列數(shù)，根據(jù)序列數(shù)高低、覆蓋度、相對豐度等指標(biāo)最終出具檢測報告。

mNGS陽性標(biāo)準(zhǔn)：細菌種水平覆蓋度10倍及以上；真菌、病毒種水平覆蓋度5倍及以上。

統(tǒng)計學(xué)方法通過SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。連續(xù)性變量符合正態(tài)分布的用均值表示，不符合正態(tài)分布的用中位數(shù)表示；分類變量用n（%）表示。

結(jié) 果

一般資料共13例（髖關(guān)節(jié)4例，膝關(guān)節(jié)8例，肘關(guān)節(jié)1例）納入研究。根據(jù)MSIS診斷標(biāo)準(zhǔn)，13例均診斷為PJI。男8例，女5例，年齡18～81歲，初次置換后出現(xiàn)癥狀的中位時間為104（2～886）周，初次置換病因包括骨關(guān)節(jié)炎、外傷、骨腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、股骨頭壞死。翻修術(shù)前血沉平均水平為（67.77±32.74）mm/h，C反應(yīng)蛋白中位水平為77.60 mg/dL。

培養(yǎng)與mNGS檢測結(jié)果比較13例PJI患者中，mNGS陽性11例（84.62%），2例檢出多重感染（檢出病原數(shù)＞2）；培養(yǎng)陽性10例（76.92%）。兩者檢測結(jié)果相符6例（46.15%），mNGS陽性率較優(yōu)于病原培養(yǎng)（表1）。膝關(guān)節(jié)中，mNGS陽性率75.00%，培養(yǎng)陽性率87.50%；髖關(guān)節(jié)中，mNGS陽性率100.00%，培養(yǎng)陽性率50.00%。9例患者在取樣前未停用抗生素2周，mNGS陽性率100%，培養(yǎng)陽性率66.67%。mNGS平均檢測時間48 h，平均培養(yǎng)時間7天。

表1 PJI病原學(xué)診斷中二代測序和培養(yǎng)結(jié)果比較Tab 1 Results of mNGS and culture in diagnosis of PJI

mNGS檢測結(jié)果關(guān)節(jié)液和假體周圍組織樣本中，mNGS檢出有效序列的中位數(shù)分別為78（5～1 520）和13（3～345）（表2）。

表2 關(guān)節(jié)液和假體周圍組織中mNGS檢測結(jié)果Tab 2 Results of mNGS in synovial fluid and periprosthetic tissues

培養(yǎng)陰性病例在3例培養(yǎng)陰性的病例中，mNGS均檢出有臨床意義的陽性病原體，包括1例人型支原體、1例金黃色葡萄球菌和1例屎腸球菌。術(shù)前均長期使用抗生素治療。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)mNGS可以從PJI病例的關(guān)節(jié)液和假體周圍組織中成功檢出致病病原體，mNGS病原檢出率84.62%，優(yōu)于培養(yǎng)檢出率76.92 %，且與培養(yǎng)結(jié)果有良好的一致性，說明mNGS在高敏感性的同時有較高準(zhǔn)確性，能檢出罕見菌，在培養(yǎng)陰性病例中檢出致病病原體，識別多重感染；因此，mNGS技術(shù)有助于PJI病原學(xué)診斷。

mNGS與培養(yǎng)檢測能力相當(dāng)本研究中mNGS檢出病原體情況與文獻報道金黃色葡萄球菌是PJI最常見的致病病原體相符［6］。PJI致病病原體包括金黃色葡萄球菌、各類革蘭氏陰性桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌等，真菌和支原體導(dǎo)致的感染較為罕見。本研究利用mNGS和培養(yǎng)均檢出罕見病原體。通過mNGS檢測出1例人型支原體感染導(dǎo)致的PJI、1例白假絲酵母菌感染導(dǎo)致的PJI，以及2例少見病原體與常見病原體共同導(dǎo)致的混合多重感染，與文獻結(jié)果相符［7］。Huang等［8］報道使用mNGS技術(shù)成功診斷微小單胞菌（Parvimonas micra）導(dǎo)致的少見PJI。表明mNGS技術(shù)與病原培養(yǎng)檢測能力相當(dāng)，且能夠在培養(yǎng)陰性PJI中檢測出罕見病原體。

mNGS的優(yōu)勢

檢測速度快mNGS平均48 h取得結(jié)果，病原培養(yǎng)檢測平均耗時7天，考慮到有效治療PJI依賴于早期明確的病原學(xué)診斷以及相應(yīng)針對性治療，mNGS高效的檢測速度在早期診斷方面具有顯著優(yōu) 勢，Zhang等［9］研究表明在苛養(yǎng)菌檢測方面，mNGS的檢出陽性率和檢測速度均占優(yōu)勢。

檢出率高在培養(yǎng)陰性病例中，成功治療PJI關(guān)鍵是早期明確致病病原體，使用敏感抗生素治療和及時清創(chuàng)翻修?，F(xiàn)有診斷技術(shù)依賴培養(yǎng)結(jié)果，可能因出現(xiàn)假陰性而無法明確病原體。診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”是傳統(tǒng)病原學(xué)培養(yǎng)，通過對關(guān)節(jié)液、假體周圍組織、超聲裂解液等臨床標(biāo)本進行培養(yǎng)，陽性率為50%～70%［10］。相關(guān)研究中培養(yǎng)陰性PJI占10%～20%［11］。典型病例中，雖然發(fā)熱、竇道、傷口滲液、炎癥指標(biāo)升高、影像學(xué)檢查和術(shù)中所見均提示存在PJI，但因為致病菌是罕見菌，培養(yǎng)陰性，及時清創(chuàng)手術(shù)和經(jīng)驗性抗生素治療無法有效控制感染，mNGS檢測明確病原體后行針對性治療，成功控制感染，并且可以識別多重感染。文獻報道中17%～39%PJI為多重混合感染［12-13］，本研究中的多重感染檢出率為15.38%，聯(lián)合應(yīng)用敏感抗生素成功控制感染。Tarabichi等［7］報告aNGS技術(shù)在培養(yǎng)陰性病例中的陽性率為81.8%，并可識別多重感染。相較于病原培養(yǎng)，mNGS識別出的病原體種類更多，陽性率更高，可以有效彌補傳統(tǒng)培養(yǎng)敏感性較低且無法識別多重感染的不足，有效提高治療成功率，且本研究后續(xù)隨訪病例均未出現(xiàn)感染復(fù)發(fā)。也有研究認為mNGS檢測的敏感性與培養(yǎng)沒有顯著差異［14］。

檢測樣本多樣mNGS通過對樣本中的核酸進行擴增后進行檢測，相比于微生物培養(yǎng)，mNGS對于送檢樣本量要求低，有研究提示在低容量的關(guān)節(jié)液中NGS檢測依然保持高敏感性和特異性，為臨床取樣增加靈活性及樣本來源［15］。Cai等［16］研究發(fā)現(xiàn)，mNGS技術(shù)在假體周圍組織的敏感性和特異性分別為95.45%和90.91%，均明顯優(yōu)于病原培養(yǎng)；Huang等［17］研究發(fā)現(xiàn)，mNGS技術(shù)在關(guān)節(jié)液中的敏感性為95.9%，高于培養(yǎng)（79.6%）的敏感性。

受抗生素影響較小臨床上經(jīng)驗性抗生素治療會降低培養(yǎng)的陽性率。理論上mNGS技術(shù)檢測病原體核酸，與病原體存活與否無關(guān)，不受抗生素影響，但實際上核酸的半衰期短，使用抗生素仍會使mNGS檢出率下降，本研究中采樣前使用抗生素的病例mNGS陽性率為100%，優(yōu)于以往研究。

綜上，mNGS基本能夠彌補培養(yǎng)技術(shù)在臨床應(yīng)用中的不足和缺陷，是一種可替代培養(yǎng)，甚至優(yōu)于培養(yǎng)的病原學(xué)診斷技術(shù)手段。

mNGS技術(shù)不足與局限性（1）費用昂貴：樣本檢測費用遠高于培養(yǎng)。（2）軟硬件要求高：需要專業(yè)實驗室和技術(shù)人員，暫時無法普及至各級醫(yī)院。（3）存在污染、假陽性情況：出現(xiàn)假陽性的主要原因為采樣轉(zhuǎn)運檢測過程中的污染，如未在層流手術(shù)室進行采樣、采樣過程中混雜皮膚表面定植菌［18-19］（包括表皮葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌等）、轉(zhuǎn)運容器中存在微生物核酸、核酸提取試劑盒污染、檢測過程空氣中微生物的污染，以及在建庫時提取的DNA初始濃度低，導(dǎo)致多次擴增放大污染，從而造成假陽性［20］。（4）無法進行藥敏試驗：普通培養(yǎng)能夠同時進行藥敏試驗，指導(dǎo)臨床及時根據(jù)病原體耐藥情況調(diào)整抗菌藥物，mNGS僅能夠提示致病病原體，無法同步獲知藥敏情況，mNGS暫時無法完全取代傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)。

本研究的局限性（1）考慮到PJI的發(fā)病率，且mNGS是一門新興技術(shù)，本研究作為一項單中心的研究，納入的病例數(shù)較少，可能存在偏倚影響結(jié)論可靠性；（2）單個樣本的mNGS測序費用昂貴，無法檢測初次置換術(shù)中樣本是否存在病原體，評估m(xù)NGS的特異性；（3）無法保證所有樣本取樣醫(yī)師以及手術(shù)醫(yī)師均相同；（4）感染治療后短期隨訪，平均隨訪時間15.3個月，無法評估中長期感染復(fù)發(fā)情況。

本研究提示mNGS技術(shù)對PJI病原學(xué)診斷具有較大價值，能夠提高檢出率，檢測出培養(yǎng)難以鑒定的病原體，縮短檢測時間，是細菌培養(yǎng)的良好補充檢測方法。將來需要多中心、大樣本、多類型的mNGS診斷效能研究。

作者貢獻聲明蔣昊辰論文構(gòu)思、撰寫和修訂，數(shù)據(jù)采集。宋春鳳，朱文潤，龐之楹，白楊，曹露，陳及非病例收集。郭常安論文構(gòu)思、指導(dǎo)和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。