李建江 白濤 胡煒 黃異飛 韓念榮

骨缺損常見于外傷、腫瘤、感染等，對其重建是一項重大挑戰(zhàn)，而自體骨移植是治療骨缺損的金標準［1］。但自體骨來源有限，隨之而來的出血、感染等各種并發(fā)癥依然不容忽視［2］?；诖耍u基磷灰石（HAP）、磷酸三鈣（TCP）、鈦鉭合金等在內(nèi)的生物材料受到廣泛的研究和應用［3-5］。然而，上述材料并不能有效的與宿主骨整合，容易出現(xiàn)植入物遠期松動［6］，生物活性尚不理想［7］。

因此，具有誘導骨再生效果的各類生物活性水凝膠［8-11］備受關注，其中可注射水凝膠因具有微創(chuàng)填充不規(guī)則骨缺損的優(yōu)勢脫穎而出［12-13］。甲基丙烯酸化明膠（GelMA）水凝膠因其良好的生物相容性和可控性廣泛應用于組織工程中［14］。此外，目前已有多種生物活性成分［15-16］被嘗試添加到GelMA 中，并初具成骨優(yōu)化效果，然而負載物的爆發(fā)性釋放、短效作用等缺陷限制了其進一步發(fā)展。

納米鋰鈣石（SN）是一種表面電荷分布不均的圓盤狀納米顆粒，并可基于靜電力和范德華力產(chǎn)生相互作用力而可逆地自發(fā)組裝成“紙牌屋”式網(wǎng)絡結構，無需依賴化學鍵或生物偶聯(lián)；而該網(wǎng)絡結構可通過一定外力打破而恢復SN顆粒間相互運動，即實現(xiàn)剪切稀化作用［17-18］。此外，SN 能在缺乏額外成骨誘導因子的情況下促進骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）成骨分化［17，19］。

有效的骨愈合還需要足夠的干細胞集中于骨缺損區(qū)域［20-21］。然而，單純將干細胞植入支架內(nèi)的策略［22］受限于細胞來源有限、活力低等不足，相較之下通過植入具有趨化活性的生長因子以募集干細胞歸巢的替代策略顯然更有價值［23］。血小板衍生生長因子（PDGF）已被證明能夠指導未分化BMSCs 的歸巢和遷移［24-25］，此外還具有促進基質(zhì)礦化、誘導新生骨質(zhì)形成的功能［26］。

通過在GelMA 中簡單共混入SN 和PDGF，即可成功制備可注射GelMA-SN-PDGF復合水凝膠；進一步施加紫外光可優(yōu)化其力學性能，以實現(xiàn)最佳的成骨物理環(huán)境和受控的降解。此外，負載的SN 和PDGF 之間可借助高表面積和電荷屬性而形成物理吸附［17，27］，從而實現(xiàn)負載物的緩釋，并且不引發(fā)PDGF 結構改變而使其失活，保持其低濃度下維持對BMSCs的高生物活性［28］。基于此，本研究擬構建可注射GelMA-SN-PDGF復合水凝膠，驗證其體內(nèi)外成骨再生效應。

材料與方法

一、實驗材料和儀器

明膠（Solarbio，中國），甲基丙烯酸酐（MA，aladdin，中國），Irgacure 2959（98%，Sigma-Aldrich，德國），茜素紅S染色液（Sigma-Aldrich，德國），Laponite（BYK Additives＆Instruments，美國），重組大鼠PDGF-BB（Biolegend，美國），大鼠PDGF-BB ELISA Kit（ab267585，Abcam，英國），CCK-8 試劑盒（Sigma-Aldrich，德國），Live/Dead 試劑盒（Sigma-Aldrich，德國），Trizol（Invitrogen，美國），Alexa Fluor 594488-鬼筆環(huán)肽（Sigma-Aldrich，德國），4′，6-二mid 基-2-苯基吲哚（DAPI，Sigma-Aldrich，德國），Triton X-100（Sigma-Aldrich，德國），抗堿性磷酸酶（ALP）抗體（AP136A，Sigma-Aldrich，德國），抗骨鈣蛋白（OCN）抗體（MABD123，Sigma-Aldrich，德國），抗骨橋蛋白（OPN）抗體（AB1870，Sigma-Aldrich，德國），抗Runt相關轉錄因子2（RUNX2）抗體（05-1478，Sigma-Aldrich，德國），Alexa Fluor 594488-Invitrogen（Thermo Fisher Scientific，美國），大鼠BMSCs（中國科學院上海細胞庫）。流變儀（ElastoSensTM Bio2，Montreal，QC，加拿大），場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM，Zeiss Ultra 55，德國），萬能力學試驗機（Instron 5542，英國），倒置熒光顯微鏡（Brunel SP99F，Brunel Microscopes Ltd，英國），Micro-CT（Scanco Medical，瑞士），熱循環(huán)儀（Bio-Rad MyiQ2，美國），Image J 軟件（v1.8.0，National Institutes of Health，美國）。

二、可注射GelMA-SN-PDGF復合水凝膠樣品的制備

將明膠完全溶解于PBS 中，加入MA 充分攪拌1 h。PBS稀釋所得混合溶液并轉移至透析膜中，于40℃黑暗環(huán)境中透析1周，以分離未反應的MA。透析后溶液經(jīng)冷凍干燥得到白色泡沫狀GelMA 前體。將GelMA前體完全溶解于PBS中，同時加入SN（Laponite，2% w/v）、PDGF（100 ng/mL），加入Irgacure 2959（0.5% w/v）作為光引發(fā)劑，將所得預聚物在充分攪拌后于紫外光下照射（6.9 mW/cm2，360～480 nm），最終即可獲得復合水凝膠樣品。

三、GelMA-SN-PDGF復合水凝膠的表征觀察

（一）黏度和可注射性能分析

使用流變儀進行復合水凝膠的流變和應力恢復測試。在室溫下以0.1～100 s-10的剪切速率范圍記錄負載不同SN 含量（0%，1%和2% w/v）水凝膠樣品的剪切應力。在復合水凝膠的可注射性能評估中，復合水凝膠依次經(jīng)受頻率為1 Hz 的高應變（100%，10 min）和低應變（1%，10 min），以獲得37 ℃下的復合水凝膠儲存模量（G′）。復合水凝膠的可注射性采用不同直徑針頭的注射器在室溫下注射評估。

（二）微觀形貌觀察

使用FESEM對凍干水凝膠樣品掃描，觀察水凝膠內(nèi)部微觀結構，分析負載SN后其微觀結構變化。

（三）力學分析

將100 μL 的預聚物于定制的聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具中經(jīng)紫外光交聯(lián)制成圓柱狀水凝膠樣品（寬8 mm，高2 mm）。使用Instron 5542 機械測試儀以1 mm/min 的速度壓縮圓柱狀水凝膠樣品30 s，計算應力-應變曲線首個0～10%線性區(qū)域以獲得樣品的楊氏模量。

（四）降解和溶脹性能特征

同上所述制備圓柱形水凝膠樣品以測定降解率以及溶脹率。在降解率測定中，將水凝膠樣品凍干后稱重以記錄初始質(zhì)量。隨后將樣品浸入37 ℃的PBS中，在預設的時間點取出樣品并進行凍干稱重，同時替換等量新鮮PBS，重新將樣品再次浸于其中，最終描繪降解曲線。在溶脹率測試中，將圓柱形水凝膠樣品在PBS中孵育1 h以達到溶脹平衡，記錄溶脹的水凝膠質(zhì)量為M（s），隨后凍干樣品并記錄其質(zhì)量M（l），溶脹率根據(jù)以下方程式計算得出：

溶脹率=［M（s）-M（l）］/M（l）

（五）PDGF緩釋的體外分析

負載PDGF的復合水凝膠樣品浸泡于1 mL PBS中，并于37 ℃下置于搖床平臺（60 r/min）。到達預設時間點后，取出500 μL PBS 并以等量新鮮PBS 補充代替。使用PDGF-ELISA 試劑盒測定取出液中PDGF的濃度，計算累積釋放濃度。

四、復合水凝膠封裝細胞的活力、擴散、增殖和遷移分析

（一）細胞活性及鋪展運動

在37 ℃，5%CO2環(huán)境下，使用a-MEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%青霉素/鏈霉素）培養(yǎng)大鼠BMSCs。將BMSCs 接種于圓柱形水凝膠樣品上，細胞密度控制在3×104個/孔。使用CCK-8 試劑盒以及Live/Dead 試劑盒測定樣品潛在的細胞毒性和細胞活力。另一方面，使用4%多聚甲醛固定細胞后經(jīng)鬼筆環(huán)肽和DAPI染色，在倒置熒光顯微鏡下評估接種后第3 天的細胞擴散形態(tài)，Image J 軟件對細胞鋪展面積進行定量分析。

（二）細胞遷移

Transwell實驗中，將50 μL BMSCs懸浮液（104個/mL）轉移至Transwell 小室上層，同時將400 μL 培養(yǎng)基和復合水凝膠樣品裝載于小室下層。共孵育3 h后，4%多聚甲醛固定跨膜細胞10 min，結晶紫溶液（0.1%）染色10 min。PBS輕柔沖洗后于顯微鏡下進行細胞計數(shù)。Scratch實驗中，BMSCs以105個/mL的初始密度接種于10 cm 培養(yǎng)皿中，當細胞的融合度達到約70%時，使用1 mL 移液器吸頭垂直刮擦皿底形成2.0 mm寬劃痕，于設定時間點觀察刮痕寬度變化。

五、成骨相關標志物表達水平的分析

使用qRT-PCR 量化ALP、RUNX2、OCN 和OPN的表達。如前述制備圓柱形水凝膠樣品并接種BMSCs（3×104個/孔）。配置成骨誘導培養(yǎng)基（10 mmol/L β-磷酸甘油，50 μg/mL抗壞血酸，100 nmol/L地塞米松，10%胎牛血清）共培養(yǎng)復合水凝膠和BMSCs。于第14 天收集并使用Trizol 裂解細胞，熱循環(huán)儀中進行qRT-PCR。

使用免疫熒光法標記評估相應的成骨相關蛋白水平。成骨誘導培養(yǎng)基共培養(yǎng)BMSCs 和復合水凝膠樣品14 d 后，4%多聚甲醛固定細胞，1%Triton X-100加強細胞滲透性，4%BSA封閉非特異性抗原后，將細胞與目標蛋白一抗（ALP，OCN，OPN 和RUNX2 抗體）于4 ℃孵育過夜，隨后二抗工作液中37 ℃下浸泡2 h。細胞核和肌動蛋白分別使用DAPI和Alexa Fluor 594 鬼筆環(huán)肽進行標記，于熒光顯微鏡下記錄染色圖像，Image J 軟件定量蛋白質(zhì)表達水平。

六、基質(zhì)礦化能力測定

制備圓柱形水凝膠樣品并接種BMSCs（3×104個/mL），使用骨誘導培養(yǎng)基共培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)14 d和21 d后使用4%多聚甲醛固定細胞，加入茜素紅染液（40 mmol/L，pH=4.2）于室溫下孵育10 min。隨機選擇五個顯微鏡視野對鈣結節(jié)進行計數(shù)。為進一步量化基質(zhì)礦化，將茜素染色后樣品浸泡在10%乙酸中30 min，10%氫氧化銨滴定中和，取上清液在酶標儀中于405 nm波長下讀取吸光度。

七、復合水凝膠體內(nèi)成骨再生能力的評估

（一）大鼠顱骨臨界骨缺損模型的建立

60只平均體重為120 g的SPF清潔級雄性SD大鼠隨機分為4 組：GelMA 組，GelMA-SN 組，GelMAPDGF 組和GelMA-SN-PDGF 組。手術大致如下：腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠，手術區(qū)域備皮后碘伏消毒。于大鼠顱頂部正中行1.5 cm縱向切口，分離骨膜以充分暴露顱骨骨質(zhì)。使用8 mm環(huán)型鉆機制造一個直徑為8 mm 的骨缺陷。將水凝膠注入缺損區(qū)域并進行原位紫外光交聯(lián)。最終縫合骨膜和皮膚，術后切口再次碘伏消毒。

（二）體內(nèi)骨再生分析

術后6周腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死所有大鼠，收集顱骨標本。使用Micro-CT 掃描標本，計算新生骨體積占比（BV/TV）和骨密度（BMD）。使用Masson 三色染色法分析再生骨組織的組織學特征。通過Masson三色染色結果，使用Image J軟件量化缺損區(qū)域新鮮類骨質(zhì)和礦化骨質(zhì)的形成分布；選取缺損長度為8 cm的組織切片，缺損區(qū)域未骨性愈合寬度記錄為U（a），并根據(jù)下述公式計算骨愈合百分比：

骨愈合百分比=［8-U（a）］/8×100%

八、統(tǒng)計學分析

使用單因素方差分析（ANOVA）和Bonferroni 事后分析（GraphPad Prism 8.0）分析實驗結果，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、復合水凝膠的材料表征

可注射復合水凝膠在原位經(jīng)紫外光交聯(lián)后增強力學性能（圖1 a）。在室溫下，GelMA-SN 水凝膠可通過最小直徑針頭（27 G）的注射器，具有良好的可注射性能（圖1 b）。隨著SN濃度升高，GelMA-SN在一定剪切速率下黏度顯著增加（圖1 g），顯示出明顯的剪切稀化特性。

紫外光交聯(lián)后電鏡下觀察可見GelMA 水凝膠的內(nèi)部結構具有更多連通的孔隙，而加入的SN均勻散布于GelMA的多孔結構表面。SN的引入并未顯著破壞GelMA 原有的網(wǎng)絡狀多孔微觀結構（圖1 c）。交聯(lián)后4組GelMA基水凝膠（GelMA，GelMA-PDGF，GelMA-SN，GelMA-SN-PDGF）的溶脹率均降低了40%～50%，而其壓縮模量均有相似的提升（圖1 d、e）。

SN 強化了GelMA 的剪切恢復能力（圖1 f）。在低應變（1%）情況下，GelMA預聚物的儲能模量低至約5 Pa，而1%SN 和2%SN 的引入使儲能模量分別增至100 Pa 和約300 Pa；而在經(jīng)受高應變（100%）后，負載1% SN 的GelMA 恢復了初始儲能模量的70%～80%，而2%SN的引入使GelMA的儲存模量回復至初始的90%～95%。此外，交聯(lián)后的GelMA基水凝膠降解時間均長達21 d（圖1 i）。

在生長因子釋放試驗中（圖1 j），GelMA-SNPDGF 水凝膠顯示出受控的釋放模式，第21 天依然可檢測出釋放的PDGF。相反，GelMA-PDGF呈爆發(fā)型釋放曲線，在前3 d釋放量已超過PDGF總負載量的91%。

圖1 GelMA-SN-PDGF 復合水凝膠的表征 a：GelMA-SN-PDGF 復合水凝膠樣品的制備過程；b：復合水凝膠可通過不同直徑針頭被注射；c：GelMA和GelMA-SN在掃描電子顯微鏡下觀察；d～g：復合水凝膠的溶脹率、壓縮模量、儲存模量、粘度-剪切速率測量；h、i：復合水凝膠在紫外光交聯(lián)前后的體外降解速度；j：兩種載PDGF的復合水凝膠樣品的生長因子釋放曲線（*P＜0.05）

二、復合水凝膠封裝細胞的活力、擴散和增殖

水凝膠樣品表面培養(yǎng)的BMSCs 的活性見Live/Dead 染色結果，各組樣品上培養(yǎng)的細胞生存力未見明顯差異（圖2 a、b）。DAPI-Phalloidin 染色結果（圖2 c、e）體現(xiàn)了BMSCs在GelMA-SN-PDGF水凝膠組中鋪展更廣。CCK-8法分析結果如圖2 d所示，各組GelMA基水凝膠樣品對細胞的毒性無顯著差異。

圖2 GelMA-SN-PDGF復合水凝膠的生物相容性檢測 a、b：Live/Dead染色復合水凝膠中細胞的成像及細胞活性量化；c：DAPI-Phalloidin 染色復合水凝膠中細胞第3天鋪展形態(tài)；d：CCK-8測定SN對復合水凝膠中的細胞毒性大??；e：復合水凝膠中接種細胞第3天鋪展面積的量化比較（*P＜0.05）

三、BMSCs的體外募集遷移活動

在Transwell 實驗中，當暴露于負載PDGF 的水凝膠中，在Transwell 膜中觀察到遷移細胞增加了約2.5 倍（圖3 a、c）。Scratch 試驗中（圖3 b、d），負載PDGF 水凝膠在24 h 使劃痕閉合率分別提高到63.42%±2.08%和65.18%±1.63%。

圖3 GelMA-SN-PDGF復合水凝膠的趨化能力檢測 a：Transwell實驗中結晶紫染色遷移細胞；b：Scratch實驗中各組復合水凝膠樣品誘導的劃痕愈合情況；c：Transwell實驗4組水凝膠樣品誘導細胞趨化運動的量化；d：Scratch實驗4組水凝膠樣品誘導細胞遷移的量化（*P＜0.05）

四、復合水凝膠的基質(zhì)礦化能力

第14 天GelMA-SN 和GelMA-SN-PDGF 組樣 品在405 nm 處吸光度值分別為0.58±0.02 和0.61±0.04，表明SN 優(yōu)化了復合水凝膠的基質(zhì)礦化能力（圖4）。

圖4 GelMA-SN-PDGF 復合水凝膠的基質(zhì)礦化能力評估 a：第21天通過茜素紅染色測量4組復合水凝膠的基質(zhì)礦化水平；b、c：酶標儀定量4組復合水凝膠在第14、21天的鈣沉積量（*P＜0.05）

五、復合水凝膠成骨相關標志物的表達

成骨相關基因表達水平如圖5 a 所示，以單純GelMA水凝膠為基準對比，GelMA-SN-PDGF 復合水凝膠組中ALP、RUNX2、OCN、OPN 的表達上調(diào)最顯著；而GelMA-SN組和GelMA-PDGF組均有不同程度上調(diào)。免疫熒光標記量化成骨相關蛋白結果（圖5 b）與基因表達結果一致，以單純GelMA 水凝膠作為基線相比，GelMA-SN-PDGF復合水凝膠組擁有最高水平的相應蛋白表達。

圖5 GelMA-SN-PDGF復合水凝膠體外成骨相關標志物的表達 a：4組水凝膠在第7、14天的體外成骨基因表達變化；b：4組水凝膠在第7、14天的體外成骨蛋白表達變化；c：4組水凝膠樣品在第7天的ALP免疫熒光成像（*P＜0.05）

六、復合水凝膠體內(nèi)修復大鼠顱骨缺損

如Micro-CT掃描結果（圖6 a）所示，與其他三組相比，GelMA-SN-PDGF復合水凝膠植入組的大鼠骨愈合更顯著，新生骨質(zhì)的生成量更高，BV/TV 為66.29%±2.14%；GelMA-PDGF 水凝膠和GelMA-SN水凝膠亦促進了一定程度的骨再生。而4組GelMA基水凝膠新生骨BMD 均表現(xiàn)出與BV/TV 一致的趨勢。

圖6 復合水凝膠處理大鼠顱骨缺損的Micro-CT評估 a：Micro-CT掃描各組復合水凝膠處理大鼠顱骨缺損的成像；b、c：進一步定量分析4組大鼠顱骨缺損區(qū)域的BV/TV和BMD（*P＜0.05）

Masson 三色染色結果如圖7a 所示，GelMA-SNPDGF 復合水凝膠組的骨愈合百分比為67.23%±2.63%，遠高于其他三組水凝膠樣品；其礦化骨質(zhì)和類骨質(zhì)形成亦顯著高于其余3組（圖7 c、d），其中礦化骨質(zhì)形成量約是GelMA組的12倍，而類骨質(zhì)生成量約是GelMA組的14倍。

圖7 復合水凝膠處理大鼠顱骨缺損的組織學評估 a：4組大鼠顱骨缺損6周后組織學Masson三色染色觀察，黑色箭頭指示新生的類骨質(zhì)，白色箭頭指示已礦化骨質(zhì)；b：4組復合水凝膠處理6周后大鼠顱骨缺損的愈合百分比；c、d：4組大鼠顱骨缺損區(qū)域新生骨質(zhì)的礦化骨和類骨質(zhì)含量定量分析（*P＜0.05）

討 論

當前臨床上自體骨移植和大部分植骨替代物并不能很好的滿足創(chuàng)傷和腫瘤等所致病理性骨缺損修復需求［2］，因此有研究不斷嘗試以支架負載細胞或成骨活性物質(zhì)以刺激局部骨再生［15-16］。近年來可注射成骨水凝膠引起高度關注，以期實現(xiàn)微創(chuàng)填補不規(guī)則骨缺損［12-13］。然而當前的成骨水凝膠方案合成方法復雜、耗時且昂貴［29-30］，并受限于有限的細胞來源和較低的細胞活力，最終療效尚存爭議［22］。

紫外光照射交聯(lián)使水凝膠的力學性能得以調(diào)控。紫外光輻照30 s 后，電鏡下可見GelMA 內(nèi)部形成了高度交聯(lián)互通的網(wǎng)絡孔隙，且其彈性模量增至25 KPa，恰為BMSCs 成骨分化公認的最佳剛度［31］。交聯(lián)后GelMA 的溶脹率顯著降低、降解速度減慢，有利于實現(xiàn)PDGF的持續(xù)釋放；結合SN的引入，Gel-MA-SN-PDGF復合水凝膠呈現(xiàn)出長達21 d的生長因子控釋模式，顯著持久于GelMA-PDGF 水凝膠產(chǎn)生的爆發(fā)性釋放。負載物緩釋可由SN 自組裝形成的物理屏障和吸附藥物來解釋［27，32］。早期研究證實各種離子或分子可以通過范德華力、氫鍵、經(jīng)典的離子交換或配體交換等形式吸附于SN表面［27］。因此，復合水凝膠中PDGF 釋放時間可持續(xù)達數(shù)周至數(shù)月，利于骨修復愈合過程。

除了延緩負載物釋放，SN 使復合水凝膠的可注射性得到顯著優(yōu)化，這主要歸因于其剪切稀化特性［17-18］。SN 在微觀下呈納米圓盤狀（平均直徑為25 nm，平均厚度為0.92 nm），表面電荷呈特征性不均分布。當SN 溶解于水中，分離的單個SN 晶體可借助帶負電邊緣和帶正電表面之間的電荷力和晶體間范德華力相互吸引，宏觀上呈凝膠狀［17-18］；而SN膠狀物呈現(xiàn)出強觸變性，并在移除施加應力后即可快速恢復（圖1 c、d）。因此相較傳統(tǒng)工藝，SN 簡化了可注射水凝膠的制備策略。

低濃度SN 亦可顯著影響細胞鋪展運動。鑒于上述SN晶體的吸附能力，其表面亦可吸附整聯(lián)蛋白和成骨蛋白［27］，因而在復合水凝膠上培養(yǎng)細胞時可觀察到鋪展面積更廣的細胞。更充分的細胞鋪展意味著其更易于分化為骨組織。故在這方面，SN促進誘導成骨作用的巨大潛力得以驗證。而低劑量的SN并不會顯著干擾細胞的存活和增殖。

干細胞歸巢在傷口愈合和組織再生中起著至關重要的作用［23］。在劃痕實驗和遷移測試中，PDGF募集BMSCs 能力得以驗證，其潛在機制涉及PDGF/PDGFR信號調(diào)控BMSCs活動［25］。因此，復合水凝膠通過PDGF 允許其調(diào)動外周BMSCs 到缺損區(qū)域，以實現(xiàn)后續(xù)的骨缺損修復。

PCR和免疫熒光染色從基因和蛋白質(zhì)表達層面證實了GelMA-SN-PDGF 顯著的成骨效果。其中，SN 的降解產(chǎn)物，即原硅酸［Si(OH)4］和鋰（Li），可直接上調(diào)成骨蛋白表達［17，27］。當SN 的成骨性能配合PDGF 的細胞募集效果時，兩者可能在成骨相關標志物表達方面上存在協(xié)同作用。另一方面，SN晶體表面上存在大量的Si-OH而吸引鈣離子分布，最終導致磷酸鈣成核形成鈣沉積，產(chǎn)生更多的鈣結節(jié)［27，33］，解釋了負載SN 的水凝膠（GelMA-SN，GelMA-SNPDGF）擁有更深的茜素紅染色。

在大鼠體內(nèi)，GelMA-SN-PDGF 組顯著修復了顱骨臨界缺損，且新生骨質(zhì)不僅從缺損邊緣再生，亦在缺損中心出現(xiàn)，提示新的骨化中心形成。這和SN的成骨誘導和鈣沉積作用，以及PDGF的干細胞募集功能相關。而次生骨化中心意味著更快的骨愈合［34］。BV/TV 和BMD 結果印證了復合水凝膠修復骨缺損的質(zhì)量，提示新生骨質(zhì)具有更高的厚度和密度。在組織形態(tài)學層面上，GelMA-SN-PDGF擁有最高的缺損愈合率、礦化骨和類骨質(zhì)形成水平。其中礦化骨質(zhì)提示更成熟的骨質(zhì)形成，而類骨質(zhì)意味著缺損部位新生骨質(zhì)的產(chǎn)生潛力。

本研究對于GelMA-SN-PDGF 的體內(nèi)成骨效應分析仍有待更長時間的觀察分析，以進一步驗證GelMA-SN-PDGF 遠期完全治愈嚴重骨缺損的能力。本研究構建的可注射GelMA-SN-PDGF 復合水凝膠，制備方法簡單易行，在體外內(nèi)實驗中均展現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性和成骨能力。這項研究將有助于可注射水凝膠治療骨缺損的后續(xù)研究開展，以及在誘導血管和神經(jīng)組織再生方面的拓展，也將有利于遠期各種組織和器官再生。