王斕，陳浙麗，徐亮，徐小明，王軼虎

（湖州市第三人民醫(yī)院 老年精神科，浙江 湖州313000）

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1.1 少突膠質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源及培養(yǎng)少突膠質(zhì)細(xì)胞從新生的Sprague-Dawley 大鼠大腦皮層組織中制備[9]，其原代培養(yǎng)是基于McCarthy 技術(shù)[10]。實(shí)驗(yàn)前，將OPCs 接種于增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。增殖培養(yǎng)基為DMEM/F12，并添加2%B27、0.5%胎牛血清、L-谷氨酰胺、抗生素、血小板源性生長(zhǎng)因子（plateletderived growth factor, PDGF）10 ng/ml 和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）10 ng/ml。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性CD-1 小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0013]，12 h 晝/夜循環(huán)照明。12 只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和喹硫平組，每組6 只。分別給予生理鹽水和富馬酸喹硫平10 mg/（kg·d）鹽水溶解后腹腔注射30 d。最后一次注射12 h 后處死小鼠，解剖前額皮質(zhì)進(jìn)行基因表達(dá)分析。

1.2 主要儀器、試劑及藥物

1.2.1 主要儀器流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson 公司），ViiA 7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）系統(tǒng)（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.2.2 主要試劑與藥物B27（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），PDGF 和bFGF（美國(guó)Protech 公司），大鼠單克隆anti-溴脫氧尿苷（Bromodeoxyuridine,BrdU）和p21（英國(guó)Abcam 公司），兔多克隆anti-Ki67和p21 shRNA 質(zhì)粒（美國(guó)Santa Cruz 公司），1% N2 和β-actin（英國(guó)Sigma 公司），Trizol 試劑（美國(guó)Invitrogen公司），Trizol 試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司）。富馬酸喹硫平（英國(guó)AstraZeneca UK Limited 公司，批準(zhǔn)文號(hào)：H20160665，規(guī)格：0.2g×20 片）

1.3 細(xì)胞周期檢測(cè)

將OPCs 細(xì)胞按5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于聚-賴(lài)氨酸包覆的6 孔板中。在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，用堿性培養(yǎng)基（含2%B27 的DMEM/F12 培養(yǎng)基）替代培養(yǎng)，并用喹硫平（1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）處理48 h。為檢測(cè)喹硫平對(duì)PDGF 誘導(dǎo)的細(xì)胞周期激活的影響，增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h 后，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基替代培養(yǎng)基，并加入PDGF（10 ng/ml）、喹硫平（10 μmol/L）或兩者的混合物培養(yǎng)48 h。將OPCs 細(xì)胞分為對(duì)照組（培養(yǎng)48 h）、PDGF 組（加入PDGF 10 ng/ml 培養(yǎng)48 h）、喹硫平組（加入喹硫平10 μmol/L培養(yǎng)48 h）和PDGF+喹硫平組（加入PDGF 10 ng/ml和喹硫平10 μmol/L，培養(yǎng)48 h）。OPCs 用0.25%胰蛋白酶消化，70%乙醇固定，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期中G0/G1、S、G2 期細(xì)胞百分比[11]，使用Cell Quest Pro 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.4 細(xì)胞周期退出指數(shù)測(cè)定

OPCs 細(xì)胞可以在細(xì)胞周期中繼續(xù)循環(huán)自我更新，也可以退出細(xì)胞周期進(jìn)行分化。細(xì)胞周期退出是少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的前提條件，因此本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)喹硫平和PDGF 對(duì)細(xì)胞周期退出的影響。細(xì)胞周期分為靜息期（G0）、準(zhǔn)備期（G1）、DNA 復(fù)制期（S）、S 和M 期之間的間隙（G2）和細(xì)胞分裂期（M）。采用BrdU 抗體標(biāo)記處于S 期的細(xì)胞，使用Ki-67 抗體標(biāo)記除G0 期外整個(gè)細(xì)胞周期的增殖細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞周期退出指數(shù)。BrdU+/Ki-67+雙標(biāo)記細(xì)胞表示細(xì)胞周期內(nèi)的細(xì)胞比例，BrdU+/Ki-67 細(xì)胞表示細(xì)胞周期外的細(xì)胞比例。細(xì)胞周期退出指數(shù)以BrdU+/Ki-67-細(xì)胞數(shù)除以BrdU+細(xì)胞總數(shù)表示[12]。將OPCs細(xì)胞接種在24 孔板上，增殖培養(yǎng)48 h。用基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含2% B27 的DMEM/F12 培養(yǎng)基）替代培養(yǎng)，加入PDGF 10 ng/ml、喹硫平10 μmol/L 或兩者的混合物培養(yǎng)24 h，并分為對(duì)照組（培養(yǎng)24 h）、PDGF 組（加入PDGF 10 ng/ml 培養(yǎng)24 h）、喹硫平組（加入喹硫平10 μmol/L 培養(yǎng)24 h）和PDGF+喹硫平組（加入PDGF 10 ng/ml 和喹硫平10 μmol/L 培養(yǎng)24 h）。固定OPCs細(xì)胞，細(xì)胞核DNA 變性后，用大鼠單克隆anti-BrdU（1∶100）和兔多克隆anti-Ki67 一級(jí)抗體（1∶100）孵育，用結(jié)合熒光染料的二級(jí)抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞分化分析

將OPCs 細(xì)胞按2.5×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于24 孔板中，增殖培養(yǎng)48 h。將增殖培養(yǎng)基替換為分化培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基中加入喹硫平后持續(xù)培養(yǎng)3 d。將OPCs 細(xì)胞分為對(duì)照組（培養(yǎng)3 d）、喹硫平10 μmol/L組（加入喹硫平10 μ mol/L 培養(yǎng)3 d）和喹硫平20 μmol/L 組（加入喹硫平20 μmol/L 培養(yǎng)3 d）。少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基為DMEM/F12，并添加1%N2、L-谷氨酰胺、0.5%胎牛血清、抗生素、三碘甲狀腺氨酸9.8 g/L、生物素10 g/L 和轉(zhuǎn)鐵蛋白25 g/L。使用抗體髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein, MBP）（成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志）對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。使用激光掃描共聚焦顯微鏡獲取圖像，Image-Pro Plus 軟件進(jìn)行分析。在分化培養(yǎng)基中加入喹硫平后3 d 和4 d，采用少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物MBP 固定并標(biāo)記少突膠質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)形態(tài)復(fù)雜性將MBP 陽(yáng)性細(xì)胞分為低分化和高分化。

1.6 qRT-PCR

小鼠前額皮質(zhì)區(qū)域表現(xiàn)出最明顯的髓鞘特異性基因表達(dá)變化。為研究喹硫平對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制，本研究測(cè)定喹硫平干預(yù)（10 mg/kg，1 次/d）小鼠30 d 后，小鼠前額皮質(zhì)中8 個(gè)細(xì)胞周期相關(guān)mRNA 相對(duì)表達(dá)量。其中包括細(xì)胞周期蛋白D1（Ccnd1）、細(xì)胞周期依賴(lài)激酶2（CDK2）、CDK4、轉(zhuǎn)錄因子2（E2F2）和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白1（Rb1），其可正向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1/S、G2/M 轉(zhuǎn)變、DNA 合成和有絲分裂。另外檢測(cè)環(huán)獨(dú)立激酶抑制劑p21 和p27 的相對(duì)表達(dá)量，以及p21 的上游介質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子p53 的相對(duì)表達(dá)量。按照Trizol 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作提取總RNA。利用SuperScriptTMⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA 1.5 μg 合成cDNA。通過(guò)ViiA 7 qRT-PCR 系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，引物序列見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)。β-actin 為mRNA 表達(dá)的內(nèi)參，每個(gè)樣本檢測(cè)3 次，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

當(dāng)前國(guó)際上與自由貿(mào)易區(qū)域有關(guān)的概念多達(dá)20多種，其中一部分屬于雙邊或多邊貿(mào)易體系，包括世貿(mào)組織框架下的自由貿(mào)易區(qū)(FTA，F(xiàn)ree Trade Area)，其余部分屬于單邊自由貿(mào)易區(qū)范疇，包括我國(guó)即將設(shè)立的自由貿(mào)易港。自全球第一家自由貿(mào)易港誕生至今，自由貿(mào)易港口經(jīng)歷了從轉(zhuǎn)口貿(mào)易到加工貿(mào)易，再到綜合型貿(mào)易港的演變過(guò)程。

表1 qRT-PCR引物序列

1.7 Western blotting

將Vector shRNA或p21 shRNA轉(zhuǎn)染OPCs細(xì)胞6 h，然后在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d。轉(zhuǎn)染后第4 天，用冷PBS 洗滌少突膠質(zhì)細(xì)胞，然后在NP-40 裂解緩沖液中裂解。4℃、12 000 r/min 離心10 min，裂解液通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用5%牛奶封膜，并用p21（1∶200）或β-actin 的一抗檢測(cè)，用相應(yīng)的二抗孵育膜。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒對(duì)膜進(jìn)行可視化檢測(cè)。

1.8 shRNA轉(zhuǎn)染

為確定p21 在少突膠質(zhì)細(xì)胞周期調(diào)控中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用shRNA 介導(dǎo)敲低p21 的表達(dá)。用p21 shRNA 或空載體進(jìn)行Western blotting 檢測(cè)以確定轉(zhuǎn)染效率。p21 shRNA 質(zhì)粒由3 個(gè)靶向特異性載體質(zhì)粒組成。實(shí)驗(yàn)前，將OPCs 細(xì)胞在增殖培養(yǎng)基中保存48 h。然后將增殖培養(yǎng)基替換為轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。將共1 μg p21 shRNA 或1 μg 對(duì)照shRNA 和轉(zhuǎn)染試劑添加到培養(yǎng)基中。根據(jù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況將細(xì)胞分為對(duì)照組（正常培養(yǎng)），空載體組（將1 μg 對(duì)照shRNA 轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系中），p21 shRNA 組（將1 μg p21 shRNA 轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系中），OPCs 孵育6 h。增殖實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染6 h 后用增殖培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入BrdU 10 μg/ml 孵育12 h。在分化實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染6 h 后將培養(yǎng)基換成含有1 μg/ml 嘌呤霉素抗生素的分化培養(yǎng)基，以殺死未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。第4 天，對(duì)OPCs 細(xì)胞進(jìn)行Western blotting、細(xì)胞周期分布和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 和GraphPad Prism version 7.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用Bonferroni 檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 喹硫平對(duì)PDGF 促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂有抑制作用

對(duì)照組、PDGF 組、喹硫平組和PDGF+喹硫平組的G0/G1 期、S 期和G2 期細(xì)胞百分比比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較：與對(duì)照組比較，PDGF 組G0/G1 期細(xì)胞百分比低（P<0.05），S 期和G2 期細(xì)胞百分比高（P<0.05），說(shuō)明PDGF 促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂；與PDGF 組比較，PDGF+喹硫平組G0/G1 期細(xì)胞百分比高（P<0.05），S 期和G2 期細(xì)胞百分比低（P<0.05），說(shuō)明喹硫平對(duì)PDGF 促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂有抑制作用。見(jiàn)表2。

表2 喹硫平抑制PDGF促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂作用 （%，x±s）

2.2 喹硫平促進(jìn)細(xì)胞周期退出并阻斷PDGF 的作用

對(duì)照組、PDGF 組、喹硫平組和PDGF+喹硫平組的細(xì)胞周期退出指數(shù)分別為（0.11±0.02）、（0.06±0.01）、（0.15±0.02）和（0.11±0.01），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.944，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較：與對(duì)照組比較，PDGF 組細(xì)胞周期退出指數(shù)低（P<0.05），喹硫平組細(xì)胞周期退出指數(shù)高（P<0.05），說(shuō)明PDGF 抑制細(xì)胞周期退出，喹硫平促進(jìn)細(xì)胞周期退出；與PDGF 組比較，PDGF+喹硫平組細(xì)胞周期退出指數(shù)高（P<0.05），說(shuō)明喹硫平阻斷PDGF 對(duì)細(xì)胞周期退出的影響。

2.3 喹硫平促進(jìn)OPCs細(xì)胞分化

在高分化細(xì)胞中，對(duì)照組、喹硫平10 μmol/L組和喹硫平20 μmol/L 組高分化和低分化細(xì)胞數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較：與對(duì)照組比較，喹硫平10 μmol/L 組和喹硫平20 μmol/L 組高分化細(xì)胞數(shù)高（P<0.05），低分化細(xì)胞數(shù)量低（P<0.05），表明喹硫平可提高OPCs 細(xì)胞的成熟率，降低低分化細(xì)胞數(shù)。見(jiàn)表3。

表3 喹硫平促進(jìn)OPCs細(xì)胞分化 （%，±s）

表3 喹硫平促進(jìn)OPCs細(xì)胞分化 （%，±s）

注：?與對(duì)照組比較，P<0.05。

組別低分化細(xì)胞高分化細(xì)胞對(duì)照組喹硫平10 μmol/L組喹硫平20 μmol/L組F 值P 值63.12±5.47 42.06±4.32?21.07±3.04?21.249 0.000 10.05±1.02 30.13±2.37?50.00±5.15?22.054 0.000

2.4 喹硫平上調(diào)p21 mRNA的表達(dá)

兩組p21 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），喹硫平組高于對(duì)照組，表明喹硫平干預(yù)后p21 表達(dá)升高；而其他mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表4。

表4 兩組mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表4 兩組mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

注：?與對(duì)照組比較，P<0.05。

組別Rb1 mRNA cdk2 mRNA Cdk4 mRNA P27 mRNA Ccnd1 mRNA P53 mRNA P21 mRNA E2f2 mRNA對(duì)照組喹硫平組t 值P 值0.38±0.03 0.41±0.05 1.627 0.121 0.02±0.01 0.03±0.01 1.412 0.171 0.08±0.03 0.07±0.01 1.000 0.331 0.04±0.02 0.03±0.01 1.414 0.174 0.03±0.01 0.04±0.02 1.414 0.174 0.07±0.02 0.08±0.03 0.877 0.392 0.51±0.03 1.15±0.05?34.709 0.000 0.03±0.01 0.05±0.03 2.000 0.061

2.5 下調(diào)p21對(duì)OPCs細(xì)胞周期分布的影響

對(duì)照組、空載體組和p21 shRNA 組p21 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較：與對(duì)照組和空載體組比較，p21 shRNA 組p21 蛋白相對(duì)表達(dá)量低（P<0.05）。見(jiàn)表5 和見(jiàn)圖1。

圖1 各組p21蛋白的表達(dá)

對(duì)照組、空載體組、p21 shRNA 組S 期和G2 期細(xì)胞百分比比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較：與空載體組和對(duì)照組相比，p21 shRNA 組S 期細(xì)胞百分比高（P<0.05），G2 期細(xì)胞百分比低（P<0.05），表明下調(diào)p21 可增加S 期細(xì)胞百分比，降低G2 期細(xì)胞百分比。見(jiàn)表5。

表5 各組p21蛋白相對(duì)表達(dá)量和細(xì)胞周期比較 （±s）

表5 各組p21蛋白相對(duì)表達(dá)量和細(xì)胞周期比較 （±s）

注：?與p21 shRNA組比較，P<0.05。

組別G2期/%p21蛋白S期/%對(duì)照組空載體組p21 shRNA組F 值P 值3.02±0.21?2.85±0.24?1.13±1.13 5.206 0.000 0.38±0.05?0.36±0.03?0.21±0.02 9.983 0.000 7.05±0.72?8.00±0.85?13.12±1.08 14.788 0.000

2.6 下調(diào)p21對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響

對(duì)照組、空載體組和p21 shRNA 組的BrdU 陽(yáng)性細(xì)胞率分別為（30.12±3.05）%、（33.21±4.17）%和（44.25±3.68）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.469，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較：p21 shRNA 組BrdU 陽(yáng)性細(xì)胞率高于對(duì)照組和空載體組（P<0.05），表明下調(diào)p21 可增加BrdU 陽(yáng)性細(xì)胞，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖。

2.7 下調(diào)p21對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的影響

對(duì)照組、空載體組和p21 shRNA 組MBP 陽(yáng)性細(xì)胞率分別為（39.24±4.07）% 、（32.19±3.33）% 和（18.54±2.28）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.762，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較：p21 shRNA組MBP 陽(yáng)性細(xì)胞率低于對(duì)照組和空載體組（P<0.05），表明下調(diào)p21 可降低MBP 陽(yáng)性細(xì)胞，抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。

3 討論

精神分裂癥是一種臨床上常見(jiàn)的慢性、致殘性精神疾病，主要特征表現(xiàn)為情感、思維、行為、意志障礙等[13]。精神分裂癥具有發(fā)病率高、致殘率高、治愈率低等特點(diǎn)，給臨床治療和護(hù)理造成巨大的壓力，同時(shí)也給社會(huì)和患者家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[14]。目前，普遍認(rèn)為精神分裂癥是由遺傳和環(huán)境因素相互作用所致，但其發(fā)病機(jī)制仍尚未完全了解。本研究通過(guò)探討非典型抗精神病藥物奎硫平在體內(nèi)外對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的影響，發(fā)現(xiàn)喹硫平可以促進(jìn)細(xì)胞周期的退出，加速少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化，另外，喹硫平治療可使小鼠前額皮質(zhì)p21 mRNA 顯著升高，下調(diào)p21 的表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞的增殖和延遲分化。

據(jù)報(bào)道，在精神分裂癥患者中，CyclinD1、D2、E 和Cyclin A2 等細(xì)胞周期陽(yáng)性調(diào)節(jié)因子的mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)，而周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑p27 mRNA 和p57 mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)[15]。另有研究表明，暴露在草酸雙下的小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子（包括Cyclin A2、CyclinD1 和CyclinF）的表達(dá)水平明顯上調(diào)[16]。由此可見(jiàn)，細(xì)胞周期基因表達(dá)的異?？赡苁蔷穹至寻Y和銅中毒小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞缺失的原因之一。此外，經(jīng)過(guò)草酸雙干預(yù)的小鼠表現(xiàn)出較高水平的標(biāo)記為NG2 和血小板衍生的生長(zhǎng)因子α 的OPCs，以及成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)的明顯減少[17-18]。而在草酸雙誘導(dǎo)的去髓細(xì)胞模型中，OPCs 細(xì)胞為何不能進(jìn)一步分化為成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞尚不清楚。生長(zhǎng)因子的異常分泌和細(xì)胞周期的激活似乎是阻礙OPCs 細(xì)胞分化的重要機(jī)制。PDGF 和bFGF 可促進(jìn)OPCs 增殖，抑制其分化[19]。FGF2 甚 至可以刺激有絲分裂后少突膠質(zhì)細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期的S 期[20]。細(xì)胞周期的激活可使OPCs 處于增殖狀態(tài)，導(dǎo)致OPCs 分化的缺失，此外，細(xì)胞周期退出失敗可導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，阻礙少突膠質(zhì)細(xì)胞分化[21]。有研究指出，抑制PDGF 受體信號(hào)可以促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，PDGF 可防止OPCs 從細(xì)胞周期中退出（抑制細(xì)胞周期退出），增加S 期和G2 期細(xì)胞數(shù)。10 μmol/L 喹硫平可刺激OPCs細(xì)胞周期退出，抑制PDGF 誘導(dǎo)的細(xì)胞周期激活。由于細(xì)胞周期退出是細(xì)胞分化的前提條件，喹硫平可通過(guò)調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，減輕髓鞘脫髓。

p21 是一種細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）抑制劑，能夠影響所有的細(xì)胞周期蛋白復(fù)合物[23]。p21 與細(xì)胞周期退出增加有關(guān)，而下調(diào)p21 可導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞周期退出減少[24]。與此相反，p21 還可以作為一種正向的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑，通過(guò)促進(jìn)活性周期蛋白D1/CDK4 復(fù)合物，刺激少突膠質(zhì)細(xì)胞的S期進(jìn)入細(xì)胞周期[25]。本實(shí)驗(yàn)使用shRNA 敲低p21 的表達(dá)，觀察到OPCs 增殖數(shù)量明顯增加（BrdU+標(biāo)記）和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著減少（MBP 標(biāo)記）。可見(jiàn)p21 作為細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子，可能有利于奎硫平促進(jìn)OPCs 細(xì)胞分化的作用。

既往研究表明，非典型抗精神病藥物奧氮平可通過(guò)阻滯膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（GSCs）周期，抑制其增殖并誘導(dǎo)其向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化[26]。此外，喹硫平還能通過(guò)促進(jìn)GSCs 向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，有效抑制GSCs 啟動(dòng)的腫瘤生長(zhǎng)，發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤的作用[27]。由此可見(jiàn)，抗精神病藥物喹硫平可能是臨床治療脫髓鞘疾病和惡性膠質(zhì)瘤的一種有效藥物。雖然抗精神病藥物喹硫平在體外能夠有效調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，減輕髓鞘脫髓，但是在體內(nèi)能否對(duì)p21 起到有效的調(diào)節(jié)作用，仍需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。綜上所述，喹硫平可能通過(guò)調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期來(lái)調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化。