王 正， 郝赫莉， 王曉彤， 武思羽， 閻錫新， 張霄鵬， 孟愛宏△

（1河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院北院區(qū)呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河北石家莊050004；2河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)一科，河北石家莊050000；3河北省人民醫(yī)院胸外二科，河北石家莊050051）

感染所致炎癥是慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者病情急性加重住院的主要原因。細(xì)顆粒物（particulate matter 2.5，PM2.5）是指大氣中直徑≤2.5 μm 的顆粒物與COPD 存在密切關(guān)聯(lián)，但致病機(jī)制尚不完全清楚。PM2.5 刺激可誘發(fā)與炎癥有密切關(guān)系的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）是ERS 中的關(guān)鍵分子，研究證實(shí)CHOP 活化還具有促炎作用。磷酸酶抑制劑salubrinal 可通過抑制PERK-eIF2α 通路中eIF2α 的去磷酸化，加速堆積的未折疊蛋白的分解，緩解ERS，減少細(xì)胞CHOP 的表達(dá)，但salubrinal能否通過緩解ERS而影響PM2.5導(dǎo)致的炎癥尚不清楚。本研究將COPD 急性加重期（acute exacerbation of COPD，AECOPD）患者或健康志愿者血清與PM2.5 共同刺激小鼠肺泡巨噬細(xì)胞株MH-S，檢測(cè)MH-S 細(xì)胞組蛋白脫乙酰酶2（histone deacetylase 2，HDAC2）活性及炎癥因子白細(xì)胞介素17（interleukin-17，IL-17）的分泌，模擬AECOPD 炎癥狀態(tài)下PM2.5對(duì)MH-S細(xì)胞的影響，進(jìn)一步以salubrinal干預(yù)PM2.5處理的 MH-S 細(xì)胞，探討 salubrinal 在 PM2.5 所 致MH-S細(xì)胞損傷中的作用。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Mk3 全自動(dòng)酶標(biāo)儀（芬蘭雷博）；共聚焦顯微鏡（Zeiss）；北京四環(huán)科學(xué)儀器廠TLL-C 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）。

1.2 主要材料與試劑 永生化小鼠肺泡巨噬細(xì)胞株MH-S 購(gòu)自ATCC。IL-17 ELISA 試劑盒購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司；HDAC2 活性比色法定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；細(xì)胞活力及毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8）購(gòu)自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；健康志愿者血清取自健康志愿者；AECOPD 患者血清取自河北醫(yī)大二院呼吸三科就診患者；PM2.5 由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸一科贈(zèng)送；salubrinal 購(gòu)自 APExBIO；兔抗 GRP78 和CHOP 抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。本研究已獲得河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 顆粒物懸液的制備 稱取60 mg PM2.5，加入6 mL RPMI-1640 培養(yǎng)液，配制成濃度為10 g/L 的顆粒物懸液，高壓蒸汽滅菌10 min，用前超聲震蕩2 min，用培養(yǎng)基稀釋成1 g/L 待用。前期行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定 PM2.5 刺激的適宜濃度和時(shí)間：25、75、100 和200 mg/L 的 PM2.5 刺激 MH-S 細(xì)胞 6 h，細(xì)胞存活率分別為97.0%、92.3%、90.0%和74.5%；刺激細(xì)胞12 h，細(xì)胞存活率分別為96.8%、89.6%、87.1%和76.8%；刺激細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率分別為：92.7%、82.8%、76.0%和66.9%。據(jù)此選擇染毒劑量的PM2.5 濃度為100 mg/L，時(shí)間為12 h。

2.2 細(xì)胞分組及培養(yǎng) 用CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度AECOPD 患者和健康志愿者血清刺激后MH-S 細(xì)胞的活力，并選取存活率大于80%的血清濃度和作用時(shí)間。經(jīng)活性測(cè)定后確定實(shí)驗(yàn)所需血清濃度為1%、作用時(shí)間為6 h。

檢測(cè)AECOPD 血清對(duì)PM2.5 致MH-S 細(xì)胞炎癥的影響：分為對(duì)照組、PM2.5 組、健康志愿者血清組、AECOPD 患者血清組、PM2.5+健康志愿者血清組和PM2.5+AECOPD 患者血清組。PM2.5 終濃度為100 mg/L，刺激 6 h。為探討 salubrinal 在 PM2.5 致 MH-S細(xì)胞損傷中的作用，前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)PM2.5 作用12 h對(duì)巨噬細(xì)胞有明顯促炎作用，將細(xì)胞分為對(duì)照組、PM2.5 組和salubrinal+PM2.5 組，培養(yǎng)液中加入salubrina（lsalubrinal提前1 h加入30 μmoL）和PM2.5（終濃度100 mg/L），刺激12 h。

2.3 IL-17 和HDAC2 的檢測(cè)及細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn) 按上述分組取細(xì)胞上清液，利用IL-17 檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法）檢測(cè)IL-17 濃度。細(xì)胞按HDAC2 試劑盒說明書提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度，檢測(cè)HDAC2 活性（比色法）。取細(xì)胞爬片根據(jù)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟處理，加入熒光抗衰減劑，存于-20 ℃冰箱，封片1周內(nèi)共聚焦顯微鏡下觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)正態(tài)分布結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）多組比較，各組之間進(jìn)一步用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較分析。相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析法，以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義判斷的標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié) 果

1 CCK-8法測(cè)定血清刺激的MH-S細(xì)胞活力

采用1%健康志愿者血清、1% AECOPD 患者血清和5%健康志愿者血清和5%AECOPD 患者血清刺激MH-S 細(xì)胞6 h，細(xì)胞相對(duì)活力分別為（89.68±11.29）% 、（89.43±6.49）% 、（41.47±13.28）% 和（39.62±13.54）%。1%健康志愿者血清和1% AECOPD患者血清刺激MH-S細(xì)胞12 h細(xì)胞相對(duì)活力分別為（41.92±6.59）%和（42.69±10.24）%。選取細(xì)胞相對(duì)活力在80%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，由此選取1%的血清刺激MH-S 細(xì)胞6 h。1%健康志愿者血清和1%AECOPD 患者血清刺激MH-S 細(xì)胞6 h 細(xì)胞存活率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2 AECOPD 血清對(duì) PM2.5 所致 MH-S 細(xì)胞炎癥的影響

由表1 可見，與對(duì)照組相比，PM2.5 刺激MH-S細(xì)胞致細(xì)胞上清液IL-17 含量增加，細(xì)胞HDAC2 活性降低（P＜0.05）；分別加入AECOPD 患者血清和健康志愿者血清，上清液中IL-17 含量增多，細(xì)胞HDAC2 活性降低（P＜0.05），且AECOPD 患者血清組較健康志愿者血清組上述變化更明顯（P＜0.05）；同時(shí)加入血清和PM2.5組較單純加入PM2.5組及單純加入血清組MH-S 細(xì)胞炎癥因子升高，細(xì)胞HDAC2活性降低更明顯（P＜0.05）。PM2.5+AECOPD 患者血清組較PM2.5+健康志愿者血清組炎癥因子IL-17升高明顯，HDAC2 活性降低明顯（P＜0.05）。IL-17與HDAC2之間存在負(fù)相關(guān)（r=-0.786，P＜0.01）。

表1 血清與PM2.5對(duì)MH-S細(xì)胞分泌IL-17及HDAC2活性的影響Table 1.Effects of serum and PM2.5 on IL-17 content and HDAC2 activity in MH-S cells（Mean±SD. n=20）

3 salubrinal在PM2.5致MH-S細(xì)胞損傷中的作用

3.1 免疫熒光結(jié)果 由圖1、2 可見，PM2.5 組細(xì)胞CHOP 熒光較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，以核內(nèi)明顯；加入salubrinal 干預(yù)后CHOP 熒光較PM2.5 組減弱。PM2.5組GRP78 熒光較對(duì)照組增強(qiáng)，以胞質(zhì)內(nèi)居多，加入salubrinal干預(yù)后GRP78熒光較PM2.5組增強(qiáng)。

Figure 1.Comparison of CHOP fluorescence staining in different groups.Red arrows indicated the enhanced fluorescence of CHOP，especially in the nucleus.圖1 不同分組CHOP熒光染色圖的比較

Figure 2.The images of GRP78 fluorescence staining in different groups.Red arrows indicated the enhanced fluorescence of GRP78，especially in the cytoplasm.圖2 不同分組GRP78熒光染色圖片的比較

3.2 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-17 濃度的變化及細(xì)胞中HDAC2 活性的變化 由表2 可見，與對(duì)照組相比，PM2.5 刺激致MH-S 細(xì)胞上清液IL-17 含量增加（P＜0.05）；用 salubrinal 干預(yù)后，IL-17 含量較PM2.5 刺激組減少，但仍高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，PM2.5 刺激致細(xì)胞 HDAC2 活性降低（P＜0.05）；用salubrinal 干預(yù)后HDAC2活性有所恢復(fù)，但仍低于對(duì)照組（P＜0.05）。

表2 salubrinal 對(duì) PM2.5 刺激的 MH-S 細(xì)胞 IL-17 分泌及HDAC2活性的影響Table 2.Effects of salubrinal on IL-17 secretion and HDAC2 activity in MH-S cells stimulated with PM2.5（Mean±SD. n=5）

討 論

COPD 急性加重期的發(fā)病機(jī)制可歸因于感染和非感染性因素。微生物感染是AECOPD 最常見的原因［1］。大氣污染是主要的非感染性因素。

大量研究證實(shí)肺泡巨噬細(xì)胞在COPD 炎癥相關(guān)發(fā)病機(jī)制中起重要作用的細(xì)胞類型之一［2-5］。我們前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)帶有炎癥因子的血清滲出液與肺泡巨噬細(xì)胞相互作用，進(jìn)一步加重肺部炎癥［6］。本研究證實(shí)血清作用于MH-S 細(xì)胞可使其產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，IL-17 分泌增多，HDAC2 活性降低，健康志愿者血清刺激MH-S 細(xì)胞后炎癥因子增多，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，說明健康志愿者血清刺激對(duì)細(xì)胞的致炎作用明顯，但AECOPD患者血清刺激MH-S細(xì)胞較健康志愿者血清刺激相比損傷更嚴(yán)重。可能是與AECOPD 患者存在系統(tǒng)性炎癥有關(guān)，血清中對(duì)細(xì)胞有毒害作用的炎癥因子較多。PM2.5 與血清共同刺激巨噬細(xì)胞情況下加重該損害。說明炎癥情況下呼吸道黏膜水腫滲出會(huì)使 PM2.5 的損傷作用增強(qiáng)，PM2.5 可致使 COPD 急性加重，住院率增多，同時(shí)急性加重情況下也更易受PM2.5 損傷。而關(guān)于PM2.5 對(duì)MH-S 細(xì)胞影響的具體機(jī)制并不清楚，以及AECOPD 血清與PM2.5 共同作用下使PM2.5對(duì)細(xì)胞損傷作用增強(qiáng)的具體機(jī)制需進(jìn)一步探究。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是真核細(xì)胞中具有關(guān)鍵功能的細(xì)胞器，各種生理和病理情況可能導(dǎo)致ER 蛋白折疊負(fù)荷和容量之間的不平衡，ER腔中出現(xiàn)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的積累，細(xì)胞啟動(dòng)一系列精密的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，這種情況被稱為“ERS”［7］。GRP78 是 ERS 的重要標(biāo)記物，當(dāng) ER 穩(wěn)態(tài)被擾亂時(shí)，錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)與GRP78 結(jié)合，激活ER 傳感器，產(chǎn)生 PERK-eIF2α、IRE1-XBP1s 和 ATF6-ERSE 3 條信號(hào)通路，經(jīng)一系列信號(hào)傳遞導(dǎo)致ER 腔的擴(kuò)張和錯(cuò)誤折疊蛋白的降解，發(fā)揮減輕ERS、保護(hù)細(xì)胞的作用。CHOP 也是ERS 的重要標(biāo)記物，PERK-eIF2α-ATF4通路是CHOP 蛋白表達(dá)所必須的。正常情況下 CHOP 表達(dá)較低，當(dāng)發(fā)生 ERS 時(shí)，CHOP 表達(dá)明顯增多，通過促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白正確折疊，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。多種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子可以激活ERS。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著PM2.5 濃度增加，肺泡巨噬細(xì)胞CHOP 的mRNA、GRP78 的mRNA 表達(dá)增多，引起 ERS［8］。salubrinal 是一種選擇性細(xì)胞復(fù)合體抑制劑，可調(diào)節(jié)PERK-eIF2α 信號(hào)通路的活性，促使未折疊蛋白降解，緩解ERS 壓力，抑制ERS 所致的細(xì)胞凋亡。salubrinal 可降低LPS 誘導(dǎo)CHOP 的 mRNA 表達(dá)［9］。Liu 等［10］研究證實(shí) ERS 時(shí)，GRP78 表達(dá)增多可使CHOP 的表達(dá)減少。salubrinal可通過減輕ERS 抑制CHOP、caspase-12 表達(dá)起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用［11］。

本研究應(yīng)用PERK-eIF2α通路中的eIF2α去磷酸化抑制劑 salubrinal 干預(yù) PM2.5 刺激 MH-S 細(xì)胞，觀察到單純PM2.5 刺激時(shí)，CHOP 表達(dá)熒光增強(qiáng)，進(jìn)入核內(nèi)增多，表明PM2.5 誘導(dǎo)MH-S 細(xì)胞發(fā)生了ERS，當(dāng)給予 salubrinal 干預(yù)后，MH-S 細(xì)胞內(nèi) CHOP 表達(dá)的熒光強(qiáng)度減弱，證明salubrinal對(duì)ERS起到抑制作用，減少了CHOP 的表達(dá)活化。本研究應(yīng)用salubrinal 減弱PM2.5 誘導(dǎo)的ERS 過程中的CHOP 熒光強(qiáng)度，同時(shí) IL-17 分泌減少，HDAC2 活性增強(qiáng)，salubrinal 有可能是通過減少CHOP 表達(dá)來起到了抑制PM2.5 所致炎癥的過程，有待進(jìn)一步研究。用salubrinal 干預(yù)PM2.5 刺激的 MH-S 細(xì)胞，GRP78 表達(dá)增高，這與Chen 等 的 研 究 結(jié) 果 一 致［12］。 加 入 salubrinal 后GRP78 增高可能體現(xiàn)了其保護(hù)性作用。GRP78 參與多種細(xì)胞生理過程。它是一種抗凋亡蛋白，并且在細(xì)胞生存、增殖及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。但在PM2.5 作用下 salubrinal 誘導(dǎo)的 GRP78 增高對(duì)炎癥的可能作用及機(jī)制并不清楚，有待下一步研究。salubrinal減少IL-17的釋放，提高HDAC2活性，可能為改善慢阻肺激素抵抗提供新的治療思路。