楊 冰， 朱路明， 江麗麗， 王 菁△， 覃 元

（1武漢市第八醫(yī)院呼吸科，湖北武漢430010；2武漢大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室，湖北武漢430071）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種炎性肺部疾病，常由感染、敗血癥或局部缺血/再灌注損傷引起，其特征是由于中性粒細胞浸潤和促炎細胞因子和趨化因子分泌，造成肺水腫、炎癥、肺泡-毛細血管膜損傷以及富含蛋白質(zhì)的液體滲入肺泡區(qū)域［1］。急性肺損傷作為一種急性炎癥疾病，可使位于肺上皮的中性粒細胞遷移以及促炎和細胞毒性介質(zhì)釋放，并導致肺泡巨噬細胞分泌細胞因子，如白細胞介素 1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、IL-8、IL-10 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），從而刺激炎癥發(fā)展并最終導致肺纖維化［2-3］。這種炎癥過程導肺泡表面活性劑失活并引起I 型和II 型肺泡上皮細胞死亡，增加屏障通透性并降低肺泡液清除率，使大分子進入間隙，引起肺水腫［4］。巨噬細胞作為急性肺損進程的重要參與者，可極化為M1 和M2 兩種表型，M1 巨噬細胞為有利于炎癥的形態(tài)，能產(chǎn)生多種促炎細胞因子［5］。高遷移率族盒蛋白1（high mobility group box protein-1，HMGB-1）是一種脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）結合蛋白，介導炎癥發(fā)生，與急性肺損傷的發(fā)展密切相關［6-7］。并且有研究表明，HMGB-1 可以促進巨噬細胞向 M1 表型轉化［8］。所以HMGB-1 介導的巨噬細胞極化可能是急性肺損傷的關鍵病理進程和潛在治療靶點。

黃芩苷（baicalin；5，6-二羥基-7-O-葡糖醛酸黃酮苷）是從黃芩中提取的黃酮類化合物，用于治療支氣管炎、腎炎、哮喘、特應性皮炎、肝炎等疾病［9］。近年已有許多針對黃芩苷的研究，但是黃芩苷對急性肺損傷的治療作用機制尚未完全明確［10-11］。黃芩苷有良好的抗炎作用，而巨噬細胞炎癥反應在急性肺損傷中發(fā)揮巨大作用，有研究表明黃芩苷可以通過抑制 HMGB-1 減輕神經(jīng)炎癥［12-13］，故推測其可以通過HMGB-1 減少肺部巨噬細胞的M1 型極化發(fā)揮保護作用［14］。

材料和方法

1 實驗材料

人單核細胞系U937 購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。昆明小鼠購于南京君科生物工程有限公司（動物合格證號為RAWMX-90021）。RPMI-1640 培養(yǎng)液和新生胎牛血清購自Gibco；佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）購于Sigma；黃芩苷購于上海麥克林公司；LPS 購于 Sigma；HMGB-1 中和抗體（HMGB-1 neutralizing antibody，HMGB-1 Ab）購 于Arigo；HMGB-1 抗體、CD86 抗體和 HRP 標記的Ⅱ抗購于 CST；Trizol RNA 分離試劑購于 Thermo Fisher；逆轉錄試劑盒與實時熒光定量PCR 試劑盒購于Ta-KaRa；CCK-8 試劑盒購于 AbMole；IL-1β 和 TNF-α ELISA試劑盒購于廈門慧嘉生物。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) U937 細胞系懸浮培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，在37 ℃、5 % CO2恒溫培育箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代。將U937細胞用50 μg/L PMA 處理24 h 誘導巨噬細胞樣分化。細胞分為：（1）對照（control）組：給予等量 PBS；（2）模型（LPS）組：加入 LPS 終濃度 1 mg/L 孵育 6 h；（3）黃芩苷組：用黃芩苷 50 μmol/L 孵育 1 h 后，再加入 LPS 終濃度 1 mg/L 孵育 6 h；（4）HMGB1 中和抗體 10 mg/L孵育1 h后，再加入LPS終濃度1 mg/L孵育6 h.

2.2 Western blot檢測蛋白水平 細胞給藥處理后，用PBS 緩沖液洗滌細胞3 次，然后用RIPA 緩沖液溶解細胞。裂解液于4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清進行蛋白定量得到蛋白樣品。樣品進行SDSPAGE，轉膜于聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用8%的脫脂奶粉進行封閉2 h，封閉后用稀釋后的抗體于4 ℃孵育，隨后孵育相應Ⅱ抗。最后用ECL成像系統(tǒng)發(fā)光顯影。

2.3 RT-qPCR 實驗 給藥處理后，加入Trizol RNA分離試劑提取細胞RNA 后，提純RNA，測量RNA 濃度，按照說明書要求進行逆轉錄反應。實時熒光定量 PCR 的程序為：預變性 95 ℃ 30 s；變性 95 ℃5s，退火/延伸60 ℃ 10 s，45個循環(huán)。測定結果用 2-ΔΔCt計算方法處理數(shù)據(jù)。IL-1β 的上游引物序列為5'-AGCTACGAATCTCCGACCAC-3'，下游引物序列為5'-CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA-3'；TNF-α的上游引物序列為5'-AGCCGATGGGTTGTACCT-3'，下游引物序列為5'-TGAGTTGGTCCCCCTTCT-3’；β-actin 的上游引物序列為5'-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3'，下游引物序列為5'-CAGGGCAGTGATCTCCTTCT-3'。

2.4 流式細胞術 細胞進行給藥處理后，棄掉培養(yǎng)基，用PBS 緩沖液清洗后，按照試劑盒說明書進行染色，在流式細胞儀上檢測細胞CD86的表達。

2.5 CCK-8 實驗檢測細胞活力 細胞進行給藥處理后，將原細胞上清液棄掉，按照CCK-8 試劑盒要求，加入以培養(yǎng)基：CCK-8 液=10∶1 新配的 CCK-8 溶液，放回孵箱中孵育到顏色深淺合適時結束孵育。使用多模式讀取器在波長450 nm 處測量吸光度（A）值，以吸光度計算細胞活力。

2.6 動物實驗 雄性昆明小鼠30 只，隨機分為3組：（1）對照組：一次性給予3 mg/kg 生理鹽水腹膜內(nèi)注射；（2）模型組：一次性給與3 mg/kg LPS 腹膜內(nèi)注射；（3）黃芩苷處理組：每天100 mg/kg 黃芩苷灌胃，第10 天給與3 mg/kg LPS 腹膜內(nèi)注射。48 h 后處死小鼠，并用Hanks 緩沖液灌注小鼠肺后收集肺泡灌洗液。小鼠處死后將肺切下，吸干稱重以獲得“濕重”，然后將其置于80 ℃的干燥箱中48 h 以獲得“干重”。計算肺濕重與干重的比率以評估組織水腫。

2.7 ELISA 實驗 將收集好的肺泡灌洗液于4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，取上清，按照制造商的說明使用IL-1β和TNF-α的ELISA試劑盒進行測定。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0 軟件分析實驗結果。實驗數(shù)據(jù)表示用均數(shù)±標準差（mean±SD）的方式表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），并進一步采用Bonferroni 法進行兩兩組間數(shù)據(jù)差異的比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 黃芩苷抑制LPS誘導的U937巨噬細胞向M1極化

與對照組相比，U937 巨噬細胞用LPS 處理后，HMGB-1 蛋白表達明顯上升（P＜0.05），相較于LPS組，用黃芩苷處理后HMGB-1 蛋白表達明顯下降（P＜0.05），見圖1A。與對照組相比，LPS 處理后，U937巨噬細胞的 M1 表型標志物 IL-1β 和 TNF-α 的 mRNA水平明顯上升（P＜0.01）；相較于LPS 組，用黃芩苷處理后M1 表型標志物明顯下降（P＜0.01），見圖1B、C。與對照組相比，用LPS 處理的U937 巨噬細胞CD86表達水平顯著上升［（88.5±12.3）%vs（6.5±1.2）%，P＜0.05］，相較于LPS 組，黃芩苷處理組U937 巨噬細胞 CD86 表達水平顯著下降［（72.5±10.4）%vs（88.5±12.3）%，P＜0.01］，見圖1D。

Figure 1.Baicalin inhibited LPS-induced U937 macrophage polarization to M1.A：Western blot was used to detect the expression of HMGB-1 protein in each group；B：RT-qPCR detection of IL-1β mRNA；C：RT-qPCR detection of TNF-α mRNA；D：flow cytometry was used to detect the expression of CD86.Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05 vs LPS group.圖1 黃芩苷抑制LPS誘導的U937巨噬細胞向M1極化

2 黃芩苷增加LPS誘導的U937細胞活力

使用CCK-8 實驗測定細胞活力，與對照組相比，LPS 組的細胞活力明顯降低（P＜0.01），而黃芩苷處理組的細胞活力相較于LPS 組明顯上升（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.Baicalin enhanced the viability of U937 macrophages.Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05 vs LPS group.圖2 黃芩苷提升U937巨噬細胞細胞活力

3 HMGB1 Ab 抑制 LPS 誘導的 U937 巨噬細胞向M1極化

將HMGB-1 Ab加入炎癥模型的U937細胞中，結果表明，與LPS 組相比，HMGB-1 Ab 可以明顯降低LPS 造成的M1 表型標志物的mRNA 水平上升（P＜0.01），見圖3A、B。同時，HMGB-1 Ab 可以明顯降低LPS 誘導的 CD86 高表達［（64.7±8.2）%vs（74.1±7.5）%，P＜0.05］，見圖3C。

Figure 3.HMGB-1 neutralizing antibody（HMGB-1 Ab）inhibited LPS-induced U937 macrophage polarization to M1.A and B：RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of IL-1β and TNF-α，respectively；C：the expression of CD86 was detected by flow cytometry.Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05 vs LPS group.圖3 HMGB-1中和抗體抑制LPS誘導的U937巨噬細胞向M1極化

4 黃芩苷緩解急性肺損傷模型小鼠的肺部炎癥

與對照組相比，模型組的肺濕干重比顯著增加（6.8±1.4vs3.7±0.8，P＜0.01），而黃芩苷處理組的肺濕干比較模型組明顯降低（5.5±1.2vs6.8±1.4，P＜0.05），見圖4A。與對照組相比，模型組的HMGB-1 和M1 表型標志物明顯增多（P＜0.05），而黃芩苷處理組與模型組相比明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），見圖4B～D。

Figure 4.Baicalin attenuated lung inflammation in acute lung injury model mice.A：lung wet/dry（W/D）weight ratio of the mice in each group；B，C and D：the concentrations of HMGB-1，IL-1β and TNF-α in the alveolar lavage fluid were measured by ELISA，respectively.Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs LPS group.圖4 黃芩苷減輕急性肺損傷模型小鼠的肺部炎癥

討 論

急性肺損傷是一種嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病，患者治療預后差，死亡率高。臨床主要表現(xiàn)為雙側彌漫性肺浸潤，肺水腫，引起低氧血癥，肺順應性降低和有效余氣量降低［15-16］。急性肺損傷是由肺部損傷造成的全身性炎癥反應發(fā)展而成。越來越多的證據(jù)表明，巨噬細胞在急性肺損傷發(fā)病的過程中發(fā)揮了重要的作用，肺泡巨噬細胞和從血液中募集的巨噬細胞都參與其中［17-18］。巨噬細胞在炎癥反應發(fā)展過程中具有多方面作用。通常，它們在早期發(fā)揮促炎作用，而在晚期發(fā)揮抗炎作用。按照對環(huán)境刺激的反應進行分類，巨噬細胞有兩種極化狀態(tài)：經(jīng)典激活表型（M1）和交替激活表型（M2），M1 巨噬細胞的特征是高抗原呈遞和促炎細胞因子（如IL-1β，IL-12，IL-23 及 TNF-α）的高表達，M1 型巨噬細胞與炎性，清除微生物和腫瘤細胞活性有關［19-20］。在急性肺損傷中，外周血單核細胞被募集到肺泡腔中，分化為具有M1表型的巨噬細胞［21］。過度的炎癥反應會導致組織損傷，已有研究表明，消除肺部巨噬細胞或消耗促炎細胞因子可以減輕肺損傷［16］。表明巨噬細胞的表型轉化是急性肺損傷治療中一個潛在靶點。HMGB-1 是一種LPS 結合蛋白，能誘導產(chǎn)生促炎癥細胞因子［22］。有研究證明，在自身免疫性心肌炎模型小鼠中，HMGB-1 促進了巨噬細胞向 M1 樣表型的極化［8］。推測HMGB-1 介導的巨噬細胞向M1 轉化可能是急性肺損傷的治療靶點。

黃芩作為一味傳統(tǒng)中藥，是唇形科黃芩屬多年生草本植物，其以根入藥，味苦、性寒，有清熱燥濕、瀉火解毒、止血和安胎等功效。主治溫熱病、上呼吸道感染、肺熱咳嗽、濕熱黃膽、肺炎、痢疾和咳血等癥［23］。而黃芩苷作為從黃芩中分離得到的主要活性成分而受到關注，已有許多關于黃芩苷的研究。有報道黃芩苷對內(nèi)毒素相關的多組織損傷具有治療作用，包括心肌功能障礙［24］，還可以通過抑制細胞炎癥因子表達在神經(jīng)退行性疾病模型中發(fā)揮神經(jīng)保護作用［25-26］，對LPS 引起的腎炎也有治療作用［27］。黃芩苷可以降低血管平滑肌細胞的 HMGB-1 表達［28］，降低神經(jīng)元細胞HMGB-1 和炎癥因子表達發(fā)揮抗抑郁作用［29］。這些發(fā)現(xiàn)表明黃芩苷是炎癥疾病的潛在治療藥物，并且很可能通過抑制HMGB-1 發(fā)揮抗炎作用，為了驗證黃芩苷治療急性肺損傷的機制，我們用人巨噬細胞系U937 進行實驗。巨噬細胞M1 表型為促炎表型，特征為炎癥因子表達上升，如TNF-α、IL-1β和 IL-12 p70［30-31］。CD86 作為巨噬細胞 M1 表型的標志物，可以通過流式細胞術檢測細胞CD86的表達來驗證細胞表型［32］。使用Western blot 和流式細胞術檢測M1 標志物的結果顯示，黃芩苷可以抑制LPS 引起的巨噬細胞向M1 表型極化，并降低其誘導的HMGB-1 蛋白水平升高。表明炎癥模型下HMGB-1表達增加且巨噬細胞向M1極化，而黃芩苷可以抑制這些現(xiàn)象起到保護作用，說明黃芩苷的抗肺損傷作用與其相關。在炎癥模型下，巨噬細胞的細胞活性下降，而加入黃芩苷可以防止這一效果。并且使用HMGB-1 中和抗體時，可以達到和黃芩苷類似的效果，說明黃芩苷是通過HMGB-1 來抑制巨噬細胞向M1 表型轉化的。總之，細胞實驗證明黃芩苷通過抑制HMGB-1 抑制巨噬細胞向M1 轉化，并且有細胞保護作用。動物實驗中，黃芩苷灌胃的小鼠的肺泡灌洗液中的HMGB-1 和M1 表型標志物，也是炎癥因子的IL-1β 和TNF-α 表達相對于模型組顯著減少，在體驗證黃芩苷通過抑制HMGB-1 抑制巨噬細胞M1 表型的作用，肺濕干重比的結果也表明黃芩苷對LPS造成的肺水腫有明顯保護作用。表明黃芩苷可以抑制LPS 造模帶來的HMGB-1 升高和巨噬細胞M1 表型，減少肺組織水腫，從而發(fā)揮抗急性肺損傷的作用。

盡管急性肺損傷的發(fā)病率仍然很高，但近20 年來對其病理生理學的研究已使死亡率大幅降低。目前治療的重點是通過呼吸機和藥物干預如糖皮質(zhì)激素來限制其進展，這些措施可以減少在肺內(nèi)皮和上皮屏障處出現(xiàn)的炎癥。但現(xiàn)有的治療藥物仍有缺陷，除機械呼吸外，需要更安全副作用小的藥物治療急性肺損傷。因此，開發(fā)一種更安全有效的急性肺損傷治療方法是緊迫而重要的［17］。本文對治療急性肺損傷的藥物研發(fā)和選取提供了新思路，為黃芩苷作為急性肺損傷和其他炎性疾病的藥物提供研究基礎。