熊建團(tuán) ， 顧鈴毓 ， 王青青 ， 丁 寧 ， 董小艷 ， 劉達(dá)越 ，徐靈博 ， 焦 運(yùn) ，4， 姜怡鄧 △

（1寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，3國(guó)家衛(wèi)生健康委代謝性心血管疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏血管損傷與修復(fù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，4寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，寧夏銀川750000）

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種慢性代謝性綜合征，其特征是非酒精性因素引起的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪變性［1］，其發(fā)病率在我國(guó)常見(jiàn)的肝臟疾病中較高［2］。肝臟是同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）合成和代謝的重要調(diào)節(jié)器官。已有研究表明慢性肝病、肝硬化和肝癌等肝臟疾病患者血漿Hcy濃度顯著升高［3］，因此Hcy在NAFLD中的作用日益受到重視。Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是人類發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)TLR相關(guān)蛋白［4］。作為識(shí)別細(xì)胞表面病原的分子之一，TLR4 被激發(fā)后通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死、炎癥和纖維化［5］，但TLR4/NF-κB 信號(hào)通路是否在胱硫醚β-合成酶（cystathionine β-synthase，CBS）基因雜合敲除（CBS+/-）小鼠NAFLD的形成過(guò)程中發(fā)揮作用仍需進(jìn)一步探索。因此，本研究主要探討TLR4/NF-κB通路對(duì)NAFLD的影響，以期為防治NAFLD提供新的研究思路。

材料和方法

1 材料

Avanti J-30I 型高速低溫離心機(jī)（Beckman Coulter）；超純水儀（Millipore）；相差顯微鏡（Olympus）；FTC-3000型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Funglyn Biotech）；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀和凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD）。RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco）；RNA 提取試劑盒（北京天根技術(shù)有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；抗TLR4 抗體和抗NF-κB 抗體（Abcam）；總膽固醇（total cholesterol，TC）及甘油三酯（triglyceride，TG）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；蛋白提取試劑盒（北京天根技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 小鼠的飼養(yǎng)及分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)于北京維尚利德公司，隨機(jī)選取4 周齡CBS基因正常（CBS+/+）小鼠（n=6）及CBS+/-小鼠（n=6）均給予高蛋氨酸飲食。

2.2 小鼠血清TC、TG和Hcy濃度的檢測(cè)及肝指數(shù)的計(jì)算 將CBS+/+組和CBS+/-組小鼠禁飲食12 h 后稱重，麻醉并眼球取血，靜置30 min 后分離血清。將血清樣本交予金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)集團(tuán)股份有限公司，應(yīng)用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清中TC、TG 和Hcy 水平。隨后將小鼠開(kāi)腹并分離肝臟，用生理鹽水清洗肝臟后稱重（g），并計(jì)算肝指數(shù)。肝指數(shù)（%）=肝重/體重×100%。

2.3 小鼠肝臟組織TC 及TG 含量的測(cè)定 稱取肝組織100 mg，用冷的生理鹽水漂洗后加入1.9 mL 勻漿介質(zhì)，冰浴下使用勻漿器（2 000 r/min）勻漿5 min后離心吸取上清即為10%肝勻漿。使用GPO-PAP法檢測(cè)勻漿中的TC和TG含量。

2.4 HE 及油紅O 染色檢測(cè)肝組織形態(tài)的變化 取大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的肝組織，用10%中性甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片機(jī)切厚度為5 μm的片子。HE 染色后，光鏡下觀察肝臟形態(tài)學(xué)的改變，每張切片觀察5 個(gè)視野。取肝臟的冰凍切片進(jìn)行油紅O染色，肝細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，脂滴呈紅色。

2.5 RT-qPCR 檢測(cè)肝臟組織中 TLR4 及 NF-κB 的mRNA 表達(dá) 按照總RNA 提取說(shuō)明書(shū)提取肝組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)引物。TLR4 的上游引物序列為5'-AGACCTGTCCCTGAACCCTAT-3'，下游引物序列為5'-CGATGGACTTCTAAACCAGCCA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物 147 bp；NF-κB 的上游引物序列為5'-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3'，下游引物序列為5'-TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物 104 bp；內(nèi)參照GAPDH 的上游引物序列為5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'，下 游 引 物 序 列 為 5'-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物 183 bp。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；擴(kuò)增階段95 ℃變性5 s、60 ℃退火 20 s、72 ℃延長(zhǎng) 30 s，50 個(gè)循環(huán)。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt待測(cè)樣品-ΔCt校正樣品。

2.6 Western blot 檢測(cè) TLR4 和 NF-κB 蛋白的表達(dá)水平 取100 mg肝臟組織，剪碎，加入1 mL PMSF 裂解液，用勻漿器在冰上勻漿數(shù)秒，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。取上清液以BCA 法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定；取等量蛋白與5×上樣緩沖液混合煮沸5 min后進(jìn)行SDS-PAGE（濃縮膠恒壓80 V，30 min；分離膠恒壓120 V，1 h）；4 ℃、恒流0.3 A、2 h 電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，PBST洗膜；分別加入兔抗人TLR4和NF-κB 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜，PBST洗膜；加入對(duì)應(yīng)的Ⅱ抗（1∶5 000）放置4 ℃過(guò)夜，PBST洗膜后進(jìn)行曝光。采用Image Lab 軟件對(duì)TLR4 和NF-κB及β-actin的灰度值進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用Student-Newman-Keuls法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組小鼠血清Hcy水平的變化

與CBS+/+組小鼠相比，CBS+/-組小鼠血清中Hcy水平升高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明高同型半胱氨酸血癥動(dòng)物模型誘導(dǎo)成功，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The serum levels of Hcy in CBS+/+ and CBS+/- groups.Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs CBS+/+group.圖1 CBS+/+組與CBS+/-組小鼠血清Hcy水平的比較

2 兩組小鼠肝指數(shù)的比較

與CBS+/+組小鼠相比，CBS+/-組小鼠的肝指數(shù)顯著升高（P＜0.05），提示 Hcy 引起肝臟重量增加，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Liver-to-body weight ratio of the mice in CBS+/+and CBS+/-groups.Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs CBS+/+group.圖2 CBS+/+組與CBS+/-組小鼠肝體比

3 小鼠肝臟組織和血清中TC及TG含量的比較

與CBS+/+組比較，CBS+/-組小鼠肝組織（圖3）及血清（圖 4）中 TG 和 TC 含量顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），表明Hcy能夠提高血脂水平。

Figure 3.The contents of TC and TG in liver tissue.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs CBS+/+group.圖3 肝組織中TC和TG含量的比較

Figure 4.The contents of TC and TG in serum.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs CBS+/+group.圖4 血清中TC和TG含量的比較

4 兩組小鼠肝臟組織形態(tài)變化的比較

將HE 及油紅O 染色切片置于低倍鏡下觀察，結(jié)果顯示CBS+/+組小鼠肝小葉界限較清楚，細(xì)胞分布于中央靜脈周圍，大小較一致，可見(jiàn)肝竇，無(wú)脂肪變性。CBS+/-組小鼠肝細(xì)胞脂肪變性明顯，細(xì)胞質(zhì)可見(jiàn)大小不等的圓形空泡，偶爾可見(jiàn)重度脂肪變性，且小葉內(nèi)因炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可引起壞死灶融合成片。見(jiàn)圖5。

Figure 5.HE and oil red O staining of liver tissue（scale bar=500 μm）.The transparent vesicles shown by the black arrows represent lipid droplets，the red represents the cytoplasm，and the blue represents the nucleus in HE staining.Red represents lipid droplets，and blue represents cell nuclei in oil red O staining.圖5 肝組織的HE及油紅O染色觀察

5 兩組小鼠肝組織中 TLR4 和 NF-κB 的 mRNA 和蛋白表達(dá)水平的比較

與CBS+/+組比較，CBS+/-組小鼠肝組織 TLR4 和NF-κB 的mRNA（圖6）及蛋白（圖7）表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）。

Figure 6.The mRNA expression of TLR4 and NF-κB in the liver tissues.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs CBS+/+group.圖6 肝組織中TLR4和NF-κB的mRNA表達(dá)

Figure 7.Protein expression of TLR4 and NF-κB in the liver tissues.Mean±SD. n=6.*P＜0.01 vs CBS+/+group.圖7 肝組織中TLR4和NF-κB的蛋白表達(dá)

6 TLR4和NF-κB表達(dá)與TC和TG的相關(guān)性分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證 TLR4 及 NF-κB 與 NAFLD 發(fā)生的相關(guān)性，對(duì)CBS+/-組小鼠TLR4 蛋白表達(dá)與TC 和TG含量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，TLR4 蛋白表達(dá)與TC 和TG 含量呈正相關(guān)（r2=0.623 6，r2=0.707 6），NF-κB蛋白表達(dá)與TC和TG含量呈正相關(guān)（r2=0.812 3，r2=0.751 2），見(jiàn)圖 8。表明 TLR4/NF-κB 信號(hào)通路與NAFLD的發(fā)生密切相關(guān)。

Figure 8.Analysis of the correlation between the protein expression of TLR4/NF-κB and the content of TC/TG in liver tissue.圖8 肝組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)與TC和TG含量的相關(guān)性分析

討 論

隨著生活方式和飲食結(jié)構(gòu)不斷改變，我國(guó)人口肥胖程度不斷增加，導(dǎo)致NAFLD 患病率出現(xiàn)快速且大規(guī)模增長(zhǎng)，而其發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制尚不完全清楚［6］。作為一種常見(jiàn)慢性肝臟疾病，NAFLD 包含多種肝臟組織學(xué)異常，其特征為炎癥產(chǎn)生和組織損傷。NAFLD 起始于甘油三酯在肝細(xì)胞中的堆積，進(jìn)而引起脂肪變性或非酒精性脂肪肝形成，后期可進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎，如不進(jìn)行干預(yù)治療，最終可導(dǎo)致纖維化及肝細(xì)胞癌等疾病產(chǎn)生［7］。有研究表明NAFLD 的發(fā)生發(fā)展與“多重打擊”學(xué)說(shuō)中氧化應(yīng)激，脂質(zhì)過(guò)氧化等多種病理過(guò)程有關(guān)［8］。

本研究發(fā)現(xiàn)CBS+/-小鼠中肝臟與體重比值及TC和TG 含量增加，脂肪變性明顯，表明CBS缺乏可引起NAFLD的形成。CBS是一種存在于轉(zhuǎn)硫途徑中重要的催化酶，其基因突變使得酶活性降低或缺乏，進(jìn)一步導(dǎo)致血漿 Hcy 水平升高［9］，Hcy 升高可以改變細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝并促進(jìn)肝脂肪積蓄［10］。因此，CBS缺乏可導(dǎo)致肝臟脂肪變性和肝功能障礙，其機(jī)制涉及肝臟中毒性同型半胱氨酸的積累或缺乏細(xì)胞保護(hù)性的胱硫氨酸和H2S的生成等過(guò)程［11］。

TLRs 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類模式識(shí)別受體，通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)分子，激活天然免疫，最終產(chǎn)生一系列炎癥細(xì)胞因子釋放和啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答［12］。NF-κB 是TLR4 信號(hào)通路的下游效應(yīng)蛋白，一種普遍存在且重要的核轉(zhuǎn)錄因子［13］。通過(guò)檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)CBS缺乏可引起 Hcy 升高，進(jìn)而激活 TLR4/NF-κB 信號(hào)通路，且NF-κB 信號(hào)通路與NAFLD 的發(fā)生密切相關(guān)。在內(nèi)皮細(xì)胞中，Hcy 可通過(guò)增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生進(jìn)而促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，其機(jī)制涉及上調(diào)NF-κB［14］，同時(shí)已有研究表明 ROS 的大量產(chǎn)生能夠促進(jìn) TLR4 表達(dá)升高［15］。因此，我們將繼續(xù)探索Hcy 引起NAFLD 的發(fā)生是否與氧化應(yīng)激及TLR4/NF-κB信號(hào)通路相互作用有關(guān)。

綜上所述，本研究表明TLR4/NF-κB 信號(hào)通路可能在CBS+/-小鼠非酒精性脂肪肝的形成中扮演著重要作用。