賴根祥， 朱桂東， 何慧明

（1麗水市第二人民醫(yī)院精神科，2麗水學院醫(yī)學與健康學院科研辦，浙江麗水323000）

抑郁癥作為一種嚴重的情感障礙性精神疾病，其發(fā)病率逐年增加，并逐漸成為全球性公共衛(wèi)生問題，給人們帶來了沉重的健康和經濟負擔［1］，因此尋找有效的抗抑郁藥迫在眉睫。過往認為，腦源性神經營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）失調和神經遞質改變等為抑郁癥的發(fā)病基礎，近年來腦內炎癥和氧化應激被認為與抑郁癥密切相關［2］。研究顯示，環(huán)境中的慢性壓力可引發(fā)機體的炎癥反應，導致大腦神經細胞損傷，而腦損傷的過程也涉及高氧化應激反應［3-4］。通過提高抗氧化酶活性，可降低機體活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，減輕其誘導的氧化損傷，并可抑制炎癥通路活化，保護神經元結構的完整性，從而減輕抑郁癥狀［5-6］。核因子E2 相關因子 2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/血 紅 素 加 氧 酶 1（heme oxygenase-1，HO-1）信號通路為機體主要的抗氧化信號通路之一，在氧化應激條件下，Nrf2 從與Keap1 結合的聚合物中釋放出來并轉移到細胞核中，與HO-1等基因的啟動子序列結合，引起其轉錄和蛋白水平變化，進而激活細胞的抗氧化保護程序［7］。研究表明，Nrf2/HO-1 信號通路蛋白含量下調及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性降低，引起機體ROS 水平增高，在氧化應激和炎癥損傷中發(fā)揮重要作用，與抑郁癥密切相關，可能是其治療靶標［8］。由于目前抗抑郁藥僅可減輕或消除病理性抑郁情緒，不能影響其病理過程，且存在不同程度的副作用，因此，抑郁癥發(fā)病機制中的關鍵通路可能成為新型抗抑郁藥物的作用靶點。

迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）存在于薄荷和紫蘇等唇形科藥用植物中，具有抗氧化、消炎和抗凋亡等作用［9］。研究顯示，RA 可上調 Nrf2 和 HO-1 的表達，減輕氧化應激并抑制體內神經元死亡，具有神經保護作用［10］。另有研究指出［11］，RA 可通過促進海馬組織中ERK1/2的磷酸化，誘導其釋放BDNF，發(fā)揮抗抑郁作用。然而中藥可通過作用于多靶點在多維度發(fā)揮治療作用，RA 對抑郁癥的治療作用是否涉及Nrf2/HO-1 信號通路并不清楚。本研究采用孤養(yǎng)結合慢性不可預知性輕度刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）法復制抑郁癥大鼠模型，并基于Nrf2/HO-1 信號通路進一步分析RA 對抑郁癥的治療機制。

材料和方法

1 動物

60 只 SPF 級 6 周齡雄性 SD 大鼠，體重 180～200 g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（豫）2017-0001。統(tǒng)一適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

2 主要試劑及儀器

RA（純度≥98%；Sigma）；Nrf2 抑制劑 Nrf2-IN-1（MCE）；兔抗 HO-1、Nrf2 和 β-actin 單克隆抗體（CST）；兔抗NAD（P）H：醌氧化還原酶1［NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1，NQO1］、核纖層蛋白B（lamin B）和離子鈣結合銜接分子1（ionized calciumbinding adapter molecule 1，Iba1）單克隆抗體、兔抗BDNF 多克隆抗體、Alexa Fluor?488 標記的 IgG 及DAPI 試劑（Abcam）；ROS 和丙二醛（malonydialdehyde，MDA）檢測試劑盒（碧云天）；HE 染色試劑盒、SOD 檢測試劑盒及大鼠白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）ELISA 試劑盒（上海生工）。酶標儀和轉膜系統(tǒng)（Bio-Rad）；多功能酶標儀（BioTek）。

3 實驗方法

3.1 抑郁癥模型的制備及分組 將大鼠隨機分為：對照（control，Cont）組、CUMS 組、CUMS+RA 組和CUMS+RA+Nrf2-IN-1 組，每組 15 只。除 Cont 組，均采用孤養(yǎng)結合CUMS 法復制大鼠抑郁癥模型［12］。3周后，大鼠活動減少、皮毛暗淡發(fā)黃、糖水偏好指數(shù)降低，表明抑郁癥模型造模成功。于第4～6 周每天固定時間，依次給予上述各組大鼠生理鹽水、生理鹽水、10 mg/kg RA［11］和10 mg/kg RA+1 mg/kg Nrf2-IN-1灌胃治療1 次，連續(xù)3 周，給藥期間繼續(xù)進行CUMS刺激［12］。

3.2 糖水偏好實驗 末次給藥24 h 后，在安靜環(huán)境中進行該項實驗。將大鼠單獨置于籠中，實驗前2 d，放入加有1%蔗糖水溶液（200 mL）的2 個平口杯，以讓大鼠適應糖水；第3 天禁水禁食24 h，第4 天放入分別加有純水（200 mL）和1%蔗糖水溶液（200 mL）的2 個平口杯，并稱取兩杯質量，之后讓大鼠自由飲水，12 h 后更換兩杯位置，24 h 后再次稱取兩杯質量。糖水偏好指數(shù)（%）=［蔗糖水消耗量（/蔗糖水消耗量+純水消耗量）］×100%。

3.3 強迫游泳和懸尾實驗 強迫游泳和懸尾實驗參考文獻［13-14］進行，分別記錄大鼠被迫游泳和懸尾后4 min 內的靜止時間。游泳靜止標準：四肢完全不動身體浮出水面、僅頭部浮于水面或四肢間歇性微幅劃動以保持漂浮狀態(tài)。懸尾靜止標準：四肢完全不動或間歇性微幅擺動。

3.4 樣本采集 方法3.3 完成后，每組取5 只大鼠，麻醉后用磷酸鹽緩沖液和4%多聚甲醛溶液灌注，取出大腦在4 ℃條件下浸入4%多聚甲醛固定24 h，轉移到20%蔗糖溶液中，-80 ℃儲存，進行HE 染色和免疫熒光分析。剩余大鼠麻醉處死后，快速取出海馬組織，存儲在-80 ℃，進行Western blot 和相應檢測。

3.5 HE 染色和免疫熒光實驗 將方法3.4 中冷凍的腦組織切片（10 μm），依次與蘇木素染液和伊紅染液孵育后，使用顯微鏡觀察海馬組織中受損的細胞。另外，將冷凍切片依次與Ⅰ抗［Iba1（1∶200）］、Alexa Fluor?488 標記的Ⅱ抗（1∶500）和DAPI 避光孵育后，使用熒光顯微鏡觀察小膠質細胞活化情況。

3.6 Western blot 實驗 取方法3.4 凍存的部分海馬組織，裂解后提取總蛋白并采用試劑盒分別提取胞漿蛋白和核蛋白，均用BCA 法測定蛋白濃度。取30 μg 上述蛋白煮沸后上樣，電泳分離后轉至PVDF膜并封閉，加入Ⅰ抗［HO-1（1∶1 000）、NQO1（1∶250）、BDNF（1∶500）、Nrf2（1∶500）、β-actin（1∶1 000）和lamin B（1∶500）］，4 ℃過夜孵育，洗膜，加入Ⅱ抗（1∶1 000）孵育1 h，顯影后使用Tanon 凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照并進行灰度分析。

3.7 試劑盒檢測 取方法3.4 中凍存的海馬組織，稱重后制備勻漿液，取上清按照說明分別加入ROS、MDA、SOD、IL-6、IL-1β 和TNF-α 試劑盒中的相應試劑。ROS 水平使用熒光酶標儀檢測熒光強度表示；MDA 濃度使用酶標儀在波長530 nm 處檢測吸光度；SOD 活性使用酶標儀在波長560 nm 處檢測吸光度；IL-6、IL-1β 和 TNF-α 使用酶標儀檢測波長 450 nm 處吸光度。對照標準曲線計算上述指標水平。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0進行統(tǒng)計分析。采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示計量數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析行多組間比較，SNK-q檢驗進一步兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 RA對CUMS大鼠抑郁樣行為的影響

與Cont 組相比，CUMS 組大鼠強迫游泳和懸尾靜止時間延長（P＜0.05），糖水偏好指數(shù)降低（P＜0.05）；與 CUMS 組相比，CUMS+RA 組大鼠強迫游泳和懸尾靜止時間縮短（P＜0.05），糖水偏好指數(shù)增高（P＜0.05）；與 CUMS+RA 組相比，CUMS+RA+Nrf2-IN-1 組強迫游泳和懸尾靜止時間延長（P＜0.05），糖水偏好指數(shù)降低（P＜0.05）。見表1。

表1 4組大鼠抑郁樣行為的比較Table 1.Comparison of depression-like behaviors in the 4 groups（Mean±SD. n=15）

2 RA對CUMS大鼠海馬神經元的影響

HE 染色結果顯示，Cont 組海馬區(qū)神經元排列致密，細胞邊界清楚，染色均勻；而CUMS 組海馬神經元排列疏松紊亂，邊界模糊，胞核皺縮染色較深；給予RA 治療后，上述細胞損傷明顯改善，而Nrf2 抑制劑可逆轉這種改善作用。見圖1。

Figure 1.Morphological changes of hippocampal neurons in the 4 groups（HE staining）.The arrows showed degenerative neurons.A：Cont group；B：CUMS group；C：CUMS+RA group；D：CUMS+RA+Nrf2-IN-1 group.圖1 4組大鼠海馬神經元的形態(tài)改變

3 RA對CUMS大鼠小膠質細胞浸潤的影響

Cont組Iba1+小膠質細胞數(shù)量較少，體積較??；而CUMS 組Iba1+小膠質細胞數(shù)量和突起較多，體積較大；與 CUMS 組相比，CUMS+RA 組 Iba1+小膠質細胞數(shù)量和突起減少，體積變小；與CUMS+RA 組相比，CUMS+RA+Nrf2-IN-1組Iba1+小膠質細胞數(shù)量和突起增多，體積增大。見圖2。

Figure 2.Infiltration of microglia in the 4 groups（Iba1 immunofluorescence staining）.A：Cont group；B：CUMS group；C：CUMS+RA group；D：CUMS+RA+Nrf2-IN-1 group.圖2 4組大鼠小膠質細胞浸潤情況

4 RA 對 CUMS 大鼠海馬組織中 IL-6、IL-1β 和TNF-α水平的影響

與 Cont 組相比，CUMS 組海馬組織中 IL-6、IL-1β和 TNF-α 水平上升（P＜0.05）；與 CUMS 組相比，CUMS+RA 組 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 水 平下 降（P＜0.05）；與CUMS+RA組相比，CUMS+RA+Nrf2-IN-1組IL-6、IL-1β和TNF-α水平增高（P＜0.05）。見表2。

表2 4組大鼠海馬組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的比較Table 2.Comparison of IL-6，IL-1β and TNF-α levels in the 4 groups（ng/L.Mean±SD. n=10）

5 RA對CUMS大鼠海馬組織中氧化應激的影響

與 Cont 組相比，CUMS 組 ROS 和 MDA 水平升高（P＜0.05），SOD 活性降低（P＜0.05）；與 CUMS 組相比，CUMS+RA 組 ROS 和 MDA 水平下降（P＜0.05），SOD 活性升高（P＜0.05）；與 CUMS+RA 組相比，CUMS+RA+Nrf2-IN-1 組 ROS 和 MDA 水平升高（P＜0.05），SOD活性下降（P＜0.05）。見表3。

表3 4組大鼠ROS、MDA和SOD水平的比較Table 3.Comparison of ROS，MDA and SOD levels in the 4 groups（Mean±SD. n=10）

6 RA對CUMS大鼠海馬組織中Nrf2/HO-1信號通路相關蛋白的影響

與Cont 組相比，CUMS 組海馬組織中HO-1、NQO1、BDNF 及核/質 Nrf2 蛋白表達降低（P＜0.05）；與 CUMS 組相比，CUMS+RA 組 HO-1、NQO1、BDNF及核/質Nrf2 蛋白表達增高（P＜0.05）；與CUMS+RA組相比，CUMS+RA+Nrf2-IN-1 組HO-1、NQO1、BDNF及核/質Nrf2蛋白表達降低（P＜0.05），見圖3、表4。

Figure 3.The expression of Nrf2/HO-1 signaling pathway-related proteins in the 4 groups.A：Cont group；B：CUMS group；C：CUMS+RA group；D：CUMS+RA+Nrf2-IN-1 group.圖3 4 組大鼠海馬組織中Nrf2/HO-1 信號通路相關蛋白的表達情況

表4 4組大鼠海馬組織中Nrf2/HO-1信號通路相關蛋白表達的比較Table 4.The expression of Nrf2/HO-1 signaling pathway-related proteins in the 4 groups（Mean±SD. n=10）

討 論

抑郁癥為危害全球人類身心健康的常見精神疾病之一，臨床實踐中通常采用氟西汀等抗抑郁藥來治療抑郁癥，但只可減輕部分患者的抑郁情緒［15］，而不能從發(fā)病機制上實現(xiàn)治愈。大鼠等嚙齒類動物和人類之間的社交行為相似，因此常用來制備抑郁癥模型［16］。采用CUMS 法誘導的大鼠抑郁癥模型最明顯的特征是快感減退，這也是抑郁癥患者的基本癥狀，因此該模型可用于選擇理想的抗抑郁藥物及抑郁癥病理機制的進一步研究［17］。

CUMS 暴露導致的抑郁癥伴隨有小膠質細胞病變等神經損傷，正常情況下，小膠質細胞在中樞神經系統(tǒng)中以靜息狀態(tài)存在，當出現(xiàn)炎癥和創(chuàng)傷等異常刺激時被活化為具有巨噬細胞功能的狀態(tài)，介導神經炎癥和神經變性［18］，并分泌 IL-6、IL-1β 和 TNF-α等，在神經炎癥損傷中起重要作用。因此，抑制小膠質細胞介導的炎癥可能是減少抑郁樣行為的有效策略。本研究中，我們在CUMS 誘導的抑郁癥大鼠海馬組織中觀察到神經元損傷和小膠質細胞浸潤程度均顯著加重，且 IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平增高，證實了小膠質細胞介導的海馬神經炎癥損傷參與抑郁癥的病理過程，一方面，活化后的小膠質細胞向損傷部位遷移，并分泌TNF-α 和ROS等因子，這些因子具有細胞毒性，會損傷或殺死神經細胞，引起神經系統(tǒng)的炎癥［19］；另一方面，上述因子可進一步加劇小膠質細胞活化，加速神經系統(tǒng)病變進展，引起或加重神經損傷［20］。

腦部氧化應激和炎癥是相互影響的兩種病理過程，在抑郁癥［21］等多種神經系統(tǒng)疾病中共同發(fā)揮致病作用，Nrf2/HO-1 信號通路在其中發(fā)揮重要作用。當腦部處于應激狀態(tài)時，過量ROS 等刺激可使Nrf2與其阻遏蛋白Keap1 解離并誘導Nrf2 轉移至細胞核，與抗氧化反應元件結合，調節(jié)HO-1等抗氧化基因或BDNF 等表達，提高抗氧化和神經保護能力［22］。本研究檢測顯示，CUMS 組大鼠海馬組織中HO-1 和NQO1 及核/質 Nrf2 蛋白表達較 Cont 組降低，表明海馬組織中Nrf2/HO-1 信號通路參與CUMS 大鼠抑郁癥的病理進程。推測其機制可能為：（1）在CUMS 組大鼠中Nrf2/HO-1通路活化受抑，HO-1和NQO1等的表達較低，導致機體抗氧化能力較低，引起ROS 和MDA等水平升高，機體處于高氧化應激狀態(tài)，損傷神經系統(tǒng)［23］；（2）Nrf2/HO-1通路活化受抑引起B(yǎng)DNF等神經保護因子水平降低，導致其對小膠質細胞炎癥和ROS 等氧化損傷的保護作用不足，從而加重抑郁癥的病理過程中神經炎癥和腦氧化損傷［24］。

RA 具有抗氧化、抗焦慮和抗抑郁等藥理活性，可通過減少活性氧反應性物質的產生，降低脂多糖誘導的星形膠質細胞壞死［25］，還可減輕脂多糖誘導的神經炎癥和氧化應激，改善小鼠記憶力和行為障礙［26］。本研究檢測到，給予 RA 治療后，CUMS 大鼠快感增加，抑郁樣行為和小膠質細胞炎癥減輕，IL-6、IL-1β、TNF-α、ROS 和 MDA 水平降低，HO-1、NQO1、BDNF 和核/質 Nrf2 蛋白表達及 SOD 水平均升高，表明RA 可活化Nrf2/HO-1 信號通路，減輕小膠質細胞炎癥反應和氧化應激，改善CUMS 所致抑郁樣行為。分析其作用機制可能為：（1）RA 可促進 Nrf2/HO-1 信號通路活化來上調HO-1 和NQO1 等表達，增強清除ROS 的能力，減輕其造成的氧化損傷并阻斷其對炎癥反應的激活，減少對神經的損傷［27］；（2）RA 可減少小膠質細胞炎癥和炎癥因子產生，從而減輕神經炎癥［28］；（3）RA 可增加BDNF 等表達，從而提高機體的神經保護能力［29］。同時，本研究結果還顯示，RA 對CUMS 大鼠抑郁樣行為的改善作用及對氧化應激和小膠質細胞炎癥的抑制作用可被Nrf2 抑制劑阻斷，進一步佐證上述推測。

綜上所述，RA 可通過活化海馬組織中Nrf2/HO-1 信號通路，降低ROS 水平，抑制其造成的氧化應激和炎癥損傷，減輕CUMS 大鼠抑郁癥狀，進一步豐富了RA 的藥理機制。然而抑郁癥涉及機制復雜，且RA 可能作用于多通路進而減輕抑郁癥狀，其作用機制有待繼續(xù)完善。