曾 煉， 劉晨光， 孫曉東， 丁旭東， 桑 明， 羅輝宇

（湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院，湖北襄陽441000）

羅哌卡因（ropivacaine）作為酰胺類局麻藥的代表，被廣泛應用于周圍神經(jīng)阻滯，椎管內(nèi)麻醉以及疼痛治療［1］。流行病學的研究發(fā)現(xiàn)羅哌卡因在大劑量和長時間的作用下會產(chǎn)生神經(jīng)毒性，而目前尚無安全有效的預防及治療措施［2-3］。羅哌卡因誘導神經(jīng)毒性涉及多種機制，包括神經(jīng)元鈣超載，神經(jīng)元凋亡以及神經(jīng)元自噬［3-6］。線粒體自噬（mitochondrial autophagy，mitophagy）屬于細胞自噬的特殊類型，其目的在于去除受損的線粒體。理論上，適度的線粒體自噬可以維持神經(jīng)元內(nèi)穩(wěn)態(tài)，但當線粒體自噬過度激活時，會導致神經(jīng)元線粒體功能進行性的損害，最終誘導神經(jīng)元死亡［7-8］。在羅哌卡因誘導神經(jīng)元損傷的過程中，已有研究證實羅哌卡因會導致神經(jīng)元線粒體功能障礙［9-11］，但尚無研究報道其對于神經(jīng)元線粒體自噬的作用，同時研究表明信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）可以通過第727 位點絲氨酸的磷酸化保護神經(jīng)元線粒體功能，抑制過度的線粒體自噬［12-13］。故此，本項工作旨在探討羅哌卡因?qū)Υ笫笫茹t細胞瘤PC12 細胞線粒體自噬及STAT3 磷酸化的作用。

材料和方法

1 實驗材料

PC12 細胞購自于中科院上海細胞庫；鹽酸羅哌卡因（原料藥，純度：99.99%，恒瑞醫(yī)藥）；高糖DMEM 培養(yǎng)液和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Gibco；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購自Biosharp；活性氧（reactive oxygen species，ROS）分析試劑盒和JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒（KeyGEN BioTECH）；抗p-STAT3 及STAT3 抗體（Proteintech）；抗α-tubulin及 GAPDH 抗體（Abcam）；抗 PINK1、parkin、LC3 及P62抗體（Wanleibio）；DyLight 488綠色熒光II抗（Abcam）；HRP 標記的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG、細胞核染料Hoechst 33258 及線粒體紅色熒光探針Mito-Tracker Red CMXRos（Beyotime）。

SpectraMax i3x 酶標儀（Molecular Devices）；IX70倒置熒光顯微鏡（Olympus）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) PC12 細胞培養(yǎng)于含10% FBS、1×105U/L 青和 100 mg/L 鏈霉素的高糖 DMEM 培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，狀態(tài)良好。待其融合度達80%～90%，用0.25%胰酶消化，進行細胞傳代培養(yǎng)或接種。

2.2 CCK-8 實驗檢測細胞活力 將PC12 細胞按照3×107/L 的密度接種于96 孔板中，待細胞處于對數(shù)增長期，參考前期已發(fā)表的文章［14］，使用不同濃度的羅哌卡因（0.5、1、2、4 和8 mmol/L）進行處理，另設空白對照組，每組5個復孔，培養(yǎng) 24 h 后，加入CCK-8（每孔10 μL）溶液，反應3 h，熒光酶標儀（激發(fā)光波長450 nm）測定每孔吸光度，以空白孔調(diào)零，計算細胞相對活力，取對照組細胞活力為1。

2.3 細胞形態(tài)學觀察 將密度為1×108/L 的PC12細胞接種于12 孔板中，取對數(shù)增殖期的細胞進行干預，處理方式同上，培養(yǎng)24 h 后，倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 線粒體活性氧的測定 將密度為1×108/L 的PC12細胞接種于12孔板中，取對數(shù)增殖期的細胞進行干預，處理方式同上，培養(yǎng)24 h 后，參考文獻中的方法［15］，使用熒光探針2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFHDA）標記細胞中的活性氧，同時選用線粒體熒光探針MitoTracker Red CMXRos 標記細胞中的線粒體，共同孵育30 min后，加入PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定，使用Hoechst 33258標記細胞核，置于熒光顯微鏡下進行觀察并拍照。

2.5 線粒體膜電位的檢測 參考文獻中的方法［16］，將密度為 1×108/L 的 PC12 細胞接種于 12 孔板中，取對數(shù)增殖期的細胞進行干預，處理方式同上，設空白對照，培養(yǎng)24 h 后棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌細胞，加入線粒體膜電位檢測試劑盒中的JC-1 工作液覆蓋細胞，置于培養(yǎng)箱孵育30 min 后，用新鮮培養(yǎng)液洗滌2 次，PBS 清洗1 次后加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，再用PBS 清洗2 次后加入Hoechst 33258 標記細胞核，置于熒光顯微鏡下進行觀察并拍照。正常細胞：線粒體膜電位正常，細胞內(nèi)含大量JC-1 聚合體呈高綠高紅的熒光信號；受損細胞：線粒體膜電位降低，細胞中JC-1聚合體減少呈現(xiàn)出高綠低紅的熒光信號。

2.6 Western blot 培養(yǎng)于6孔板中的PC12細胞，處理方式同上，設空白對照，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞，加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，冰上裂解細胞，取上清液，使用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，每孔上樣蛋白量25 μg，電泳并轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢后，用含5%脫脂牛奶的TBST 溶液室溫封閉2 h，加入 I 抗（p-STAT3，1∶1 000；STAT3，1∶500；α-tubulin，1∶1 000；LC3，1∶1 000；p62，1∶1 000；PINK，1∶1 000；parkin，1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌5 次，每次 3 min，加入 HRP 標記的Ⅱ抗（山羊抗兔IgG，1∶10 000；山羊抗鼠IgG，1∶3 000）室溫孵育2 h，TBST 洗滌5次，每次 3 min；加入 ECL 進行顯色，使用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)對灰度值進行定量。

2.7 免疫熒光染色 將密度5×107/L 的細胞接種于多聚賴氨酸包被的載玻片上，羅哌卡因作用24 h后，棄去培養(yǎng)液，用預冷的PBS 洗滌細胞2 次，加入4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min，PBS 洗滌后使用0.2% Triton X-100 透膜10 min，加入含1%馬血清的PBST 溶液室溫封閉 2 h，使用抗 p-STAT3 抗體（1∶200）4 ℃孵育過夜，PBST 洗滌 3 次，每次5min，Dy-Light 488綠色熒光Ⅱ抗（1∶1 000）避光室溫孵育2 h，PBST 洗滌后Hoechst 33258復染核，置于熒光顯微鏡下觀察并攝片。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 25 統(tǒng)計軟件處理。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。組間比較采用多樣本均數(shù)單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 羅哌卡因引起PC12細胞活力下降及形態(tài)改變

CCK-8 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，羅哌卡因處理24 h后，隨著藥物濃度的增加，細胞活力顯著降低（P＜0.01），且呈劑量依賴性，其中4 mmol/L羅哌卡因處理24 h 后細胞活力下降約50%，8 mmol/L 羅哌卡因組細胞活力下降約70%（圖1）。

Figure 1.The cytotoxicity of ropivacaine on PC12 cells.The PC12 cells were treated with different concentrations of ropivacaine for 24 h，and the cell viability was detected by CCK-8 assay.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 mol/L group.圖1 羅哌卡因?qū)C12細胞的細胞毒性作用

光學顯微鏡的結(jié)果顯示，從細胞形態(tài)上來看，對照組的PC12 細胞呈不規(guī)則狀，多突起，具有類神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及特征，而隨著羅哌卡因濃度的增加，細胞變圓，突起減少，凋亡壞死細胞數(shù)量增多（圖2）。

Figure 2.The effect of ropivacaine on the morphological changes of PC12 cells.The PC12 cells were treated with different concentrations of ropivacaine for 24 h，and the cell morphological changes were observed under optical microscope.The cells in control group were polygonal with protrusions，and those in ropivacaine group changed to be circular and their protusions were decreased.圖2 不同濃度羅哌卡因?qū)C12細胞形態(tài)的作用

2 羅哌卡因誘導PC12細胞線粒體功能障礙

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組比較，羅哌卡因組中代表ROS的綠色熒光強度隨藥物濃度增加而增加，同時紅色熒光標記的線粒體與綠色熒光標記的ROS 間的共定位顯著增多，且呈劑量依耐性，以2 mmol/L羅哌卡因組增加最顯著，見圖3。

Figure 3.The effect of ropivacaine on the production of mitochondrial reactive oxygen species（ROS）.The PC12 cells were treated with different concentrations of ropivacaine for 24 h，and the fluorescent probes H2DCFDA and MitoTracker Red CMXRos were used to label the ROS and mitochondria，respectively.Compared with control group，the cells treated with ropivacaine showed the increases in the green fluorescence intensity and the colocalization of ROS（green fluorescence）and mitochondria（red fluorescence）.圖3 不同濃度羅哌卡因?qū)C12細胞中線粒活性氧生成的作用

此外，圖4 的結(jié)果顯示，與對照組比較，羅哌卡因組中代表JC-1聚合體的紅色熒光強度隨藥物濃度增加而減少，細胞呈現(xiàn)出高綠低紅的熒光信號，與高綠高紅的正常對照細胞差異顯著。

3 羅哌卡因促進PC12細胞線粒體自噬

圖5A 中Western blot 的結(jié)果顯示，與對照組比較，羅哌卡因組PC12 細胞LC3-II/LC3-I 的比值增加，線粒體自噬標志蛋白PINK1 和parkin 的表達隨藥物濃度增加而增加，自噬底物P62 的蛋白水平顯著下降（P＜0.01），且呈劑量依賴性。圖5B 中比較了對照組與羅哌卡因組中紅色熒光標記的線粒體與綠色熒光標記的LC3 間的共定位水平，結(jié)果顯示，隨著羅哌卡因濃度的升高，LC3 標記的自噬體的數(shù)量顯著增加，呈點狀分布于細胞質(zhì)中；同時自噬體與Mito-Tracker 標記的線粒體間的共定位也顯著增多，呈劑量依賴性，以2 mmol/L增加最顯著。

Figure 5.Ropivacaine induced mitophagy in PC12 cells.A：the expression levels of mitophagy-related proteins were detected by Western blot；B：the colocalization of mitochondria（red fluroresence）and LC3（green fluoresence）was detected by fluorescence microscopy.Compared with control group，the cells treated with ropivacaine showed the increase in the colocalization of mitochondria（red fluoresence）and LC3-labeled autophagosomes（green fluoresence）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖5 羅哌卡因促進PC12細胞線粒體自噬

4 羅哌卡因抑制STAT3的磷酸化

圖 6C、D 中 Western blot 的結(jié)果顯示，與對照組比較，羅哌卡因組中總STAT3 的蛋白表達未發(fā)生顯著變化，而p-STAT3 的蛋白水平隨羅哌卡因濃度的升高而逐漸下降，呈劑量依賴性，其中2 mmol/L 羅哌卡因組降低最顯著（P＜0.01）。同樣的，p-STAT3 的免疫熒光染色結(jié)果與上述Western blot 的結(jié)果保持一致，如圖6A、B 所示，與對照組比較，羅哌卡因組中代表p-STAT3 的綠色熒光強度隨藥物濃度的升高而下降，以2 mmol/L羅哌卡因組最顯著（P＜0.01）。

Figure 6.Ropivacaine inhibited the phosphorylation of STAT3 protein in PC12 cells.A：the protein level of p-STAT3 was detected by immunofluorescence；B：quantification of the fluorescence intensity in A；C：the protein levels of STAT3 and p-STAT3 were detected by Western blot；D：quantification of the gray values in C.Compared with control group，the cells treated with ropivacaine showed decreased p-STAT3 level（green fluoresence）in a dose-dependent manner.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group.圖6 羅哌卡因抑制PC12細胞中STAT3蛋白的磷酸化

討 論

探討局麻藥產(chǎn)生神經(jīng)毒性的作用機制對預防局麻藥引發(fā)的神經(jīng)損傷具有重要意義，本體外實驗著重探究了羅哌卡因?qū)Υ笫笫茹t細胞瘤PC12 細胞線粒體自噬以及STAT3 磷酸化的作用，結(jié)果表明羅哌卡因通過誘導PC12 細胞線粒體功能障礙產(chǎn)生神經(jīng)毒性，同時羅哌卡因促進了PC12 細胞線粒體自噬，包括增加LC3-II/LC3-I的比值，促進線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1 和parkin 的表達，抑制自噬底物蛋白p62的表達。同樣的，羅哌卡因抑制了PC12 細胞STAT3的磷酸化，可能作為其發(fā)揮上述作用的潛在機制。

作為酰胺類局麻藥的代表，羅哌卡因因其具有良好的臨床療效而被廣泛地應用周圍神經(jīng)阻滯，椎管內(nèi)麻醉以及疼痛治療［17］。然而在椎管內(nèi)麻醉中可能會產(chǎn)生短暫神經(jīng)綜合征和馬尾綜合征等毒性反應，但具體機制的尚不清楚。近年來，大量的研究表明羅哌卡因誘導神經(jīng)毒性涉及多種病理生理過程，包括細胞鈣超載，細胞凋亡，氧化應激以及細胞自噬［18-20］。Wen 等［4，21］的研究證實 T 型鈣通道及其調(diào)節(jié)蛋白的激活誘導細胞鈣超載作為羅哌卡因產(chǎn)生神經(jīng)毒性的重要環(huán)節(jié)，當抑制上述蛋白的表達可以顯著減少神經(jīng)元損傷。除鈣超載外，Niu等［10］的研究顯示羅哌卡因可以誘導神經(jīng)元細胞線粒體數(shù)量的減少以及氧化磷酸化功能障礙，進一步通過內(nèi)源性凋亡途徑促進細胞凋亡。我們的研究同樣證實了羅哌卡因可以誘導PC12 細胞線粒體功能障礙包括增加線粒體活性氧的產(chǎn)生以及降低線粒體膜電位，作為其產(chǎn)生神經(jīng)毒性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。除上述因素外，Xiong 等［3］觀察到羅哌卡因具有促進細胞自噬的作用，而當抑制自噬時會進一步加重羅哌卡因誘導的細胞損傷，這與我們的結(jié)果相吻合。

自噬是細胞降解多余蛋白質(zhì)及損傷細胞器的生理過程，而線粒體自噬作為細胞自噬的特殊類型，其目的在于去除功能受損及衰老的線粒體，從而維持線粒體質(zhì)量與功能的穩(wěn)定［22］。線粒體自噬是生命體進化出的有效清除機制，適度的線粒體自噬可以幫助細胞清除受損的線粒體，以保證能量的供應，而當線粒體自噬過度激活時，會進一步加重細胞損傷，包括誘導線粒體活性氧的生成以及降低線粒體膜電位，最終導致細胞死亡［23-24］。線粒體自噬受多種信號分子的調(diào)控［25］，這其中也包括 STAT3。Yang 等［26］的研究證實激活STAT3通路可以抑制缺血再灌注損傷誘導的神經(jīng)元凋亡，減少線粒體活性氧的產(chǎn)生，從而抑制過度的細胞自噬。作為IL-6 激活基因的轉(zhuǎn)錄增強子，STAT3 具有廣泛的生物學功能，有研究指出STAT3 與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育與分化密切相關(guān)［27］，同時其在神經(jīng)元損傷的過程中也發(fā)揮重要作用，磷酸化的 STAT3 能夠顯著保護受損的神經(jīng)元，Chen 等［28］的研究顯示當使用IL-6 信號轉(zhuǎn)導抑制劑抑制STAT3 的磷酸化過程可以導致腦卒中小鼠缺血半暗帶中受損神經(jīng)元的增多，進一步加重神經(jīng)元受損。然而在羅哌卡因誘導神經(jīng)毒性的研究中，目前尚無關(guān)于STAT3 的報道。故本研究探討了羅哌卡因?qū)C12細胞線粒體自噬和STAT3 信號通路的作用，結(jié)果顯示羅哌卡因在激活細胞線粒體自噬同時抑制了細胞中STAT3 的磷酸化，于是我們提出羅哌卡因可能是通過抑制STAT3 磷酸化誘導PC12 細胞線粒體自噬的假說。