肖 斌， 任 鵬， 李明月， 金清華

（延邊大學醫(yī)學院生理與病理生理學教研室，吉林延吉133002）

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是以進行性認知功能下降為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，而作為學習記憶功能關鍵部位的海馬是AD進程中受影響最早且最嚴重的腦區(qū)［1］。海馬神經(jīng)元具有高度發(fā)達的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與神經(jīng)元內(nèi)蛋白質(zhì)合成及細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)維持等密切相關。當各種原因導致神經(jīng)元內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡時，大量非折疊（或錯誤折疊）蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)堆積將誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS），而后者導致海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+相關信號的紊亂［2］。文獻報道，AD 患者海馬中可見ERS 標志性蛋白，包括葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucoseregulated protein 78，GRP78）和磷酸化的蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）等表達升高［2］。眾所周知，腦內(nèi)神經(jīng)元β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積是AD 的主要病理表現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)，Aβ 可誘發(fā)海馬神經(jīng)元的ERS［3］，而后者不僅加重Aβ的錯誤折疊，還通過促進神經(jīng)原纖維纏結及神經(jīng)元過量凋亡等［4］AD樣病理改變參與AD 的認知障礙，提示ERS可能成為AD 認知功能損傷的潛在藥物作用靶點，需要進一步探究海馬內(nèi)ERS參與認知障礙的下游信號通路。

哺乳動物的海馬主要分為CA1、CA3 及齒狀回（dentate gyrus，DG），其中，DG 區(qū)作為海馬與外界聯(lián)系的關鍵部位對編碼空間信息非常重要［5］。突觸傳遞效應的長時程增強（long-term potentiation，LTP）是海馬突觸可塑性的主要形式，也是海馬參與學習和記憶的重要機制。海馬DG 區(qū)LTP 的形成和維持依賴于突觸后膜NMDA 受體的激活及隨后的Ca2+信號轉導［6］。鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）和Ca2+/CaM 依賴性蛋白激酶II（Ca2+/CaM-dependent protein kinase II，CaMKII）是海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+信號的關鍵效應器蛋白，LTP 的形成和維持依賴于其持續(xù)的磷酸化激活［7］。不僅如此，CaMKII能夠與神經(jīng)元內(nèi)游離Ca2+結合、傳導Ca2+信號，其中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是細胞內(nèi)CaMKII 的重要作用靶點之一，而ERK 被CaMKII 磷酸化激活后由胞質(zhì)轉位到細胞核，介導LTP 相關功能蛋白，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的轉錄［8-9］，后者對 LTP 的形成和維持具有重要調(diào)節(jié)作用［10］。本課題組先前的研究也證明，海馬DG 區(qū)的BDNF 參與空間學習相關LTP 的產(chǎn)生過程［11］。AD 認知障礙包括對空間認知障礙，且研究報道激活正常動物體內(nèi)ERS 可直接損傷動物的空間相關學習和記憶功能［12］。雖然這些文獻提示AD海馬DG 區(qū)的ERS可能參與空間學習和記憶障礙，但其是否通過改變CaMKII/ERK 信號途徑及下游的BDNF表達參與空間認知功能障礙尚無定論。因此，本研究以海馬DG 為研究對象，通過4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）阻斷 ERS，探討海馬 DG區(qū)ERS在AD 空間學習記憶功能損傷中的作用機制，為以ERS為靶點的AD藥物研究提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 動物

3 月齡雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠，250～280 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，動物許可證號為SCXK（遼）2015-0001。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境為自由進食飲水，自然光照，室溫20～25 ℃。動物實驗方案經(jīng)延邊大學動物倫理委員會批準。

2 主要試劑

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、D-半乳糖（D-galactose，D-Gal）和 4-PBA 購自 Sigma；ERK 通路抑制劑PD98059購自MCE。上述試劑均溶解于生理鹽水（normal saline，NS）。兔抗大鼠BDNF、PERK、磷酸化PERK（phosphorylated PERK，p-PERK）、ERK、磷酸化ERK（phosphorylated ERK，p-ERK）、CaMKII、磷酸化 CaMKII（phosphorylated CaMKII，p-CaMKII）、β-actin和GRP78抗體及辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG II 抗購自 Cell Signaling Technology；ECL 顯影液購自Millipore。

3 主要方法

3.1 AD 大鼠模型的制備和實驗分組 AD 大鼠模型的制備方法如下：腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/kg）麻醉大鼠，固定于腦立體定向儀上，大鼠頭頂部正中做切口，參照《大鼠腦立體定位圖》于大鼠雙側側腦室（以前鹵為原點，旁開1.4 mm，后0.8 mm，深3.6 mm 處）微量注射STZ（2.4 mg/kg），速度為0.5 μL/min，注射后留針5 min，完成注射后恢復3 d，以后每天腹腔注射D-Gal（60 mg/kg），共6 周；空白對照（control）組大鼠用等體積生理鹽水代替STZ 和DGal。本實驗中動物分3 個部分進行實驗：（1）分為control 組（n=6）和AD 組（n=6），主要觀察大鼠海馬DG 區(qū)超微結構和 ERS 標志蛋白表達；（2）分為 control+NS 組（n=10）、AD+NS 組（n=10）和 AD+4-PBA 組（n=10），在6 周的AD 大鼠模型制備期結束后，每天腹腔注射相應體積的NS或4-PBA（40 mg/kg），共7 d，觀察大鼠的空間學習和記憶能力，以及海馬DG 區(qū)CaMKII、ERK 和 BDNF 的水平；（3）AD 模型大鼠隨機分為對照（AD+NS+NS）組（n=6）、阻斷 ERS（AD+4-PBA+NS）組（n=6）和阻斷 ERS+ERK（AD+4-PBA+PD98059）組（n=6），在6 周的AD 大鼠模型制備期結束后，每天分別腹腔注射相應體積的NS、4-PBA（40 mg/kg）或 4-PBA（40 mg/kg）+PD98059（3 mg/kg），共 7 d，觀察大鼠海馬DG區(qū)ERK和BDNF的表達。

3.2 Morris 水迷宮 Morris 水迷宮主要由圓形水池（直徑為1.8 m，水深0.4 m，水溫22 ℃）、圓形站臺（直徑為0.12 m，固定于第三象限）和視頻記錄系統(tǒng)組成。實驗前大鼠進行適應性游泳1次（淘汰先天愚或其他因素導致不會游泳的大鼠）。正式實驗分為定位航行實驗和空間探索實驗。（1）定位航行實驗：每天在相同時間段進行，共4 d，記錄大鼠從入水到完全爬上隱藏在水下站臺所用的時間（即逃避潛伏期）和游泳的速度，以此來衡量大鼠的空間學習能力。具體訓練方法為：每只大鼠每天按照I～IV 象限的順序分別從4個象限的入水點將大鼠放入水池中，每只大鼠的游泳時限為120 s，如果大鼠在120 s內(nèi)找到站臺并站立其上10 s，則大鼠的逃避潛伏期記錄為找到站臺的時間；若大鼠120 s 內(nèi)未找到站臺，需要引導大鼠到站臺上站立10 s ，此時逃避潛伏期記為120 s。（2）空間探索實驗：Morris水迷宮訓練的第5天撤去站臺，記錄大鼠在120 s 內(nèi)穿越原站臺區(qū)的次數(shù)和在目標象限（站臺所在象限）的時間（相同時間段內(nèi)進行），以此來衡量大鼠的空間記憶能力。

3.3 透射電子顯微鏡檢測法 麻醉狀態(tài)下處死大鼠，冰上分離各組大鼠海馬DG 組織（左側用于透射電鏡檢測，右側備用于Western blot 分析）。組織固定于冷2.5%戊二醛中，磷酸緩沖液清洗，1%鋨酸再次固定后梯度脫水，純丙酮+包埋液（2∶1）室溫包埋4 h，37 ℃烘箱內(nèi)烘烤過夜，超薄切片機制備50 nm 切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察海馬的突觸和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結構。

3.4 Western blot 實驗 右側海馬DG 組織于冰上，加入裂解液（含PMSF和蛋白磷酸酶制劑混合物），充分勻漿后離心取上清液；BCA 法測定蛋白濃度；電泳條件為恒壓90 V，轉膜條件為4 ℃，恒壓90 V；5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗3次后加入I抗（β-actin 抗體 1∶2 000 稀釋，GRP78、PERK、ERK、CaMKII、p-CaMKII、p-PERK、p-ERK 和 BDNF 抗體均 1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌，II抗（1∶2 000稀釋）孵育2 h；加入ECL顯影液，暗室內(nèi)膠片曝光、掃描。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示。兩樣本的均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗；多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni 校正t檢驗。P＜0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 AD大鼠海馬DG區(qū)的突觸和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結構的變化

透射電鏡觀察可見，control 組大鼠海馬DG 區(qū)神經(jīng)元內(nèi)突觸結構完整，突觸間隙清晰，膜上有明顯的突觸致密結構（圖1Aa），粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊、密集（圖1Ab）；AD 組大鼠突觸結構損傷、邊界不清，無突觸間隙和致密區(qū)等結構（圖1Ba），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列疏松，表面附著的核糖體脫落（圖1Bb）。

Figure 1.Neuronal ultrastructure in the hippocampal DG under transmission electron microscope.A：control group；B：AD group.Arrows denote the synapse（a）and endoplasmic reticulum（b）.The scale bar=100 nm.圖1 透射電鏡下大鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元的超微結構

2 AD大鼠海馬DG區(qū)ERS相關蛋白的變化

Western blot 法檢測大鼠海馬 DG 區(qū) ERS 活化的主要標志蛋白GRP78 的水平，及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜信號蛋白PERK 的自身磷酸化，結果顯示，AD 大鼠海馬DG區(qū)GRP78和p-PERK的水平均升高，與control組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.Expressions of GRP78 and p-PERK in the hippocampal DG.A：the protein level of GRP78 was normalized to the level of beta-actin；B：the protein level of p-PERK was normalized to the level of PERK.Mean±SEM. n=4.*P＜0.05 vs control group.圖2 海馬DG區(qū)GRP78和p-PERK蛋白水平的比較

3 阻斷海馬DG 區(qū)ERS對AD大鼠空間學習能力的影響

通過Morris 水迷宮實驗評估大鼠的空間學習記憶能力，結果顯示，與control+NS組大鼠相比，AD+NS大鼠的逃避潛伏期在訓練的第2、3 和4 天均顯著增加（P＜0.05）；而阻斷海馬DG 區(qū)ERS（AD+4-PBA 組）的大鼠的逃避潛伏期在訓練的第4 天顯著縮短（P＜0.05），見圖3A。此外，定位航行實驗期間各組大鼠平均游泳速度的差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05），見圖3B。這提示阻斷AD 大鼠海馬DG 區(qū)ERS 反應能夠緩解AD 相關空間學習能力的損傷，而這種作用與大鼠的游泳速度即運動能力的強弱無關。

Figure 3.The spatial learning abilities of the rats in each group.The escape latency（A）and swimming speed（B）in place navigation trial of Morris water maze test were shown.Mean±SEM. n=10.*P＜0.01 vs control+NS group；#P＜0.05 vs AD+NS group；@P＜0.05 vs day 1.圖3 各組大鼠空間學習能力的比較

4 阻斷海馬DG 區(qū)ERS對AD大鼠空間記憶能力的影響

Morris 水迷宮空間探索實驗結果如圖4 所示。與control+NS 相比，AD+NS 大鼠穿越原站臺區(qū)的次數(shù)及其在目標（站臺）象限的游泳時間顯著減少（P＜0.05）；而與 AD+NS 組相比，阻斷海馬 DG 區(qū) ERS 的AD+4-PBA 組大鼠穿越原站臺區(qū)的次數(shù)及其在目標（站臺）象限的游泳時間均顯著增加（P＜0.05）。

Figure 4.The spatial memory abilities of the rats in each group.The number of platform crossings（A）and time in each quadrant（B）in spatial probe trial of Morris water maze test were shown.Mean±SEM. n=10.*P＜0.05 vs control+NS group；#P＜0.05 vs AD+NS group.圖4 各組大鼠空間記憶能力的比較

5 阻斷ERS對AD大鼠海馬 DG區(qū)CaMKII/ERK/BDNF通路相關蛋白表達的影響

如圖5所示，與 control+NS 相比，AD+NS 組海馬內(nèi)p-CaMKII、p-ERK和BDNF 的蛋白水平均顯著降低（P＜0.05）；與AD+NS 組比較，阻斷ERS的AD+4-PBA 組大鼠海馬 DG 區(qū)內(nèi) p-CaMKII、p-ERK 和 BDNF的蛋白水平均顯著升高（P＜0.05），提示AD大鼠海馬DG 區(qū)出現(xiàn)的 ERS 反應可抑制 CaMKII/ERK/BDNF 通路的活化。

Figure 5.The protein levels of p-CaMKII（A），p-ERK（B）and BDNF（C）in the hippocampal DG.The protein levels of p-CaMKII and p-ERK were normalized to the levels of CaMKII and ERK，respectively，and BDNF was normalized to β-actin.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs control+NS group；#P＜0.05 vs AD+NS group.圖5 海馬DG內(nèi)p-CaMKII、p-ERK和BDNF蛋白的表達

6 阻斷 ERK對 AD大鼠海馬DG內(nèi)BDNF蛋白表達的影響

與AD+NS+NS 組比較，AD+4-PBA+NS 組大鼠海馬DG 區(qū)p-ERK 和BDNF的蛋白水平均顯著升高（P＜0.05）；與 AD+4-PBA+NS 組比較，阻斷 ERK 活化的AD+4-PBA+PD98059 組大鼠的海馬 DG 區(qū) p-ERK 和BDNF的蛋白水平均顯著降低（P＜0.05），見圖6。

討 論

AD 是一種與衰老相關的進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。雙側側腦室注射STZ 能夠誘導出膽堿能神經(jīng)元丟失，神經(jīng)元內(nèi)、外沉積Aβ 斑塊和過度磷酸化的Tau 蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結等AD 樣典型病理改變［13］，并誘發(fā)突觸功能障礙及認知功能漸進性損傷［9］。腹腔注射D-Gal 能夠加速衰老，是研究衰老相關腦認知障礙的主要手段［14］。雙側側腦室注射STZ 聯(lián)合腹腔注射D-Gal是目前公認的、可較好地模擬AD 病變下認知功能損傷的、散發(fā)性AD 動物模型的制備手段之一，因此，本研究通過1 次雙側側腦室注射STZ聯(lián)合6周腹腔注射D-Gal方法制備了散發(fā)性AD 大鼠模型。本研究結果顯示，AD 大鼠海馬DG區(qū)出現(xiàn)突觸結構損傷以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結構紊亂，這與AD患者的海馬內(nèi)超微結構損傷類似［2］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結構或功能紊亂能夠誘發(fā)ERS，后者主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶蛋白GRP78 和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的3 個跨膜蛋白介導，其中跨膜蛋白PERK 的自身二聚化和磷酸化激活能夠誘發(fā)下游級聯(lián)通路，進一步加重ERS 反應，損傷突觸功能，與AD 病變密切相關［15-16］。研究發(fā)現(xiàn)，在 AD患者的腦內(nèi)GRP78 和p-PERK 等ERS 相關因子表達顯著增多［2］，且在APP/PS1和3XTg轉基因小鼠中，也可看到較高水平的GRP78 和PERK 等因子的活化［17-18］。與之相似，本研究結果也顯示，雙側側腦室注射STZ 聯(lián)合長期腹腔注射D-Gal 誘發(fā)的散發(fā)型AD模型大鼠中，海馬DG 區(qū)的GRP78 和p-PERK 的蛋白水平顯著增加，提示AD 大鼠海馬DG 區(qū)出現(xiàn)了ERS反應。如前所述，海馬DG 區(qū)作為新信息進入海馬的傳入點，在空間學習和記憶中起關鍵作用。為明確ERS 在AD 的空間學習和記憶損傷中的作用，本研究利用4-PBA阻斷ERS后，通過Morris水迷宮實驗評估了AD 大鼠的空間學習記憶功能。4-PBA 是一種短鏈芳香族脂肪酸，作為ERS 常用抑制劑，它在細胞內(nèi)扮演分子伴侶的角色，可穩(wěn)定蛋白質(zhì)構象，逆轉蛋白質(zhì)的錯誤定位和（或）聚集，并緩解ERS 誘發(fā)的非蛋白折疊反應［19-20］。本研究結果顯示，利用4-PBA 阻斷ERS能夠明顯緩解AD大鼠的空間學習和記憶損傷。

眾所周知，LTP 是海馬參與學習和記憶功能的重要機制之一，而學習記憶相關LTP 的產(chǎn)生和維持依賴于神經(jīng)元內(nèi)的信號級聯(lián)轉導及功能蛋白質(zhì)的合成［21］。在大鼠海馬 DG 區(qū)，NMDA 受體激活引起的細胞內(nèi)Ca2+大量增加是LTP 產(chǎn)生的觸發(fā)步驟，而Ca2+通過激活CaMKII 誘發(fā)的各種級聯(lián)反應，如AMPA 受體磷酸化及移位、一氧化氮合酶激活、ERK 磷酸化激活、BDNF表達增加等，對海馬DG區(qū)LTP的產(chǎn)生和維持起到關鍵作用［7-9，22］。ERK 是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinase，MAPK）家族的重要成員，ERK 在神經(jīng)元內(nèi)被磷酸化激活后由胞質(zhì)轉位到細胞核，通過介導BDNF 的合成參與調(diào)節(jié)突觸效應，影響學習記憶功能［23］。近些年，ERK 在 AD 的發(fā)病機制中的作用也逐漸受到人們的關注。研究發(fā)現(xiàn)，在AD 發(fā)病早期，ERK 可直接被神經(jīng)元外沉積的Aβ 激活，并參與誘導tau 蛋白過度磷酸化、神經(jīng)元凋亡等 AD 相關病理損傷［24-26］；而后隨著 AD 病程的進展，ERK 逐漸呈抑制狀態(tài)［24］，而 ERK 活性的抑制直接參與損傷海馬相關的空間學習和記憶功能［27］。BDNF 不僅影響腦內(nèi)神經(jīng)元的生長、分化和存活，也是海馬學習、記憶和突觸可塑性調(diào)節(jié)的重要蛋白［28］，我們先前的研究也表明，海馬DG 區(qū)的BDNF 參與調(diào)節(jié)空間學習和記憶過程中的LTP［10］。如前所述，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)維持有密不可分的關系，而ERS可導致神經(jīng)元內(nèi)Ca2+相關信號的紊亂。因此，為了探討AD 海馬DG 區(qū)的ERS 直接影響CaMKII 及其下游信號并損傷空間學習和記憶的可能性，本研究觀察了 4-PBA 阻斷 ERS 對海馬 DG 區(qū) CaMKII 和 ERK磷酸化激活和BDNF 蛋白水平的影響。結果顯示，AD 大鼠海馬 DG 區(qū) p-CaMKII、p-ERK 和 BDNF 的蛋白水平顯著降低，而阻斷ERS 可提高AD 大鼠海馬DG區(qū)p-CaMKII、p-ERK和BDNF的蛋白水平。

為了進一步驗證海馬DG 區(qū)ERS 是否通過抑制CaMKII/ERK/BDNF 通路參與AD 大鼠的空間學習和記憶損傷，本研究在抑制ERS 基礎上利用PD98059抑制 ERK 磷酸化，觀察 AD 大鼠海馬 DG 區(qū) BDNF 的變化。PD98059 是常用的 ERK 抑制劑［29］，能夠特異性地阻斷ERK 磷酸化而不影響其他MAPK 家族通路。本研究結果發(fā)現(xiàn)，PD98059 阻斷了ERS 抑制劑4-PBA 引起的 AD 海馬 DG 區(qū) p-ERK 和 BDNF 蛋白水平的增加，提示海馬DG 區(qū)ERS 相關的AD 空間學習和記憶功能損傷與ERK活性抑制有關。

綜上所述，海馬DG 區(qū)ERS 可損傷側腦室注射STZ 聯(lián)合長期腹腔注射D-Gal 誘發(fā)的散發(fā)型AD 模型大鼠的空間學習和記憶功能，而阻斷ERS 能夠緩解其空間學習和記憶功能損傷，這與CaMKII/ERK/BDNF分子通路的反應增強有關。