王濤,宋曉萍,孫瑩,白利芳,肖祖琳,孫偉△

1大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸一科(遼寧大連 116011)；2內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥科(內(nèi)蒙古呼和浩特 010017)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是慢性進(jìn)展性疾病，診斷后的生存時(shí)間不足3.5年[1]。目前雖有尼達(dá)尼布、吡非尼酮藥物用于治療IPF，但病死率無(wú)明顯降低[2]。因此，解析IPF進(jìn)展的發(fā)病機(jī)制、尋求新的藥物靶點(diǎn)是我國(guó)對(duì)IPF防治的迫切需求和面臨的巨大挑戰(zhàn)。目前關(guān)于IPF的發(fā)病機(jī)制不清。新近研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor，HIF-1α)是組織細(xì)胞對(duì)缺氧感應(yīng)和調(diào)控的一類關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，低氧狀態(tài)下HIF-1α通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、白細(xì)胞介素-17(IL-17)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)等多種致器官纖維化細(xì)胞因子的靶基因參與了IPF的整個(gè)進(jìn)程[3-6]。已有的研究也表明，HIF-1α存在蘇素化修飾(small ubiquitin-related modifier,SUMO)的精細(xì)化調(diào)節(jié)，SUMO-1 化是重要的蛋白質(zhì)翻譯后手段且是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的修飾過(guò)程[7-8]。常氧狀態(tài)下SUMO-1通過(guò)酶聯(lián)反應(yīng)對(duì)HIF-1α進(jìn)行水解，維持人體的正常生理功能，但在低氧狀態(tài)時(shí)可被特異性蛋白酶1(SENP1)催化的去SUMO修飾將其從靶蛋白上去除，使HIF-1α蛋白過(guò)表達(dá)[9-11]。所以本研究提出如下假設(shè)：在低氧條件下，SENP1催化的去SUMO化影響了SUMO化修飾對(duì)HIF-1α蛋白的降解，使其過(guò)度活化多種細(xì)胞因子，最終導(dǎo)致了IPF的進(jìn)展。為驗(yàn)證此假說(shuō)，本研究檢測(cè)IPF患者血清中HIF-1α、SENP1的水平變化并分析兩者的相關(guān)性，進(jìn)一步探討HIF-1α、SENP1在IPF中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2019年3月至2020年3月于我院臨床診斷為IPF的患者中，選取30例作為觀察組，另抽取同期健康體檢者30例作為對(duì)照組，所有受試者均知情并同意參加本研究。本研究經(jīng)大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。兩組年齡、性別、吸煙史等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 所有患者均為臨床診斷且符合 2011 年美國(guó)胸科學(xué)會(huì)/歐洲呼吸學(xué)會(huì)/日本呼吸學(xué)會(huì)/拉丁美洲胸科協(xié)會(huì)(ATS/ERS/JRS/ALAT)聯(lián)合發(fā)表的《特發(fā)性肺纖維化診治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)》。

排除標(biāo)準(zhǔn)：具有糖尿病等代謝性疾病者，合并嚴(yán)重肝腎疾病、惡性腫瘤者，近2個(gè)月內(nèi)曾使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物治療者。

IPF急性加重(AEIPF)的判斷標(biāo)準(zhǔn):(1)IPF患者近30 d內(nèi)不明原因出現(xiàn)呼吸困難加重;(2)高分辨率CT(HRCT)在原有病變的基礎(chǔ)上出現(xiàn)新發(fā)雙肺磨玻璃影伴或不伴實(shí)變影;(3)氣管分泌物或肺泡灌洗液病原學(xué)檢查沒(méi)有感染依據(jù);(4)除外左心力衰竭、肺栓塞、急性肺損傷等誘因。

根據(jù)該判定標(biāo)準(zhǔn)，IPF患者30例中，AEIPF患者為11例，穩(wěn)定期患者為19例。

1.3 標(biāo)本的分離與檢測(cè) 將采集到的所有受試者的外周血(8 mL)進(jìn)行離心(3 000 r/min，10 min)以分離血清，然后將分離出的血清置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。血清HIF-1α、SENP1水平的檢測(cè)使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法，試劑盒均購(gòu)自武漢基因美生物科技有限公司，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 肺功能檢查 肺通氣功能和彌散功能采用德國(guó)耶格 Master Screen Diffusion 型肺功能儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定指標(biāo)為用力肺活量占預(yù)計(jì)值的百分比(FVC% pred)及一氧化碳彌散量占預(yù)計(jì)值的百分比 (DLco% pred)。

2 結(jié)果

2.1 兩組肺功能指標(biāo)比較 觀察組患者肺功能指標(biāo)(FVC% pred、DLco% pred)均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 兩組肺功能指標(biāo)比較

2.2 兩組血清HIF-1α、SENP1水平比較 觀察組中血清HIF-1α、SENP1水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表 3。

表3 兩組血清HIF-1α、SENP1蛋白表達(dá)水平比較

2.3 觀察組血清HIF-1α與SENP1表達(dá)水平的相關(guān)性 觀察組血清HIF-1α水平與 SENP1水平呈線性相關(guān)，血清HIF-1α水平隨SENP1水平升高而升高，兩者呈顯著正相關(guān)(r=0.970，P=0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 IPF患者血清HIF-1α與SENP1的相關(guān)性

2.4 觀察組血清HIF-1α與SENP1表達(dá)水平與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性 血清HIF-1α水平與FVC% pred(r=-0.878，P=0.001)、DLco% (r=-0.940，P=0.001)均呈顯著負(fù)相關(guān)，血清SENP1水平與FVC% pred(r=-0.888，P=0.001)、DLco% (r=-0.953，P=0.001)呈顯著負(fù)相關(guān)。見(jiàn)圖2。

圖2 IPF患者血清HIF-1α、SENP1與肺功能的相關(guān)性

2.5 穩(wěn)定期和AEIPF患者血清中HIF-1α與SENP1表達(dá)水平比較 HIF-1α與SENP1在AEIPF組中的表達(dá)水平較IPF組中的表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 HIF-1α、SENP1在穩(wěn)定期和急性加重期患者血清中表達(dá)水平比較

3 討論

迄今，IPF發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床診斷時(shí)患者往往已處于疾病晚期，因缺乏有效的治療藥物，近年來(lái)IPF的病死率并無(wú)明顯緩解[12]。因此，深入解析其分子機(jī)制對(duì)尋找早期無(wú)創(chuàng)性血清標(biāo)志物及尋求新的治療靶點(diǎn)可提供有力的臨床幫助。

HIF-1α是細(xì)胞適應(yīng)低氧微環(huán)境的關(guān)鍵因子[13]。在常氧條件下，HIF-1α可被快速降解，以至于難以檢測(cè)到HIF-1α的表達(dá)；在低氧條件下，HIF-1α可調(diào)控促紅細(xì)胞生成素(EPO)、內(nèi)皮素1(ET-1)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-2及TGF-β1等多種靶基因的表達(dá)參與IPF進(jìn)程[14-17]。所以，本研究認(rèn)為HIF-1α可作為早期診斷IPF的生物標(biāo)志物，以此為靶點(diǎn)可能是未來(lái)治療IPF的新策略。已有的研究表明，HIF-1α存在SUMO化修飾，SUMU化修飾是十分重要的泛素化修飾，通過(guò)非氧依賴的方式，介導(dǎo)了HIF-1α的水解抑制其表達(dá)，而低氧狀態(tài)下HIF-1α中的SUMU化修飾可被SENP1酶進(jìn)行去泛素化，使SUMO化無(wú)法對(duì)HIF-1α進(jìn)行降解[7,18-19]。因此本研究認(rèn)為，SENP1催化的SUMO化修飾在IPF進(jìn)展中扮演重要角色，以此為靶點(diǎn)可能改善HIF-1α對(duì)IPF的影響。為驗(yàn)證這一學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，首先基于臨床樣本觀察到了在IPF患者血清中HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯高于正常組，而SENP1表達(dá)水平也明顯高于對(duì)照組，同時(shí)應(yīng)用簡(jiǎn)單線性回歸分析發(fā)現(xiàn)IPF患者血清HIF-1α水平隨SENP1水平的升高而升高，Spearman 秩相關(guān)分析示兩者呈顯著正相關(guān)。這說(shuō)明在IPF中SENP1抑制了SUMO化修飾對(duì)HIF-1α蛋白的水解，從而導(dǎo)致IPF患者血清中HIF-1α蛋白表達(dá)升高。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為下述觀察HIF-1α、SENP1是否與IPF病情相關(guān)奠定了理論基礎(chǔ)。

IPF患者的主要表現(xiàn)是限制性肺通氣功能障礙和彌散功能障礙，肺功能檢測(cè)可以直接反映IPF患者的病情變化，也能間接反映其病理?yè)p傷程度[20]。但部分老年患者無(wú)法配合完成肺功能檢查[21]。本研究結(jié)果顯示，IPF患者血清 HIF-1α、SENP1水平與FVC% pred、DLco% pred 呈顯著負(fù)相關(guān)，提示當(dāng)肺功能檢測(cè)難以進(jìn)行時(shí)，可以依據(jù)HIF-1α、SENP1蛋白的表達(dá)水平對(duì)患者病情進(jìn)行評(píng)估。

AEIPF的發(fā)生是IPF病情進(jìn)展及死亡的主要事件[22]。AEIPF發(fā)生時(shí)，氧分壓及細(xì)胞內(nèi)的氧濃度明顯下降，此時(shí)HIF-1α發(fā)生了精細(xì)化的調(diào)節(jié)，即SENP1催化的去SUMO化修飾占據(jù)主導(dǎo)，SUMO化修飾受到抑制，導(dǎo)致了HIF-1α大量產(chǎn)生，最終導(dǎo)致了IPF疾病的進(jìn)展[23]。在本研究中發(fā)現(xiàn)AEIPF患者，HIF-1α、SENP1表達(dá)水平較穩(wěn)定期患者明顯升高。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與基礎(chǔ)研究的理論報(bào)道是一致的，也提示了SENP1催化的去SUMO化修飾影響了IPF的進(jìn)展且與HIF-1α明顯相關(guān)。

目前盡管具體機(jī)制未明，生物標(biāo)志物檢測(cè)有助于評(píng)估IPF患者的嚴(yán)重程度。同時(shí)IPF新藥的臨床試驗(yàn)也迫切需要可靠的生物指標(biāo)來(lái)進(jìn)行療效評(píng)估。因此，有關(guān)生物標(biāo)志物的研究日益得到重視。本研究雖然驗(yàn)證了SENP1抑制HIF-1α的SUMU化修飾與IPF臨床特征有明顯的相關(guān)性，但抑制SENP1表達(dá)后能否通過(guò)增加SUMO修飾而抑制HIF-1α的表達(dá)等機(jī)制方面的問(wèn)題仍需進(jìn)一步闡明。