張濤,聶嘉儀,梁樺,徐楓,劉本銓,喻文強(qiáng),王漢兵

佛山市第一人民醫(yī)院麻醉科(廣東佛山 528000)

藥物濫用導(dǎo)致的急性腎損傷(AKI)在世界范圍內(nèi)發(fā)生率逐年上升，臨床表現(xiàn)為腎功能在短時(shí)間內(nèi)喪失，是一種常見的危機(jī)生命的重癥[1]。隨著手術(shù)后AKI造成住院周期延長(zhǎng)和病死率增高，越來越多的臨床醫(yī)師也關(guān)注到圍手術(shù)期AKI的發(fā)生和防治。AKI主要病理生理特征表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，其特征是腎功能迅速下降，具有較高的發(fā)病率和病死率[2-3]。組蛋白的甲基化是表觀遺傳修飾的其中一大表現(xiàn)形式[4-5]，近期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在AKI中，組蛋白甲基化酶(HMTs)的活性調(diào)節(jié)發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[6]。SETD7是一種參與基因調(diào)控的組蛋白H3K4賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，SETD7的異常表達(dá)與包括細(xì)胞增殖分化、炎性反應(yīng)以及神經(jīng)性疼痛等有關(guān)[7]。因此，SETD7被認(rèn)為是新表觀遺傳藥物開發(fā)的目標(biāo)，但其在AKI中的作用及機(jī)制尚未見相關(guān)研究報(bào)道。為此，2020年4—10月，本研究擬觀察SETD7在小鼠AKI中的作用，并探討有關(guān)機(jī)制，為臨床治療AKI提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及處理 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為C57BL/6、雄性、健康小鼠，周齡8～10周，體重20～30 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，同時(shí)得到動(dòng)物倫理委員會(huì)準(zhǔn)可。經(jīng)隨機(jī)數(shù)字表法，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物歸入下述4組(n=6)：對(duì)照組(CON組)、DMSO+對(duì)照組(DMSO-CON組)、AKI組(FA-AKI組)、SETD7抑制劑+ AKI組(PFI-2-AKI組)。以研究成果[8]為參考，將250 mg/kg的葉酸(美國(guó)Sigma)經(jīng)腹腔單次注入至FA-AKI組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，以此完成AKI模型的構(gòu)建。葉酸溶液配制方法：葉酸 125 mg，NaHCO3252 mg，H2O 10 mL；參照文獻(xiàn)[9]，PFI-2-AKI組小鼠在制備AKI模型前1 h腹腔注射甲基轉(zhuǎn)移酶SETD7抑制劑PFI-2(美國(guó)Target Mol)：將0.2 mmol PFI-2稀釋在0.2 mL 0.1% DMSO(載體)中。DMSO-CON組單純腹腔注射0.1% DMSO 0.2 mL。PFI-2-AKI組小鼠制備模型成功后72 h內(nèi)飲食及精神狀況良好、活動(dòng)狀態(tài)未見明顯異常。

1.2 血清尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)檢測(cè) 72 h后采集眼眶內(nèi)眥血，靜置離心后，取上層血清。采用全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)7020，HITACHI公司，日本)檢測(cè)血清BUN和 Cr。

1.3 腎小管損傷程度評(píng)價(jià) 腎組織先接受固定處理，再行常規(guī)石蠟包埋切片操作，最后為脫蠟脫水處理。借助HE以及PAS染色法，展開組織病理學(xué)評(píng)價(jià)。借助光鏡(日本尼康)對(duì)腎組織受損狀況進(jìn)行查看。以研究成果[10]為參考：刷狀緣脫落、已有管型各為2分；腎小管大幅擴(kuò)張細(xì)胞扁平、管腔中見脫落壞死細(xì)胞但無碎片或管型出現(xiàn)、刷狀緣損傷則各為1分。

1.4 腎組織炎癥細(xì)胞檢測(cè) 對(duì)石蠟切片依次行脫蠟→水化→抗原修復(fù)→封閉內(nèi)源性過氧化物酶(PO)活性→封閉非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)處理后。分別由MPO (美國(guó)Abcam)、CD3(美國(guó)Calbiochem)、F4/80(美國(guó)Serotec)一抗孵育，之后于4℃下經(jīng)夜放置。于室溫環(huán)境中對(duì)相應(yīng)二抗行60 min孵育處理，所用試劑為ABC試劑(美國(guó)Vector Laboratories)。DAB顯色，蘇木精溶液復(fù)染，脫水后中性樹脂封片。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野連續(xù)拍照(Nikon公司，日本)，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，取平均值。

1.5 腎組織炎癥因子檢測(cè) 借助RT-PCR法，對(duì)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)mRNA、白細(xì)胞介素(IL)-1β與IL-6表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)試劑盒(美國(guó)Invitrogen)所示步驟，經(jīng)TRIzol法完成腎組織總RNA的抽提，借助核酸蛋白定量?jī)x(美國(guó)UNIKO)對(duì)樣品RNA純度進(jìn)行評(píng)定，完成cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成。引物序列詳情見表1。借助熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad)，對(duì)Ct值進(jìn)行測(cè)定，通過2-ΔΔCt法對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定。

表1 各目的基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 在尿素氮(BUN)水平、肌酐(Cr)水平以及腎小管損傷評(píng)分方面的比較 對(duì)比于CON組，PFI-2-AKI組BUN、Cr水平及腎小管損傷評(píng)分均為顯著偏高表現(xiàn)(P<0.05)；與FA-AKI組比較，PFI-2-AKI組顯著偏低(P<0.05)。但對(duì)比CON組同DMSO-CON組，則未發(fā)現(xiàn)顯著不同 (P>0.05)，見表2。CON組以及DMSO-CON組均沒有發(fā)現(xiàn)腎組織明顯病理學(xué)變化；在PFI-2-AKI組，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎組織形態(tài)主要表現(xiàn)為腎小管腫脹，還有腎小管上皮細(xì)胞(RTEC)水樣變性、小部分壞死以及空泡變性，腎間質(zhì)輕微水腫與充血；在FA-AKI組，表現(xiàn)為腎小管管腔大幅擴(kuò)張，顯示扁平狀上皮細(xì)胞，分布缺乏規(guī)則性；RTEC見明顯壞死、脫落；腎間質(zhì)水腫、充血癥狀明顯。見圖1～2。

表2 4組小鼠血清BUN、Cr 水平和腎小管損傷評(píng)分的比較

注：A:CON組；B:FA-AKI組;C:DMSO-CON組;D:PFI-AKI組圖1 4組小鼠腎組織形態(tài)學(xué)的比較(HE染色,×200)

注：A:CON組；B:FA-AKI組;C:DMSO-CON組;D:PFI-AKI組圖2 4組小鼠腎組織形態(tài)學(xué)的比較(PAS染色，×200)

2.2 在腎組織MPO+、F4/80+以及CD3+這3類細(xì)胞數(shù)量方面的比較 與CON組比較，PFI-2-AKI組與FA-AKI組顯著偏多(P<0.05)；對(duì)比于FA-AKI組，PFI-2-AKI組顯著偏少(P<0.05)；DMSO-CON組與CON組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖3～5。

表3 4組小鼠腎組織MPO+、F4/80+和CD3+細(xì)胞數(shù)比較

2.3 TNF-α、MCP-1、IL-1β與IL-6這四者mRNA表達(dá)水平的比較 與CON組比較，PFI-2-AKI組顯著偏高(P<0.05)；與FA-AKI組比較，PFI-2-AKI組為顯著偏低表現(xiàn)(P<0.05)；DMSO-CON組與CON組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 4組小鼠腎組織TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1 mRNA表達(dá)水平的比較

3 討論

腎臟既是各種毒素排泄的主要器官，又是毒物攻擊的主要靶器官。圍手術(shù)期腎臟既是調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)和維護(hù)酸堿平衡的重要器官，更多地承擔(dān)著各種藥物的代謝。作為圍手術(shù)期醫(yī)生，密切關(guān)注術(shù)前、術(shù)中和術(shù)后各種重要臟器保護(hù)，例如腦保護(hù)、肺保護(hù)和肝腎保護(hù)等。臨床上圍手術(shù)期患者AKI發(fā)生率很高，早期進(jìn)行干預(yù)、術(shù)中予以腎保護(hù)策略，對(duì)于患者圍手術(shù)期的快速康復(fù)意義重大，這就要求我們更多地去研究和了解AKI發(fā)生的機(jī)制。

注：A:CON組；B:FA-AKI組;C:DMSO-CON組;D:PFI-AKI組圖3 4組小鼠腎組織MPO+細(xì)胞比較(免疫組化，×200)

注：A:CON組；B:FA-AKI組;C:DMSO-CON組;D:PFI-AKI組圖4 4組小鼠腎組織F4/80+陽性細(xì)胞比較(免疫組化，×200)

注：A:CON組；B:FA-AKI組;C:DMSO-CON組;D:PFI-AKI組圖5 4組小鼠腎組織CD3+細(xì)胞比較(免疫組化，×200)

葉酸誘導(dǎo)腎損傷模型目前被廣泛用于急性腎損傷及慢性間質(zhì)纖維化，而且葉酸誘導(dǎo)劑量高低與腎損傷程度密切相關(guān)。因此此項(xiàng)采取腹腔注射葉酸途徑進(jìn)行小鼠AKI模型的構(gòu)建，對(duì)臨床藥物潛在AKI風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行模擬。眾多研究表明，在AKI的病理生理過程中，表觀遺傳學(xué)調(diào)控施加了一定影響[11]。表觀遺傳修飾所指為在未改變DNA序列的基礎(chǔ)上，經(jīng)由修飾DNA以及相關(guān)蛋白行為實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控[12]，以甲基化、磷酸化、乙?；葹橹鱗11]。

在組蛋白以及非組蛋白的賴氨酸(Lys)甲基化中，SETD7發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[13-15]。越來越多的研究表明，SETD7通過介導(dǎo)各種蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基的甲基化來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激[16-17]，而PFI-2作為組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SETD7特異性的抑制劑，能夠有效抑制SETD7活性[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A-AKI組小鼠BUN、Cr水平、腎小管損傷評(píng)分較CON組明顯升高。與FA-AKI組小鼠比較，PFI-2-AKI組小鼠在給予SETD7特異性抑制劑PFI-2后，BUN和Cr水平明顯降低，腎小管損傷減輕，提示抑制SETD7活性可減輕小鼠的急性腎損傷。

AKI通常與促炎性細(xì)胞因子和化學(xué)因子升高有關(guān)，導(dǎo)致白細(xì)胞浸潤(rùn)。在AKI模型中，炎癥由凋亡細(xì)胞傳遞的分子信號(hào)，激活的模式識(shí)別受體，免疫細(xì)胞的多樣化募集觸發(fā)[19]。MPO、CD3、F4/80依次是中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A-AKI組小鼠腎組織MPO、F4/80和CD3陽性細(xì)胞增加，提示中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增多。而PFI-2-AKI組小鼠腎組織的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞數(shù)明顯減少，提示在AKI過程中，SETD7的活化能募集炎癥細(xì)胞在腎臟浸潤(rùn)，加重AKI。

研究證實(shí)，在坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷(CCI)模型中，SETD7調(diào)節(jié)CCI大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和炎性介質(zhì)的表達(dá)，通過鞘內(nèi)注射PFI-2調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞變性及IL-1β、IL-6的表達(dá)，減輕CCI引起的神經(jīng)病理性疼痛[9]。此次研究還獲得以下結(jié)果，AKI模型組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎組織TNF-α、MCP-1、IL-1β與IL-6這四者mRNA表達(dá)升高，PFI-2-AKI組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物這4項(xiàng)指標(biāo)則明顯降低。這提示在AKI模型中小鼠SETD7的活化促進(jìn)了中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1等炎性因子，而這些炎性因子的釋放，進(jìn)一步加重了AKI。在以上所有檢測(cè)指標(biāo)中，DMSO-CON組與CON組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，也進(jìn)一步排除了DMSO對(duì)于本研究結(jié)果可能造成的影響。

本研究采用的是SETD7特異性藥理抑制劑，沒有使用SETD7基因條件性敲除小鼠。因此不能排除藥理性抑制劑對(duì)全身其他組織細(xì)胞造成的間接性影響而減輕AKI，這是本實(shí)驗(yàn)的局限性。而SETD7是通過何種信號(hào)通路減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)以及下調(diào)炎癥因子的表達(dá)減輕AKI，本實(shí)驗(yàn)未能更深一步的闡述，也是本研究團(tuán)隊(duì)需要進(jìn)一步努力的方向。綜上所述，SETD7可能通過調(diào)控炎癥反應(yīng)促進(jìn)了急性腎損傷。