周梅,阿迪拉·斯依提,葉明,岳娜,陳鈺煒,王書芹

1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科(新疆烏魯木齊 830000)；2中山市中醫(yī)院病理科(廣東中山 528400)

乳腺癌已經(jīng)成為全世界婦女的嚴(yán)重威脅，也是第二大致死原因。乳腺癌在全世界婦女每年發(fā)病率有100多萬[1]，而乳腺癌的遺傳學(xué)易感性和臨床預(yù)后存在著種族和地域差異[2]，近年維吾爾族乳腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，因此探尋維吾爾族乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制具有重要意義。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白，可與酪氨酸磷酸化通道偶聯(lián)而被激活，磷酸化的STAT3可介導(dǎo)多種信號分子調(diào)控腫瘤增殖及凋亡，影響腫瘤的進(jìn)展[3]。STAT3在多種惡性腫瘤中被激活，例如肺癌、胰腺癌和肝細(xì)胞性肝癌[4]，最近研究數(shù)據(jù)表明STAT3參與乳腺癌的進(jìn)展、增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥機(jī)制中。MMP-2(Ⅳ型膠原酶)是高度保守的依賴于鋅離子的內(nèi)切蛋白水解酶，MMP-2在乳腺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，研究表明STAT3介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制是通過上調(diào)MMP-2實(shí)現(xiàn)的[5-6]，STAT3和MMP-2與維吾爾族乳腺癌患者關(guān)系的報道較少，兩者的表達(dá)是否與其他民族存在差異尚未明確，本研究運(yùn)用RT-PCR和免疫組化的方法檢測STAT3和MMP-2蛋白和mRNA在維吾爾族乳腺癌中的表達(dá)，分析其與乳腺癌各臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系，探討兩者在維吾爾族乳腺癌癌變過程中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月至2014年12月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科存檔乳腺蠟塊110例，其中維吾爾族乳腺癌80例，正常乳腺組織30例，所有病例均為女性，乳腺癌患者的年齡分布為27～81歲，平均(54±11.6)歲。病理類型均為非特殊類型浸潤性乳腺癌，乳腺癌的組織學(xué)分級及分期標(biāo)準(zhǔn)參照2012年世界衛(wèi)生組織的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋。RNA提取試劑盒QIAquick PCR Purification Kit購自美國QIAGEN公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega生物公司，SYBR Real-Time PCR試劑盒購自大連Takara公司。

1.3 研究方法

1.3.1 免疫組化 所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，敷貼于10%多聚賴氨酸預(yù)處理的載玻片上，將石蠟切片置于60℃烤箱烘烤2 h，將切片按濃度梯度浸入二甲苯和酒精脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)抗原4 min，加過氧化氫10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，切片用10%的山羊血清阻斷，STAT3(1∶100)、MMP-2(1∶150)稀釋抗體，一抗孵育2 h，二抗孵育30 min，DAB顯色，脫水，封片。

1.3.2 提取總RNA與合成cDNA 取樣本6片，厚6 μm，用RNA提取試劑盒(美國，QIAGEN)提取總RNA，測其純度(紫外分光法)，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega生物公司)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將500 ng總RNA加入20 μL反應(yīng)體系中，經(jīng)37℃ 15 min、85℃ 5 s、4℃延伸，獲得cDNA后行PCR檢測或冰箱(-20℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 RT-PCR檢測 檢測STAT3和MMP-2 mRNA的相對表達(dá)量，RT-PCR具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系：SYBR 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，加入去離子水至20 μL；在實(shí)時熒光定量PCR儀上進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 min預(yù)變性；95℃ 5 s，60℃ 30 s，PCR循環(huán)40次；溶解并繪制溶解曲線：95℃ 5 s、60℃ 30 s、95℃ 。每份樣本設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次。記錄每個反應(yīng)管中的熒光信號到達(dá)所設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值。采用△Ct法計(jì)算乳腺癌組織和正常乳腺組織mRNA的相對表達(dá)量，△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。引物由上海生工生物公司合成。STAT3上游引物：5′-CAGTGACCAGGCAGAAGA-3′，STAT3下游引物：5′-ACTCCATCGCTGACAAAA-3′；MMP-2上游引物：5′-ATAACCTGGATGCCGTCGT-3′，MMP-2下游引物：5′-AGGCACCCTTGAAGAAGTAGC-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-TCGACCAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′，GAPDH下游引物：5′-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT-3′。

1.4 結(jié)果判定 STAT3蛋白陽性表達(dá)為胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，MMP-2蛋白陽性表達(dá)為胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。陽性染色強(qiáng)度評分：無染色為0分，微弱染色為1 分，清晰染色且細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈棕黃色為2 分，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核呈深棕色為3分；陽性細(xì)胞數(shù)評分：無陽性細(xì)胞為0 分，陽性細(xì)胞數(shù)≤20%為1 分，陽性細(xì)胞數(shù)21%～50%為2 分，陽性細(xì)胞數(shù)>50%為3分；上述兩項(xiàng)評分相乘，0～2分為陰性，≥3 分為陽性表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 檢測STAT3和MMP-2蛋白在維吾爾族乳腺癌和正常乳腺組織中的表達(dá) 采用免疫組化的方法檢測STAT3和MMP-2蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明STAT3和MMP-2蛋白在乳腺癌組織中高表達(dá)。見圖1。STAT3蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率為77.5%，在正常乳腺組織中的陽性表達(dá)率為56.7%，STAT3蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常乳腺組織(P<0.05)；MMP-2蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率為70%，而在正常乳腺組織中的陽性表達(dá)率為36.7%，MMP-2蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率也明顯高于正常乳腺組織(P<0.05)。見表1。

表1 STAT3和MMP-2蛋白在維吾爾族乳腺癌和正常乳腺組織中的表達(dá) 例

2.2 STAT3和MMP-2蛋白在維吾爾族乳腺癌中表達(dá)的關(guān)系 在維吾爾族乳腺癌中，STAT3和MMP-2蛋白的表達(dá)具有較高的一致性，相關(guān)性分析顯示，STAT3和MMP-2蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.235，P<0.05)。見表2。

注：A：乳腺癌組織中STAT3的陽性表達(dá)；B：乳腺癌組織中MMP-2的陽性表達(dá)圖1 免疫組化染色(IHC，×100)

表2 維吾爾族乳腺癌組織STAT3和MMP-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 例

2.3 STAT3和MMP-2蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 在維吾爾族乳腺癌中，STAT3和MMP-2蛋白的陽性表達(dá)率與乳腺癌腫瘤大小、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均具有相關(guān)性(P<0.05)，腫瘤體積越大、組織學(xué)分級越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期越高的乳腺癌STAT3和MMP-2蛋白的陽性表達(dá)率越高。見表3。

表3 維吾爾族乳腺癌組織STAT3和MMP-2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例

2.4 比較STAT3和MMP-2 mRNA在維吾爾族乳腺癌組織與正常組織中表達(dá)的差異 STAT3和MMP-2 mRNA水平運(yùn)用相對定量法通過2-ΔΔct計(jì)算。觀察溶解曲線及擴(kuò)增循環(huán)圖，了解擴(kuò)增情況。STAT3基因mRNA在維吾爾族浸潤性乳腺癌中的相對表達(dá)量明顯高于正常乳腺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MMP-2 mRNA在維吾爾族浸潤性乳腺癌中的相對表達(dá)量明顯高于正常乳腺組織，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 STAT3和MMP-2 mRNA在維吾爾族乳腺癌與正常乳腺組織中的相對表達(dá)量

2.5 比較STAT3和MMP-2 mRNA表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 RT-PCR結(jié)果顯示，STAT3 mRNA在乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的相對表達(dá)量明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)；STAT3 mRNA在Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌組織中相對表達(dá)量明顯高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)；STAT3 mRNA表達(dá)與維吾爾族乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、臨床分期有關(guān)，而與組織學(xué)分級、直徑無顯著相關(guān)性(P>0.05)。MMP-2 mRNA在乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的相對表達(dá)量也明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)；MMP-2 mRNA的相對表達(dá)量在Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌明顯高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)。見表5。

表5 維吾爾族乳腺癌組織STAT3和MMP-2 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.6 STAT3和MMP-2 mRNA表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 所有患者隨訪5年，生存63例，死亡15例，繪制維吾爾族乳腺癌患者術(shù)后1～60個月STAT3和MMP-2高、低表達(dá)者的生存曲線，STAT3高表達(dá)者及低表達(dá)者術(shù)后的總生存率分別為73.48%(36/49)、93.10%(27/29)，MMP-2高表達(dá)者及低表達(dá)者術(shù)后的總生存率分別為71.43%(35/49)、96.55%(28/29)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、3。

圖2 不同STAT3表達(dá)水平維吾爾族乳腺癌患者5年生存曲線

3 討論

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤，也是全世界婦女癌癥相關(guān)死亡的主要原因[7]，尤其是新疆維吾爾族患者，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的數(shù)量非常高，因此，尋找新的乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有重要意義。

眾所周知，Janus激活的激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)信號通路在許多惡性腫瘤中起關(guān)鍵作用，JAK/STAT信號通路的表達(dá)水平與肺腺癌、結(jié)直腸癌[8]和食管鱗癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和OS有關(guān)[9]。STAT3是JAK-STAT3信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。STAT3是STATs家族的重要成員之一，因其與腫瘤的關(guān)系最為密切而成為目前研究的熱點(diǎn)，是多種惡性腫瘤的致癌基因[10]。在許多腫瘤中，激活的STAT3參與了細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管生成、侵襲、免疫抑制和抗凋亡[11]，然而，維吾爾族乳腺癌與JAK2/STAT3通路的關(guān)系仍不清楚。

圖3 不同MMP-2表達(dá)水平維吾爾族乳腺癌患者5年生存曲線

Sapio等[12]研究顯示STAT3在乳腺癌組織中異常高表達(dá)，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn)STAT3在乳腺癌組織中的表達(dá)與腫瘤臨床分期和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。從本研究結(jié)果顯示，STAT3蛋白和mRNA在維吾爾族乳腺癌中的陽性表達(dá)明顯高于正常乳腺組織，且STAT3蛋白的表達(dá)水平與腫瘤體積大小、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期均明顯相關(guān)，在腫瘤較大、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級較高、臨床分期較晚的維吾爾族浸潤性乳腺癌患者中STAT3蛋白的陽性表達(dá)率明顯升高，STAT3 mRNA的相對表達(dá)量與維吾爾族乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、臨床分期有關(guān)，提示在維吾爾族乳腺癌患者中，STAT3表達(dá)水平越高腫瘤的增殖速度越快，侵襲性越強(qiáng)，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，TNM分期越晚，預(yù)后越差，STAT3可能參與調(diào)控維吾爾族非特殊類型浸潤性乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展，STAT3過表達(dá)是影響維吾爾族乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。目前許多研究集中在 JAK1/2抑制劑對各種實(shí)體腫瘤的生長、增殖、凋亡、血管生成和轉(zhuǎn)移的治療效果，近年來發(fā)現(xiàn)了一些新的特異性STAT3抑制劑，也有報道稱，STAT3抑制劑在小鼠乳腺癌模型中具有抗癌和免疫刺激作用[14]，靶向STAT3的聯(lián)合治療可能是乳腺癌的最佳治療方案[15]。

研究發(fā)現(xiàn)STAT3還可以介導(dǎo)IL-6誘導(dǎo)的MMP-2的表達(dá)以及乳腺癌細(xì)胞的遷移。Ma等[16]報道抑制STAT3磷酸化可以減少M(fèi)MP-2在乳腺癌中的表達(dá)，本研究結(jié)果也顯示STAT3和MMP-2蛋白的表達(dá)具有明顯的相關(guān)性(P<0.05)。MMP可降解Ⅳ型膠原，促進(jìn)基底膜破裂，MMP-2與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程以及腫瘤細(xì)胞的高侵襲能力有關(guān)[17]。據(jù)報道活化的MMP-2能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞穿透基底膜基質(zhì)的能力，可促進(jìn)多種腫瘤包括胰腺癌、肝細(xì)胞癌和肺癌等的轉(zhuǎn)移[18]。MMP-2表達(dá)的上調(diào)與乳腺癌患者的預(yù)后不良相關(guān)[19]。本研究結(jié)果顯示MMP-2蛋白和mRNA在維吾爾族乳腺癌中的陽性表達(dá)明顯高于正常組織；MMP-2的陽性表達(dá)率與維吾爾族乳腺癌腫瘤大小、組織分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)(P<0.05)，MMP-2蛋白在腫瘤體積較大、組織學(xué)分級較高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期高的維吾爾族乳腺癌組織中的表達(dá)量明顯高于腫瘤體積較小、組織學(xué)分級較低、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和TNM分期較低的乳腺癌，MMP-2 mRNA的表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期有關(guān)，MMP-2表達(dá)增高提示乳腺癌的增殖速度較快，侵襲性較強(qiáng)，易轉(zhuǎn)移，TNM分期較晚，預(yù)后欠佳。

綜上所述，STAT3和MMP-2與乳腺癌的臨床病理特征有關(guān)，兩者過度表達(dá)與預(yù)后不良有密切關(guān)系，提示STAT3和MMP-2可能參與維吾爾族乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，STAT3和MMP-2高表達(dá)在乳腺癌的細(xì)胞分化、浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用，本研究可能為研究乳腺癌發(fā)生機(jī)制和治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。