王愛武,鐘碧玲,周揚(yáng)帆,王貴明,陳艷宇,李亦明,譚夕

廣東省第二人民醫(yī)院、廣東省應(yīng)急醫(yī)院病理科(廣東廣州 510317)

晝夜節(jié)律的主要功能為協(xié)調(diào)、控制哺乳動物每天24 h的生理與行為過程，晝夜節(jié)律的產(chǎn)生依賴于多種生物鐘基因的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路[1]。生物鐘基因NPAS2(neuronal PAS-domain protein 2)是產(chǎn)生和維持周期節(jié)律的重要調(diào)控因子[2]，生物鐘基因異常在惡性腫瘤組織中普遍存在。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌的發(fā)生與生物節(jié)律紊亂有關(guān)[3]。另一方面，研究還發(fā)現(xiàn)NPAS2高表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)，NPAS2可作為判斷乳腺癌患者預(yù)后的指標(biāo)之一[4]。最近國內(nèi)有研究顯示，NPAS2在人體腹腔惡性腫瘤中普遍表達(dá)下調(diào)或缺失[5]，雌激素受體(ER)、人表皮生長因子受體-2(HER2)表達(dá)狀況與乳腺癌治療、預(yù)后密切相關(guān)，乳腺癌NPAS2下調(diào)或缺失與ER、HER2表達(dá)狀況以及其他臨床病理特征之間的關(guān)系，目前國內(nèi)很少報道。闡明NPAS2與乳腺癌組織內(nèi)ER、HER2表達(dá)狀況的關(guān)系，有助于優(yōu)化乳腺癌治療策略，為探討乳腺癌時辰治療提供理論依據(jù)。為此，本研究選取113例未經(jīng)治療的非特殊類型乳腺浸潤性導(dǎo)管癌標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察NPAS2表達(dá)情況，分析NPAS2的表達(dá)缺失與ER、HER2等臨床病理特征的關(guān)系，并進(jìn)一步分析復(fù)發(fā)病例NPAS2表達(dá)狀況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取廣東省第二人民醫(yī)院病理科2016年乳腺癌根治手術(shù)標(biāo)本113例，所有病例術(shù)前未經(jīng)新輔助放、化療及內(nèi)分泌治療，病理診斷參照2012年WHO乳腺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，均由高年資主治以上病理醫(yī)師診斷為非特殊類型乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，最后運(yùn)用單盲法由一名主任醫(yī)師復(fù)核診斷。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 采用EnVision二步法對上述113例乳腺癌標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。兔抗人NPAS2多克隆抗體購自美國Abcam公司，ER、孕激素受體(PR)、HER2、Ki-67四種一抗均為鼠抗人，購自Nov公司，二抗為鼠兔通用抗EnVision抗體，購自Dako公司。正常乳腺組織作為NPAS2、ER、PR、Ki-67的陽性對照，免疫組化染色3+陽性表達(dá)，同時FISH檢測確認(rèn)存在HER2基因擴(kuò)增的乳腺癌檔案材料作HER2的陽性對照，PBS代替一抗作空白對照。

1.3 免疫組化結(jié)果判讀 NPAS2陽性定位表達(dá)于胞核，采用半定量雙評分法評價：每張切片隨機(jī)選取5個具有代表性的高倍視野。(1)計(jì)算腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，無陽性細(xì)胞為0分，≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；(2)細(xì)胞染色強(qiáng)度：無染色為0分，弱染色為1分，中度染色為2分，重度染色為3分。總分?jǐn)?shù)(0～12分)為以上兩項(xiàng)之積，0分、1分為陰性，2～4分為弱陽性，6～8分為中等陽性，9～12為強(qiáng)陽性。由兩名中級職稱以上病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲法閱片，若評估意見不一致時，需重新對結(jié)果進(jìn)行比較和討論。

ER、PR陽性表達(dá)定位于胞核，判讀標(biāo)準(zhǔn)參考2015年中國乳腺癌雌、孕激素受體免疫組織化學(xué)檢測指南，將1%作為ER、PR表達(dá)陽性的臨界值。

HER2結(jié)果判讀參考美國臨床腫瘤學(xué)會和美國病理學(xué)會臨床實(shí)踐指南專項(xiàng)更新，乳腺癌HER2檢測指南(2019版)[6]:將>10%浸潤癌細(xì)胞胞膜呈現(xiàn)完整的強(qiáng)染色(3+)定義為陽性，0及1+定義為陰性，將>10%浸潤癌細(xì)胞胞膜呈現(xiàn)輕到中度完全性膜染色定義為2+，再經(jīng)HER2基因FISH檢測證實(shí)為陽性的病例歸入陽性組。Ki-67存在肯定的胞核染色即為陽性，陽性強(qiáng)弱不作為評估參數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，NPAS2蛋白表達(dá)與ER陰性、ER陽性乳腺癌相關(guān)性評估采用2檢驗(yàn)(常規(guī)2檢驗(yàn)或校正2檢驗(yàn))。隨訪結(jié)果以Kaplan-Meier曲線表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者組織學(xué)分級情況及概況 113例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者均為女性，發(fā)病年齡25～75歲，平均(49.08±2.42)歲，組織學(xué)分級包括1級病例4例，2級50例，3級59例。

2.2 患者ER、HER2檢測結(jié)果 113例乳腺癌病例中，88例癌組織呈ER陽性，25例顯示ER陰性。同時，32例乳腺癌標(biāo)本存在HER2過表達(dá)，81例顯示HER2陰性。

2.3 ER陰性與陽性患者NPAS2表達(dá)缺失率比較 NPAS2在ER陰性病例的表達(dá)缺失率為20.00%(5/25)，較ER陽性病例的表達(dá)缺失率4.54%(4/88)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 HER2陰性與陽性患者NPAS2表達(dá)缺失率比較 NPAS2在32例HER2過表達(dá)病例的表達(dá)缺失率為18.75%(6/32)，其余81例陰性病例的表達(dá)缺失率為3.70%(3/81)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 NPAS2免疫組化表達(dá)情況概況 NPAS2在正常乳腺導(dǎo)管上皮陽性表達(dá)(圖1)，113例乳腺癌標(biāo)本中有104例癌組織檢測到NPAS2不同程度的陽性表達(dá)(圖2、3)，9例呈陰性表達(dá)(圖4)，表達(dá)缺失率為7.96%(9/113)。

圖1 NPAS2 正常導(dǎo)管上皮陽性表達(dá)(Envision，×200)

圖2 NPAS2癌組織中等強(qiáng)度陽性表達(dá)(Envision，×200)

圖3 NPAS2癌組織強(qiáng)陽性表達(dá)(Envision，×200)

圖4 NPAS2癌組織陰性表達(dá)(Envision，×200)

2.6 NPAS2在不同級別浸潤性導(dǎo)管癌的免疫組化表達(dá)情況 NPAS2在不同級別浸潤性導(dǎo)管癌的免疫組化表達(dá)情況見表1，不同級別浸潤性導(dǎo)管癌腫瘤細(xì)胞均有NPAS2表達(dá)。分析NPAS2表達(dá)缺失情況發(fā)現(xiàn)，4例1級浸潤性導(dǎo)管癌未見NPAS2表達(dá)缺失，2級浸潤性導(dǎo)管癌的表達(dá)缺失率為2.00%(1/50)，3級浸潤性導(dǎo)管癌的表達(dá)缺失率為13.56%(8/59)。

表1 NPAS2在113例不同級別浸潤性導(dǎo)管癌中的免疫組化表達(dá)情況 例

整體比較(秩和檢驗(yàn))顯示：3個級別的浸潤性導(dǎo)管癌，其NPAS2表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。再進(jìn)行具體的兩兩分割比較，結(jié)合數(shù)據(jù)分析如下：

標(biāo)本中1級浸潤性導(dǎo)管癌例數(shù)過少，僅有的4例未出現(xiàn)NPAS2缺失表達(dá)，無法進(jìn)行3組病例比較，只對2級、3級浸潤性導(dǎo)管癌病例進(jìn)行比較，2級浸潤性導(dǎo)管癌的NPAS2表達(dá)缺失率2.00%(1/50)與3級浸潤性導(dǎo)管癌15.69%(8/59)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(修正后2=3.371，P=0.066)。

再將109例2級、3級浸潤性導(dǎo)管癌病例合并分組再進(jìn)行表達(dá)差異分析，即表達(dá)缺失與弱陽性表達(dá)病例合并(分別為14例、26例)、中等強(qiáng)度陽性與強(qiáng)陽性表達(dá)合并(分別為36例、33例)，兩組之間NPAS2表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=3.011，P>0.05)。

2.7 113例浸潤性導(dǎo)管癌的ER狀態(tài)及HER2基因過表達(dá)情況 免疫組化染色方法檢測腫瘤細(xì)胞ER表達(dá)，88例標(biāo)本為ER陽性(圖5)，25例為ER陰性。HER2基因免疫組化過表達(dá)病例共32例(圖6)，免疫組化陰性表達(dá)病例81例。

圖5 癌組織ER陽性表達(dá)(Envision，×200)

圖6 癌組織HER2陽性表達(dá)(Envision，×200)

分析9例NPAS2陰性表達(dá)病例的分布，ER陽性病例組出現(xiàn)4例，表達(dá)缺失率4.54%(4/88)，ER陰性病例組有5例，表達(dá)缺失率為20.00%(5/25)，ER陰性組病例較ER陽性組病例明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(校正后2=4.41，P<0.05)。同時，6例NPAS2陰性表達(dá)病例出現(xiàn)在32例HER2基因過表達(dá)病例，表達(dá)缺失率為18.75%(6/32)，其余81例陰性病例中見3例NPAS2陰性表達(dá)，表達(dá)缺失率為3.70%(3/81)，兩組缺失差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(校正后2=5.181，P<0.05)。

2.8 NPAS2在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 NPAS2在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與患者的ER狀態(tài)和HER2基因有無過表達(dá)有關(guān)，與PR狀態(tài)、年齡、腫塊大小、Ki-67增殖指數(shù)、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、臨床分期無關(guān)。見表2。

表2 NPAS2在113例浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)及其與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 例

2.9 隨訪結(jié)果 截止2019年11月30日，113例患者中有87例被成功追蹤隨訪，最長隨訪時間為47個月。隨訪病例中，有1例行單純腫瘤切除術(shù)患者發(fā)生原位復(fù)發(fā)、4例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。分析5例復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移病例的NPAS2表達(dá)情況，1例顯示手術(shù)切除標(biāo)本為NPAS2強(qiáng)陽性表達(dá)，4例為弱陽性。此外，4例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病例，手術(shù)當(dāng)時的臨床分期均為中、晚期(Ⅲ期、Ⅳ期)，見表3、圖7。

表3 復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移病例的NPAS2表達(dá)狀況與臨床病理情況

圖7 無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移PFS的K-M曲線

3 討論

晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)著人體數(shù)百種功能，晝夜節(jié)律紊亂與多種疾病的發(fā)生有關(guān)[7]。腫瘤患者常?？梢杂^察到晝夜節(jié)律紊亂現(xiàn)象[8]，作為腫瘤抑制因子的生物鐘基因及其相關(guān)蛋白產(chǎn)物在不同水平上參與到細(xì)胞分裂、增殖、凋亡及細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等多方面過程。NPAS2蛋白與BMALI蛋白形成異源二聚體，與靶基因啟動部位的e盒結(jié)合，啟動其他核心晝夜節(jié)律基因，如PER1、PER2、PER3及CR1、CR2，從而調(diào)節(jié)哺乳動物的晝夜節(jié)律，同時，NPAS2/BMAL1異二聚體的基因產(chǎn)物還可以調(diào)節(jié)若干原癌基因，與C-MYC基因相互作用[9]。越來越多的證據(jù)表明，NPAS2及其他晝夜節(jié)律基因參與了乳腺癌形成及發(fā)展過程[10-11]，本組研究顯示NPAS2在不同級別浸潤性導(dǎo)管癌中均有表達(dá)，1級浸潤性導(dǎo)管癌病例未觀察到表達(dá)缺失，2級、3級浸潤性導(dǎo)管癌病例的表達(dá)缺失率隨級別上升而增加，提示NPAS2與細(xì)胞增殖有關(guān)，可能存在負(fù)性調(diào)節(jié)作用，很可能是乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的早期分子事件。因本組研究材料以2、3級病例為主，尚需加大樣本量平衡各組之間的比例，進(jìn)一步明確NPAS2表達(dá)情況與浸潤性導(dǎo)管癌級別之間的關(guān)系。

文獻(xiàn)報道，體內(nèi)循環(huán)激素可以調(diào)節(jié)前腦及外周組織的晝夜節(jié)律基因表達(dá)[12]，人體內(nèi)節(jié)律性分泌的激素具有調(diào)節(jié)特定組織中晝夜節(jié)律基因表達(dá)的能力，提示晝夜節(jié)律基因與激素生成之間有相關(guān)性。ER是乳腺癌重要的診斷、治療靶點(diǎn)，本研究觀察了非特殊類型浸潤性導(dǎo)管癌的NPAS2基因表達(dá)狀況與ER狀態(tài)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，癌旁正常乳腺導(dǎo)管上皮可同時檢測到ER、NPAS2的表達(dá)，NPAS2表達(dá)缺失更多見于ER陰性的浸潤性導(dǎo)管癌細(xì)胞，提示NPAS2可能是乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中潛在的腫瘤抑制因子。Mocellin等[13]的大樣本系列研究表明，NPAS2基因變異與ER陰性乳腺癌密切相關(guān)，本組研究在組織學(xué)水平上發(fā)現(xiàn)NPAS2基因表達(dá)與ER狀態(tài)密切相關(guān)，與Brzezinski等[14]的研究結(jié)果一致，提示檢測NPAS2表達(dá)情況可能對預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后具有重要意義。

正常機(jī)體的晝夜節(jié)律在24 h內(nèi)受到精細(xì)的信號回路調(diào)控，研究證實(shí)，晝夜節(jié)律信號通路存在正、負(fù)反饋調(diào)節(jié)，但是NPAS2與ER在細(xì)胞內(nèi)的信號交聯(lián)通路及相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制未完全闡明。文獻(xiàn)報道NPAS2、ER信號通路的下游靶基因包括C-MYC、CyclinD1、CDK4等多個腫瘤相關(guān)基因[15]，本組研究發(fā)現(xiàn)ER陰性浸潤性導(dǎo)管癌細(xì)胞的NPAS2表達(dá)缺失率明顯升高，提示ER與NPAS2在浸潤性導(dǎo)管癌的發(fā)展過程中密切相關(guān)。Benna等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，ERa陽性乳腺癌組織高表達(dá)CLOCK，進(jìn)一步利用乳腺癌細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)CLOCK蛋白水平與mRNA水平均升高，具體機(jī)制為乳腺癌細(xì)胞內(nèi)E2啟動子促進(jìn)ERa與CLOCK啟動子雌激素啟動元件(ERE)結(jié)合，從而上調(diào)了CLOCK的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的增殖。據(jù)此，我們推測在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中，生物鐘基因NPAS2可能通過相似的分子通路與ER相互作用。

關(guān)于NPAS2與HER2基因相互作用的報道非常有限[17]，但是，ER、HER2信號通路均可以與原癌基因C-MYC發(fā)生信號交聯(lián)，本組研究在浸潤性導(dǎo)管癌組織學(xué)標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)NPAS2表達(dá)缺失與HER2基因過表達(dá)存在密切相關(guān)性，提示我們可以進(jìn)一步通過研究浸潤性導(dǎo)管癌的C-MYC狀況來揭示NPAS2與HER2基因之間的作用機(jī)制。本組病例最長隨訪時間47個月，生存分析顯示復(fù)發(fā)病例NPAS2表達(dá)下降為主。結(jié)合此次研究可知，NPAS2與ER狀態(tài)、HER2基因過表達(dá)有著高度相關(guān)性，或可能成為今后乳腺癌節(jié)律治療的切入點(diǎn)，不僅豐富了現(xiàn)有研究體系內(nèi)容，還為今后臨床治療工作提供了科學(xué)指導(dǎo)，成為本研究創(chuàng)新之所在。

綜上所述，生物鐘基因NPAS2可能與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的發(fā)生有關(guān)，其表達(dá)缺失與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織ER陰性、HER2過表達(dá)存在高度相關(guān)性，可能與乳腺癌進(jìn)展有關(guān)。