王愛武,鐘碧玲,周揚帆,王貴明,陳艷宇,李亦明,譚夕

廣東省第二人民醫(yī)院、廣東省應急醫(yī)院病理科(廣東廣州 510317)

晝夜節(jié)律的主要功能為協(xié)調、控制哺乳動物每天24 h的生理與行為過程，晝夜節(jié)律的產(chǎn)生依賴于多種生物鐘基因的轉錄-翻譯反饋環(huán)路[1]。生物鐘基因NPAS2(neuronal PAS-domain protein 2)是產(chǎn)生和維持周期節(jié)律的重要調控因子[2]，生物鐘基因異常在惡性腫瘤組織中普遍存在。流行病學研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌的發(fā)生與生物節(jié)律紊亂有關[3]。另一方面，研究還發(fā)現(xiàn)NPAS2高表達與乳腺癌患者預后相關，NPAS2可作為判斷乳腺癌患者預后的指標之一[4]。最近國內有研究顯示，NPAS2在人體腹腔惡性腫瘤中普遍表達下調或缺失[5]，雌激素受體(ER)、人表皮生長因子受體-2(HER2)表達狀況與乳腺癌治療、預后密切相關，乳腺癌NPAS2下調或缺失與ER、HER2表達狀況以及其他臨床病理特征之間的關系，目前國內很少報道。闡明NPAS2與乳腺癌組織內ER、HER2表達狀況的關系，有助于優(yōu)化乳腺癌治療策略，為探討乳腺癌時辰治療提供理論依據(jù)。為此，本研究選取113例未經(jīng)治療的非特殊類型乳腺浸潤性導管癌標本進行免疫組織化學染色，觀察NPAS2表達情況，分析NPAS2的表達缺失與ER、HER2等臨床病理特征的關系，并進一步分析復發(fā)病例NPAS2表達狀況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取廣東省第二人民醫(yī)院病理科2016年乳腺癌根治手術標本113例，所有病例術前未經(jīng)新輔助放、化療及內分泌治療，病理診斷參照2012年WHO乳腺腫瘤分類標準，均由高年資主治以上病理醫(yī)師診斷為非特殊類型乳腺浸潤性導管癌，最后運用單盲法由一名主任醫(yī)師復核診斷。

1.2 免疫組織化學染色 采用EnVision二步法對上述113例乳腺癌標本進行免疫組織化學染色。兔抗人NPAS2多克隆抗體購自美國Abcam公司，ER、孕激素受體(PR)、HER2、Ki-67四種一抗均為鼠抗人，購自Nov公司，二抗為鼠兔通用抗EnVision抗體，購自Dako公司。正常乳腺組織作為NPAS2、ER、PR、Ki-67的陽性對照，免疫組化染色3+陽性表達，同時FISH檢測確認存在HER2基因擴增的乳腺癌檔案材料作HER2的陽性對照，PBS代替一抗作空白對照。

1.3 免疫組化結果判讀 NPAS2陽性定位表達于胞核，采用半定量雙評分法評價：每張切片隨機選取5個具有代表性的高倍視野。(1)計算腫瘤細胞中陽性細胞百分數(shù)，無陽性細胞為0分，≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；(2)細胞染色強度：無染色為0分，弱染色為1分，中度染色為2分，重度染色為3分。總分數(shù)(0～12分)為以上兩項之積，0分、1分為陰性，2～4分為弱陽性，6～8分為中等陽性，9～12為強陽性。由兩名中級職稱以上病理醫(yī)師進行雙盲法閱片，若評估意見不一致時，需重新對結果進行比較和討論。

ER、PR陽性表達定位于胞核，判讀標準參考2015年中國乳腺癌雌、孕激素受體免疫組織化學檢測指南，將1%作為ER、PR表達陽性的臨界值。

HER2結果判讀參考美國臨床腫瘤學會和美國病理學會臨床實踐指南專項更新，乳腺癌HER2檢測指南(2019版)[6]:將>10%浸潤癌細胞胞膜呈現(xiàn)完整的強染色(3+)定義為陽性，0及1+定義為陰性，將>10%浸潤癌細胞胞膜呈現(xiàn)輕到中度完全性膜染色定義為2+，再經(jīng)HER2基因FISH檢測證實為陽性的病例歸入陽性組。Ki-67存在肯定的胞核染色即為陽性，陽性強弱不作為評估參數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，NPAS2蛋白表達與ER陰性、ER陽性乳腺癌相關性評估采用2檢驗(常規(guī)2檢驗或校正2檢驗)。隨訪結果以Kaplan-Meier曲線表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者組織學分級情況及概況 113例乳腺浸潤性導管癌患者均為女性，發(fā)病年齡25～75歲，平均(49.08±2.42)歲，組織學分級包括1級病例4例，2級50例，3級59例。

2.2 患者ER、HER2檢測結果 113例乳腺癌病例中，88例癌組織呈ER陽性，25例顯示ER陰性。同時，32例乳腺癌標本存在HER2過表達，81例顯示HER2陰性。

2.3 ER陰性與陽性患者NPAS2表達缺失率比較 NPAS2在ER陰性病例的表達缺失率為20.00%(5/25)，較ER陽性病例的表達缺失率4.54%(4/88)明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 HER2陰性與陽性患者NPAS2表達缺失率比較 NPAS2在32例HER2過表達病例的表達缺失率為18.75%(6/32)，其余81例陰性病例的表達缺失率為3.70%(3/81)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.5 NPAS2免疫組化表達情況概況 NPAS2在正常乳腺導管上皮陽性表達(圖1)，113例乳腺癌標本中有104例癌組織檢測到NPAS2不同程度的陽性表達(圖2、3)，9例呈陰性表達(圖4)，表達缺失率為7.96%(9/113)。

圖1 NPAS2 正常導管上皮陽性表達(Envision，×200)

圖2 NPAS2癌組織中等強度陽性表達(Envision，×200)

圖3 NPAS2癌組織強陽性表達(Envision，×200)

圖4 NPAS2癌組織陰性表達(Envision，×200)

2.6 NPAS2在不同級別浸潤性導管癌的免疫組化表達情況 NPAS2在不同級別浸潤性導管癌的免疫組化表達情況見表1，不同級別浸潤性導管癌腫瘤細胞均有NPAS2表達。分析NPAS2表達缺失情況發(fā)現(xiàn)，4例1級浸潤性導管癌未見NPAS2表達缺失，2級浸潤性導管癌的表達缺失率為2.00%(1/50)，3級浸潤性導管癌的表達缺失率為13.56%(8/59)。

表1 NPAS2在113例不同級別浸潤性導管癌中的免疫組化表達情況 例

整體比較(秩和檢驗)顯示：3個級別的浸潤性導管癌，其NPAS2表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。再進行具體的兩兩分割比較，結合數(shù)據(jù)分析如下：

標本中1級浸潤性導管癌例數(shù)過少，僅有的4例未出現(xiàn)NPAS2缺失表達，無法進行3組病例比較，只對2級、3級浸潤性導管癌病例進行比較，2級浸潤性導管癌的NPAS2表達缺失率2.00%(1/50)與3級浸潤性導管癌15.69%(8/59)之間差異無統(tǒng)計學意義(修正后2=3.371，P=0.066)。

再將109例2級、3級浸潤性導管癌病例合并分組再進行表達差異分析，即表達缺失與弱陽性表達病例合并(分別為14例、26例)、中等強度陽性與強陽性表達合并(分別為36例、33例)，兩組之間NPAS2表達差異無統(tǒng)計學意義(2=3.011，P>0.05)。

2.7 113例浸潤性導管癌的ER狀態(tài)及HER2基因過表達情況 免疫組化染色方法檢測腫瘤細胞ER表達，88例標本為ER陽性(圖5)，25例為ER陰性。HER2基因免疫組化過表達病例共32例(圖6)，免疫組化陰性表達病例81例。

圖5 癌組織ER陽性表達(Envision，×200)

圖6 癌組織HER2陽性表達(Envision，×200)

分析9例NPAS2陰性表達病例的分布，ER陽性病例組出現(xiàn)4例，表達缺失率4.54%(4/88)，ER陰性病例組有5例，表達缺失率為20.00%(5/25)，ER陰性組病例較ER陽性組病例明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(校正后2=4.41，P<0.05)。同時，6例NPAS2陰性表達病例出現(xiàn)在32例HER2基因過表達病例，表達缺失率為18.75%(6/32)，其余81例陰性病例中見3例NPAS2陰性表達，表達缺失率為3.70%(3/81)，兩組缺失差異有統(tǒng)計學意義(校正后2=5.181，P<0.05)。

2.8 NPAS2在乳腺浸潤性導管癌的表達與臨床病理特征的關系 NPAS2在腫瘤細胞中的表達與患者的ER狀態(tài)和HER2基因有無過表達有關，與PR狀態(tài)、年齡、腫塊大小、Ki-67增殖指數(shù)、淋巴結有無轉移、臨床分期無關。見表2。

表2 NPAS2在113例浸潤性導管癌中的表達及其與乳腺癌臨床病理特征的關系 例

2.9 隨訪結果 截止2019年11月30日，113例患者中有87例被成功追蹤隨訪，最長隨訪時間為47個月。隨訪病例中，有1例行單純腫瘤切除術患者發(fā)生原位復發(fā)、4例發(fā)生遠處轉移。分析5例復發(fā)、轉移病例的NPAS2表達情況，1例顯示手術切除標本為NPAS2強陽性表達，4例為弱陽性。此外，4例發(fā)生遠處轉移的病例，手術當時的臨床分期均為中、晚期(Ⅲ期、Ⅳ期)，見表3、圖7。

表3 復發(fā)、轉移病例的NPAS2表達狀況與臨床病理情況

圖7 無復發(fā)轉移PFS的K-M曲線

3 討論

晝夜節(jié)律調節(jié)著人體數(shù)百種功能，晝夜節(jié)律紊亂與多種疾病的發(fā)生有關[7]。腫瘤患者常常可以觀察到晝夜節(jié)律紊亂現(xiàn)象[8]，作為腫瘤抑制因子的生物鐘基因及其相關蛋白產(chǎn)物在不同水平上參與到細胞分裂、增殖、凋亡及細胞周期調控、DNA損傷修復等多方面過程。NPAS2蛋白與BMALI蛋白形成異源二聚體，與靶基因啟動部位的e盒結合，啟動其他核心晝夜節(jié)律基因，如PER1、PER2、PER3及CR1、CR2，從而調節(jié)哺乳動物的晝夜節(jié)律，同時，NPAS2/BMAL1異二聚體的基因產(chǎn)物還可以調節(jié)若干原癌基因，與C-MYC基因相互作用[9]。越來越多的證據(jù)表明，NPAS2及其他晝夜節(jié)律基因參與了乳腺癌形成及發(fā)展過程[10-11]，本組研究顯示NPAS2在不同級別浸潤性導管癌中均有表達，1級浸潤性導管癌病例未觀察到表達缺失，2級、3級浸潤性導管癌病例的表達缺失率隨級別上升而增加，提示NPAS2與細胞增殖有關，可能存在負性調節(jié)作用，很可能是乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的早期分子事件。因本組研究材料以2、3級病例為主，尚需加大樣本量平衡各組之間的比例，進一步明確NPAS2表達情況與浸潤性導管癌級別之間的關系。

文獻報道，體內循環(huán)激素可以調節(jié)前腦及外周組織的晝夜節(jié)律基因表達[12]，人體內節(jié)律性分泌的激素具有調節(jié)特定組織中晝夜節(jié)律基因表達的能力，提示晝夜節(jié)律基因與激素生成之間有相關性。ER是乳腺癌重要的診斷、治療靶點，本研究觀察了非特殊類型浸潤性導管癌的NPAS2基因表達狀況與ER狀態(tài)之間的關系，結果顯示，癌旁正常乳腺導管上皮可同時檢測到ER、NPAS2的表達，NPAS2表達缺失更多見于ER陰性的浸潤性導管癌細胞，提示NPAS2可能是乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中潛在的腫瘤抑制因子。Mocellin等[13]的大樣本系列研究表明，NPAS2基因變異與ER陰性乳腺癌密切相關，本組研究在組織學水平上發(fā)現(xiàn)NPAS2基因表達與ER狀態(tài)密切相關，與Brzezinski等[14]的研究結果一致，提示檢測NPAS2表達情況可能對預測乳腺癌患者預后具有重要意義。

正常機體的晝夜節(jié)律在24 h內受到精細的信號回路調控，研究證實，晝夜節(jié)律信號通路存在正、負反饋調節(jié)，但是NPAS2與ER在細胞內的信號交聯(lián)通路及相關調節(jié)機制未完全闡明。文獻報道NPAS2、ER信號通路的下游靶基因包括C-MYC、CyclinD1、CDK4等多個腫瘤相關基因[15]，本組研究發(fā)現(xiàn)ER陰性浸潤性導管癌細胞的NPAS2表達缺失率明顯升高，提示ER與NPAS2在浸潤性導管癌的發(fā)展過程中密切相關。Benna等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，ERa陽性乳腺癌組織高表達CLOCK，進一步利用乳腺癌細胞株進行實驗，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞內CLOCK蛋白水平與mRNA水平均升高，具體機制為乳腺癌細胞內E2啟動子促進ERa與CLOCK啟動子雌激素啟動元件(ERE)結合，從而上調了CLOCK的轉錄水平，進而調節(jié)乳腺癌細胞的增殖。據(jù)此，我們推測在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中，生物鐘基因NPAS2可能通過相似的分子通路與ER相互作用。

關于NPAS2與HER2基因相互作用的報道非常有限[17]，但是，ER、HER2信號通路均可以與原癌基因C-MYC發(fā)生信號交聯(lián)，本組研究在浸潤性導管癌組織學標本中發(fā)現(xiàn)NPAS2表達缺失與HER2基因過表達存在密切相關性，提示我們可以進一步通過研究浸潤性導管癌的C-MYC狀況來揭示NPAS2與HER2基因之間的作用機制。本組病例最長隨訪時間47個月，生存分析顯示復發(fā)病例NPAS2表達下降為主。結合此次研究可知，NPAS2與ER狀態(tài)、HER2基因過表達有著高度相關性，或可能成為今后乳腺癌節(jié)律治療的切入點，不僅豐富了現(xiàn)有研究體系內容，還為今后臨床治療工作提供了科學指導，成為本研究創(chuàng)新之所在。

綜上所述，生物鐘基因NPAS2可能與乳腺浸潤性導管癌的發(fā)生有關，其表達缺失與乳腺浸潤性導管癌組織ER陰性、HER2過表達存在高度相關性，可能與乳腺癌進展有關。