王智輝,李榮崗,鐘媚共,伍婉婷,孟子杰,鄭焱,張鑫△

江門市中心醫(yī)院 1腫瘤科，2病理科，4醫(yī)學(xué)研究中心(廣東江門 529030)；3江門市婦幼保健院藥學(xué)部(廣東江門 529000)；5廣東省人乳頭狀瘤病毒(HPV)相關(guān)疾病分子診斷工程技術(shù)研究開發(fā)中心(廣東潮州 521021)

乳腺癌是最為常見的女性特發(fā)惡性腫瘤，臨床上以乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(breast infiltrating ductal carcinoma,BIDC)為主要病理類型。在全球及我國女性中，乳腺癌發(fā)病率一直占據(jù)著首位，且40年來呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅著全球女性的生命健康[1-2]。令人欣慰的是，近30年來，乳腺癌患者的病死率持續(xù)下降，這主要得益于化療藥物、內(nèi)分泌治療藥物及靶向藥物的規(guī)范化綜合應(yīng)用[1]，但是三陰乳腺癌(triple negative breast carcinoma,TNBC)，作為其中一種特殊的病理分子亞型，具有較高的惡性生物學(xué)特征，且無法使用內(nèi)分泌治療藥物并缺少常見的靶向藥物，5內(nèi)年發(fā)生術(shù)后進(jìn)展的概率明顯高于其他基因亞型[3-4]，是乳腺癌臨床治療中的難點(diǎn)。臨床診治中[5]，將雌激素受體(estrogen receptor,ER)和孕激素受體(progesterone receptor,PR)免疫組化檢測陰性，人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)免疫組化陰性或其編碼基因ERBB2 (erb-B2 receptor tyrosine kinase 2)無擴(kuò)增的浸潤性乳腺癌歸為TNBC。有研究指出[3-5]，TNBC約占所有乳腺癌的15%，而我國TNBC的發(fā)病比例可能更高。因為缺少真正意義的輔助診斷指標(biāo)，所以TNBC目前多作為排除性的分類；而關(guān)于TNBC全基因組拷貝(copy number variations,CNV)分析的研究較少，依然未見明確具有TNBC輔助診斷意義的CNV的報道。因此，本課題組將嘗試?yán)萌蚪MCNV分析的方法，在癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas,TCGA,https://gdc-portal.nci.nih.gov/)中嘗試挖掘出TNBC相關(guān)的基因。

1 資料與方法

1.1 TCGA TNBC的全基因組拷貝數(shù)變異分析 參考本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[6]，下載TCGA中乳腺癌的基因組拷貝信息(由Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0芯片過濾得到)及對應(yīng)樣品的臨床信息，數(shù)據(jù)庫的更新下載日期為2020年1月31日，共1 099例。利用臨床信息中ER、PR和HER2的免疫組化染色結(jié)果及ERBB2 DNA原位雜交結(jié)果，篩選出ER和PR免疫組化為陰性，同時HER2免疫組化陰性或ERBB2非擴(kuò)增的TNBC 153例，占比約13.9%。在GenePattern公共服務(wù)器平臺(https://genepattern.broadinstitute.org/)上，利用GISTIC 2.0軟件分析腫瘤組織的全基因組拷貝信息，其中原始拷貝數(shù)信息源自TCGA數(shù)據(jù)庫下載整理，參考基因組為人類19版基因組(human genome 19,hg19)，探針標(biāo)記的物理位點(diǎn)信息(Markers file)和CNV參照信息(CNV file)均整理自SNP Array 6.0的第35版本信息(http://www.affymetrix.com/)；關(guān)鍵的運(yùn)行參數(shù)均為默認(rèn)，并分析X染色體的拷貝數(shù)變異情況。運(yùn)行所得的關(guān)鍵數(shù)據(jù)有：(1)每個探針標(biāo)記位點(diǎn)的擴(kuò)增或缺失情況，即G評分(G-score)；G評分的高低能綜合反映該位點(diǎn)的擴(kuò)增或缺失的深度和頻率。(2)每個樣品中單個基因的拷貝數(shù)變異情況，包括缺失(deletion)、二倍體(diploid)和擴(kuò)增(gain)3個狀況。

1.2 拷貝數(shù)變異熱點(diǎn)區(qū)域的關(guān)鍵基因分析 參考本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[7]，利用IGV軟件導(dǎo)入GISTIC 2.0分析所得的G評分結(jié)果，其中用紅色的線條代表擴(kuò)增G-value的數(shù)值高低，用藍(lán)色的線條代表缺失G-value的數(shù)值高低。通過峰型定位拷貝數(shù)變異的染色體區(qū)段，勾畫出熱點(diǎn)區(qū)域中心位置的關(guān)鍵基因。最后導(dǎo)出所得圖像，并在Canvas 14.0軟件中繪制矢量圖。

1.3 患者一般信息 收集整理2017年1月至2019年12月在江門市中心醫(yī)院就診的并手術(shù)的BIDC患者信息和標(biāo)本，排除無法取得足夠治療前樣品的接收新輔助治療的病例，共剩961例，根據(jù)ER、PR和HER2的免疫組化染色結(jié)果及ERBB2 DNA原位雜交結(jié)果，篩選出ER和PR免疫組化為陰性，同時HER2免疫組化陰性或HER2免疫組化2+及以下且ERBB2非擴(kuò)增的TNBC 108例，占比約11.2%。TCGA與江門市中心醫(yī)院TNBC患者的一般信息見表1，兩群樣品在性別、年齡、病理類型及TNM臨床病理分期的分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 TCGA及江門市中心醫(yī)院TNBC患者的基本信息 例(%)

1.4 qPCR檢測石蠟標(biāo)本的禽骨髓細(xì)胞瘤病病毒致癌基因同源物(avian myelocytomatosis viral oncogene homolog,MYC)基因和CUB和Sushi多結(jié)構(gòu)域基因1(CUB and sushi multiple domains 1,CSMD1)基因拷貝數(shù)變異 參考本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[6]，調(diào)取患者手術(shù)標(biāo)本中腫瘤成分70%的石蠟組織，10 μm厚度切片4張。利用GeneRead DNA FFPE Kit按操作說明書提取石蠟切片的DNA；利用TaqMan Copy Number Assay的熒光定量PCR引物Hs00292858_cn檢測MYC基因拷貝數(shù)，引物Hs03655295_cn檢測CSMD1基因拷貝數(shù)，其中內(nèi)參引物為TaqMan Copy Number Reference Assay RNase P，二倍體參考樣品為健康人血漿白膜層樣品，擴(kuò)增試劑盒為TaqMan Fast Advanced Master Mix，按說明書在CFX96熒光定量PCR儀中檢測。規(guī)定樣品中目標(biāo)基因的相對拷貝數(shù)檢測值<0.75為缺失，>1.5為擴(kuò)增，其余為二倍體。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 計數(shù)資料用頻數(shù)表示，用Excel 2016及GraphPad Prism 7.0軟件處理數(shù)據(jù)，各組間頻數(shù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用2檢驗(Chi-squared test)或Fisher′s精確檢驗(Fisher′s exact test)，檢驗水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TCGA TNBC全基因組拷貝數(shù)分析 通過GISTIC 2.0軟件分析，能得到TCGA數(shù)據(jù)庫中TNBC腫瘤組織的全基因組拷貝數(shù)變異情況，見圖1，8q24.21、1q21.3和19q12是擴(kuò)增最為顯著的3個區(qū)段(圖1-A)，8p23.2、10q23.31和13q14.2是缺失最為顯著的3個區(qū)段(圖1-B)。其中，我們在擴(kuò)增區(qū)段和缺失區(qū)段分別選擇了G評分最高及q值最小的8q24.21和8p23.2作為研究重點(diǎn)。

注：A:擴(kuò)增最顯著的3個區(qū)段；B:缺失最顯著的3個區(qū)段圖1 TCGA TNBC的全基因組拷貝數(shù)分析

2.2 8q24.21區(qū)段的關(guān)鍵基因 通過IGV軟件觀察8q24.21區(qū)段的信息，可以明確TNBC的擴(kuò)增峰在MYC基因處(圖2-A)，利用GISTIC2.0軟件的自動閾值計算結(jié)果，得到TCGA的153例TNBC腫瘤組織中，MYC基因發(fā)生缺失3例(2.0%)，正常二倍體23例(15.0%)，余下127例(83.0%)為擴(kuò)增。

2.3 8p23.2區(qū)段的關(guān)鍵基因 通過IGV軟件觀察8p23.2區(qū)段的信息，可以明確TNBC在8p23.2區(qū)段無顯著缺失峰，而此區(qū)段最主要的為含CSMD1基因(圖2-B)，利用GISTIC2.0軟件的自動閾值計算結(jié)果，得到TCGA的153例TNBC腫瘤組織中，CSMD1基因發(fā)生擴(kuò)增31例(21.7%)，正常二倍體26例(18.2%)，余下96例(67.1%)為缺失。

注：A:8q24.21區(qū)段；B:8p23.2區(qū)段圖2 8q24.21及8p23.2區(qū)段的拷貝數(shù)變異熱點(diǎn)區(qū)域基因

2.4 TCGA TNBC中MYC擴(kuò)增及CSMD1缺失與患者臨床病理特征的關(guān)系 將TCGA中TNBC患者的臨床信息與MYC的擴(kuò)增及CSMD1的缺失情況進(jìn)行統(tǒng)計分析，僅發(fā)現(xiàn)CSMD1的缺失與較低的T分級相關(guān)(P<0.05)，與年齡、病理類型、N分級、M分級及臨床病理分期無關(guān)(P>0.05)；而MYC的擴(kuò)增與上述臨床病理特征均無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 TCGA TNBC中MYC擴(kuò)增及CSMD1缺失與患者臨床病理特征的關(guān)系 例

2.5 江門市中心醫(yī)院TNBC組織中MYC和CSMD1基因拷貝數(shù)的檢測 利用qPCR檢測我院108例TNBC腫瘤組織的MYC和CSMD1基因拷貝數(shù)，結(jié)果顯示，MYC基因無缺失情況，二倍體有12例(11.1%)，擴(kuò)增有96例(88.9%)，與TCGA數(shù)據(jù)庫的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(2=1.761,P=0.185)；CSMD1基因擴(kuò)增13例(12.0%)，二倍體有32例(29.6%)，缺失有63例(58.3%)，與TCGA數(shù)據(jù)庫的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2=7.292,P=0.026)。

2.6 本院TNBC中MYC的擴(kuò)增及CSMD1缺失與患者臨床病理特征的關(guān)系 將本院TNBC患者的臨床信息與MYC的擴(kuò)增及CSMD1的缺失情況進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)MYC的擴(kuò)增或CSMD1的缺失與患者的年齡、病理類型、T分級、N分級、M分級及臨床病理分期無關(guān)(P>0.05)。見表3。

表3 我院TNBC中MYC擴(kuò)增及CSMD1缺失與患者臨床病理特征的關(guān)系 例

3 討論

近20年來腫瘤基因組學(xué)發(fā)展迅猛，分子特征檢測技術(shù)逐漸與傳統(tǒng)腫瘤病理鑒別診斷相結(jié)合，出現(xiàn)了腫瘤病理分子分型的新模式，其中，成熟的分子特征包括了關(guān)鍵驅(qū)動基因的突變、CNV及蛋白產(chǎn)物的表達(dá)異常等[8]。在關(guān)鍵驅(qū)動基因的CNV中，癌基因ERBB2的擴(kuò)增最具有臨床意義，乳腺癌中HER2蛋白的過表達(dá)主要是編碼基因ERBB2的擴(kuò)增，針對HER2蛋白為靶點(diǎn)的曲妥珠單抗(trastuzumab)已經(jīng)上市20年，其在治療轉(zhuǎn)移性HER2過表達(dá)型乳腺癌及胃癌中療效確切，有效延長了相適應(yīng)的病理分型患者的生存時間[9]。但是對于TNBC，暫時未見可以納入臨床指南的關(guān)鍵驅(qū)動基因CNV特征，只能使用排除性分類方式，進(jìn)行模糊分類，這同樣限制了針對TNBC的精準(zhǔn)診治的發(fā)展。

在本研究中，本課題組首先利用GISTIC2.0軟件，對TCGA公共數(shù)據(jù)庫中153例TNBC腫瘤組織進(jìn)行全基因組的CNV分析，分別發(fā)現(xiàn)了8q24.21和8p23.2在TNBC顯著擴(kuò)增及缺失，提示我們8號染色體在TNBC腫瘤組織中的高度不穩(wěn)定，而這一現(xiàn)象已被眾多研究者證實，并指出8p的缺失與8q的擴(kuò)增具有相關(guān)性[10-11]。一般認(rèn)為，腫瘤基因組中發(fā)生擴(kuò)增的區(qū)段一般包含了重要的癌基因，而缺少的區(qū)段則往往含有關(guān)鍵的抑癌基因[12]。利用基因組瀏覽器，我們能將8q24.21的擴(kuò)增峰定位在MYC基因，而8p23.2的缺失主體為CSMD1基因，表明TNBC中MYC基因的擴(kuò)增和CSMD1基因的缺失是值得我們研究的。

雖然未見CSMD1在TNBC樣品中缺失率的報道，但能明確的是，乳腺癌中存在一定比例的CSMD1基因缺失情況[13]。近年來的系列研究已經(jīng)證實，CSMD1蛋白在腫瘤組織中表達(dá)缺失與浸潤性乳腺癌的高病理分級和差的預(yù)后相關(guān)[14]；在乳腺癌細(xì)胞中，沉默CSMD1能促進(jìn)細(xì)胞體外的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)的成瘤及轉(zhuǎn)移，這表明CSMD1在乳腺癌中起抑癌基因的作用[15]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，CSMD1基因在TCGA及本院TNBC樣品中的缺失率分別為67.1%和58.3%，其中TCGA中CSMD1基因的缺失與TNBC患者癌組織的T分級相關(guān)，但我院的樣品檢測并不支持相關(guān)結(jié)果，其原因可能是本研究的TNBC樣品數(shù)依然不足，高T分級樣品較少(T3～T4占比均<17%)，難以得到穩(wěn)定的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果，此外，與MYC擴(kuò)增情況類似，本研究并未發(fā)現(xiàn)CSMD1基因缺失與TNBC患者臨床病理特征的明確相關(guān)性，這提示我們CSMD1缺失和MYC擴(kuò)增可能是TNBC較為普遍的分子特征，而不是TMBC內(nèi)部分型的標(biāo)志物。

大量的研究[16-19]指出，MYC基因是重要的癌基因，其擴(kuò)增導(dǎo)致的MYC蛋白過表達(dá)能通過干擾多條信號通路，直接或間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的合成代謝和細(xì)胞周期運(yùn)行，維持腫瘤細(xì)胞的高增殖和低凋亡，還能通過直接轉(zhuǎn)錄多種生長因子促進(jìn)腫瘤組織血管的新生和促癌微環(huán)境的形成，最終推動腫瘤的惡性進(jìn)展及放化療抵抗。在TNBC的臨床組織中，有多個課題組均發(fā)現(xiàn)MYC基因的擴(kuò)增現(xiàn)象，其擴(kuò)增例數(shù)占比在50%～89%之間[20-21]，其數(shù)據(jù)波動較大的主要原因是，采用的檢測方法及對應(yīng)的閾值均有不同，且暫無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。在我們的樣品和TCGA數(shù)據(jù)庫中都觀察到MYC基因的顯著擴(kuò)增，其占比分別為83.0%和88.9%，因為缺少不同乳腺癌分子病理亞型的數(shù)據(jù)，我們暫時無法確定MYC基因是否能作為TNBC的輔助診斷分子標(biāo)志物，而回答這一問題將是本課題組后續(xù)的研究方向。