李田源 海龍 吳慧 洪錫田 盧曉旭 孫學(xué)明

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，占全部腦瘤的40%～50%，由于致殘率、致死率高，嚴(yán)重危害著人類健康[1-2]。GBM 標(biāo)準(zhǔn)治療方法是手術(shù)聯(lián)合術(shù)后同步放化療和后續(xù)替莫唑胺（temozolomide，TMZ）輔助化療[3]。但是多數(shù)患者出現(xiàn)耐藥后腫瘤復(fù)發(fā)，目前對于此類患者尚無標(biāo)準(zhǔn)的治療方法[4]。研究發(fā)現(xiàn)，GBM 的生長和復(fù)發(fā)與腫瘤血管生成密切相關(guān)，指南可循的用于臨床治療復(fù)發(fā)GBM的靶向藥物僅有貝伐單抗，但存在嚴(yán)重的高血壓和出血等不良反應(yīng)[5]。有研究報道[6-8]阿帕替尼聯(lián)合TMZ治療復(fù)發(fā)的GBM 有一定的臨床療效，但缺乏相關(guān)機(jī)制的研究。本研究通過阿帕替尼治療耐藥的GBM 對免疫微環(huán)境的影響進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2018年7月至2020年10月鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院標(biāo)準(zhǔn)方案治療失敗的GBM 患者51 例，其中男性30 例，女性21 例；年齡31～70 歲，中位年齡53 歲。所有患者經(jīng)病理或MRI 證實(shí)為GBM 復(fù)發(fā)；依據(jù)MRI 檢查確定可評價病灶；KPS 評分≥70 分，ECOG 評分≤2 分；血常規(guī)和肝腎功能正常（表1）。本研究經(jīng)過本院倫理委員會批準(zhǔn)并進(jìn)行臨床試驗(yàn)注冊，入組患者均簽署知情同意書，依從性好。

表1 51 例GBM 患者的一般資料

1.2 方法

1.2.1 治療方法 阿帕替尼500 mg/d，第1～14 天；休息7 天，開始口服標(biāo)準(zhǔn)TMZ 方案150 mg/（m2·d），連續(xù)口服5 天，28 天為1 個周期。連續(xù)服用直至疾病進(jìn)展或不能耐受。

1.2.2 試劑和儀器 可溶性PD-1（soluble programmed death-1，sPD-1）、可溶性PD-L1（soluble programmed death-ligand 1，sPD-L1）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）和白介素-10（interleukin-10，IL-10）ELISA 試劑盒（武漢華美公司），酶標(biāo)儀IMAK（美國伯樂公司），迷你離心機(jī)、高速離心機(jī)（賽默飛世爾科技中國有限公司）。

1.2.3 免疫因子檢測 服藥前，早晨空腹采集外周血5～10 mL。服藥后每4 周空腹采集外周血5～10 mL。30 min 至1 h 后，取上清液（血清和血漿），1 500 rpm/min離心10 min。包裝于2 mL 無菌凍存管中，置于-80°冰箱中。ELISA 法檢測血清IL-6、IL-10、血漿sPD-1、sPD-L1 的表達(dá)[9]。

1.2.4 腫瘤體積測量 1）圖像獲?。夯颊咧委熐耙约爸委熀竺總€周期行同臺3.0T MRI 平掃以及增強(qiáng)（包括以下序列：T1、T1 增強(qiáng)、T2、T2 FLAIR、DWI、PWI 和其他圖像集），以DICOM 格式下載；2）體積分割、測量和建模：應(yīng)用3D Slicer 4.10.2 哈佛醫(yī)學(xué)院開發(fā)的用于醫(yī)學(xué)圖像分析（包括配準(zhǔn)和交互式分割）和可視化（包括3D 渲染）的軟件[10]，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的放射科醫(yī)生對圖像進(jìn)行分割，同時進(jìn)行腫瘤建模，獲取腫瘤體積（包括T1 加權(quán)對比度增強(qiáng)后的腫瘤體積）。

1.2.5 分子病理檢測方法 免疫組織化學(xué)法檢測IDH 突變；FISH 檢測1p/19q 的缺失；焦磷酸測序檢測患者的MGMT 甲基化水平；DNA sanger 測序檢測TERT 基因啟動子區(qū)域的突變情況。

1.2.6 評價標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)國際常見不良反應(yīng)評價標(biāo)準(zhǔn)第3 版（CTCAE 3.0）評價不良反應(yīng)，治療期間每周評價。統(tǒng)計分析按照治療期間不良反應(yīng)的最大值評價。于治療前、治療后的每個周期依據(jù)MRI 結(jié)果評價近期療效，依據(jù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤評價標(biāo)準(zhǔn)（response assessment in neuro-oncology，RANO）進(jìn)行療效評價。

1.2.7 隨訪 治療后每4 周分別進(jìn)行MRI 療效評價，連續(xù)16 周。以后每3 個月隨訪1 次，隨訪截至2020年10月，隨訪率100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。對分組資料比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，使用Kaplan-Meier 計算生存率，Log rank 檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；采用Cox 回歸風(fēng)險比例模型進(jìn)行多因素分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效

截至末次隨訪時間，51 例患者均進(jìn)行臨床評價。完全緩解（complete response，CR）2 例，部分緩解（partial response，PR）15 例，疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）20 例，疾病進(jìn)展（progressive disease，PD）14 例。其中ORR 為33.33%（17/51），疾病控制率（disease control rate，DCR）為72.5%（37/51）。中位無進(jìn)展生存期（median progression-free survival，mPFS）為5.9 個月（95%CI：5.345～6.455），1年總生存期（overall survival，OS）為47.3%，2年OS 為24.9%（圖1，2）。典型患者M(jìn)RI 圖像見圖3。

圖1 51 例GBM 患者的PFS

2.2 不良反應(yīng)

全部患者均可耐受治療，未出現(xiàn)5 級（死亡）不良反應(yīng)。其中高血壓14 例（25.4%），乏力10 例（18.2%），惡心嘔吐9 例（16.4%），骨髓抑制6 例（10.9%），腹瀉6 例（10.9%），手足綜合征4 例（7.2%），轉(zhuǎn)氨酶異常4例（7.2%），蛋白尿2 例（3.6%）。

2.3 免疫因子的變化

分析12 例患者有效血清標(biāo)本的免疫因子變化，結(jié)果顯示，sPD-L1 和IL-6 的變化與腫瘤體積變化呈正相關(guān)（r=0.874，P＜0.001；r=0.769，P=0.003）；sPD-1的變化與腫瘤體積變化呈負(fù)相關(guān)（r=-0.846，P=0.001）；IL-10 的變化與腫瘤體積的變化呈弱相關(guān)（r=0.538，P=0.071，圖4）。

圖2 51 例GBM 患者的OS

圖 3 典型GBM 患者的MRI

圖4 免疫因子的變化和腫瘤體積變化的相關(guān)性

3 討論

GBM 惡性程度高，侵襲性強(qiáng)。雖然近年來手術(shù)、術(shù)后放療和化療的綜合治療取得較大進(jìn)展，但GBM的復(fù)發(fā)率仍然較高，并且預(yù)后較差[11]。復(fù)發(fā)的GBM患者第二次進(jìn)展的中位生存期為14 周。目前，對于復(fù)發(fā)和難治性的GBM 尚無標(biāo)準(zhǔn)的治療方法[12]。

研究發(fā)現(xiàn)，GBM 的生長和復(fù)發(fā)與腫瘤血管生成密切相關(guān)，貝伐單抗作為一種抗血管內(nèi)皮生長因子的單克隆抗體，已用于治療復(fù)發(fā)性GBM，但存在嚴(yán)重的高血壓和出血等不良反應(yīng)[5]。阿帕替尼是一種新型口服小分子血管生成抑制劑，其高度選擇性地抑制VEGFR-2 的活性，阻斷血管內(nèi)皮生長因子與其受體結(jié)合后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而強(qiáng)烈抑制腫瘤血管生成，發(fā)揮其抗血管生成作用[13]。Wang 等[14]報道阿帕替尼聯(lián)合伊立替康治療GBM 有一定的療效，不良反應(yīng)可控。盡管有報道阿帕替尼聯(lián)合TMZ 治療復(fù)發(fā)GBM 的臨床研究，觀察到有一定的療效[6]，但鮮見研究阿帕替尼治療耐藥的TMZ 患者GBM 引起免疫因子的變化。

本研究結(jié)果顯示，mPFS 為5.9 個月，與Wang 等[15]和Ge 等[16]報道的阿帕替尼聯(lián)合TMZ 治療復(fù)發(fā)的GBM 研究結(jié)果相近，分別為6.0 個月和4.9 個月。上述研究報道的不良反應(yīng)主要為高血壓和手足綜合征，不良反應(yīng)可控，與本研究的主要不良反應(yīng)基本一致，說明阿帕替尼聯(lián)合TMZ 安全有效，不良反應(yīng)可控。

腫瘤微環(huán)境是由腫瘤間質(zhì)、浸潤的免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及免疫因子等構(gòu)成。已有足夠的證據(jù)說明細(xì)胞因子參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[17-19]。Landskron等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在慢性炎癥過程中，IL-6 等促炎細(xì)胞因子不僅可能導(dǎo)致腫瘤突變，還能刺激細(xì)胞增殖，降低凋亡。此外，這些細(xì)胞因子有利于腫瘤生長，在血管生成和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，而IL-10 等抗炎細(xì)胞因子參與腫瘤免疫逃逸。多項(xiàng)研究表明[21-25]，血清細(xì)胞因子水平的測定，如IL-6 或IL-10，可能與腫瘤的發(fā)生或預(yù)后不良有關(guān)。部分研究發(fā)現(xiàn)IL-6 和IL-10 參與腫瘤生長和免疫應(yīng)答[25-27]。Samaras 等[26]證實(shí)膠質(zhì)瘤患者外周血單核細(xì)胞分泌的IL-6 和IL-10 均高于健康對照組。GBM 患者腦脊液和血清中的IL-6 可用于預(yù)測患者的預(yù)后[27-28]。本研究觀察到IL-6 的變化與腫瘤體積變化呈正相關(guān)，IL-10 的表達(dá)水平與腫瘤體積變化呈弱相關(guān)性。Huang 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，抗血管生成藥物可以使異常的腫瘤血管正常化，并有可能使腫瘤免疫微環(huán)境向更具免疫支持性的方向轉(zhuǎn)變，與本研究結(jié)果一致。

Cloughesy 等[30]報道PD-L1 在部分GBM 腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞中的表達(dá)水平較高。本研究發(fā)現(xiàn)，用藥后腫瘤體積明顯縮小的患者sPD-L1 表達(dá)降低，sPD-1 表達(dá)升高，與腫瘤體積的變化呈顯著相關(guān)性。初步表明阿帕替尼治療TMZ 耐藥的GBM，不僅抑制腫瘤新生血管生成，而且可能激活GBM 免疫應(yīng)答發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，阿帕替尼治療TMZ 耐藥的復(fù)發(fā)GBM療效肯定，不良反應(yīng)可耐受，可能激活GBM 免疫應(yīng)答發(fā)揮抗腫瘤作用，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。