劉杰 李小航 李安安 劉昕 苗岳松 王志勇

尿路上皮癌（urothelial carcinoma，UC）作為最常見的惡性腫瘤，在中國泌尿系統(tǒng)腫瘤中的發(fā)病率及死亡率均位于前列[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的TNM 分期、分級(jí)以及血小板與白蛋白比值均有助于預(yù)測UC 患者的預(yù)后[2-3]，但這些預(yù)測指標(biāo)存在易受臨床因素干擾的缺陷。因此，需進(jìn)一步納入其他因素對(duì)患者的預(yù)后進(jìn)行精準(zhǔn)預(yù)測。在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）和循環(huán)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞（circulating tumor-derived endothelial cell，CTEC）起著不可或缺的作用[4]，而CTEC 對(duì)預(yù)測UC 患者的預(yù)后價(jià)值有待進(jìn)一步證實(shí)。本研究旨在通過分析外周血中CTC 和CTEC 與UC 患者預(yù)后關(guān)系，為臨床預(yù)測患者預(yù)后提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2018年5月至2020年1月于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院首次診治的161 例患者的臨床病理資料，以100 例UC 為試驗(yàn)組，并以患者的腫瘤最大徑3 cm 再進(jìn)行分組[5-6]，以46 例尿路上皮的良性疾病和15 例健康患者為對(duì)照組。試驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)：1）年齡＞18 歲；2）組織病理學(xué)確診為UC 且影像學(xué)檢查除外合并其他腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）受試對(duì)象合并血管炎、膿毒性休克和周圍血管疾?。?）不能耐受手術(shù)。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并得到患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 人外周血CTC 差相富集試劑盒、CD31-iFISH CTC 檢測試劑盒均購自美國Cytelligen 公司，CD45 單克隆抗體購自美國Abbkine公司。G1-8 023 微型臺(tái)式真空泵購自中國Kylin-Bell公司，S500-24 熒光原位雜交儀購自德國Leica 公司，DS-Fi1c 顯微鏡相機(jī)購自日本Nikon 公司。

1.2.2 差相富集聯(lián)合免疫染色熒光原位雜交技術(shù) 術(shù)前根據(jù)Lin 等[7]研究采用差相富集聯(lián)合免疫染色熒光原位雜交（subtraction enrichment and immunostainingfluorescenceinsituhybridization，SE-iFISH）技術(shù)富集及識(shí)別CTC 和CTEC。血液樣本離心去除血漿，后加入Cytelligen 細(xì)胞分離液去除紅細(xì)胞，再次離心除去白膜層及上清液，加入免疫磁珠（magnetic beads），去除白細(xì)胞，加入清洗液洗滌CTC 和CTEC，可得到富含CTC 和CTEC 的細(xì)胞懸液，取細(xì)胞懸液進(jìn)行固定、干燥、封片，最后依次加入CEP-8 探針雜交、CD45 單克隆抗體、CD31 單克隆抗體以及DAPI 細(xì)胞核染色液進(jìn)行細(xì)胞染色，由兩位檢驗(yàn)科醫(yī)生在熒光顯微鏡下鑒定CTC、CTEC。

1.2.3 CTC 和CTEC 結(jié)果判定 熒光顯微鏡下讀片，在紅色通道下尋找可疑細(xì)胞，無紅色外圈（CD45）的藍(lán)色細(xì)胞核（DAPI）細(xì)胞為可疑目標(biāo)，并觀察CTC 中的紅色亮點(diǎn)是否在細(xì)胞核內(nèi)；再轉(zhuǎn)橙色通道確認(rèn)熒光信號(hào)點(diǎn)（CEP8）是否≥3 個(gè)；最后轉(zhuǎn)綠色通道，觀察可疑細(xì)胞核周是否有綠色信號(hào)（CD31）。CTC 陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為DAPI 陽性、CD45 陰性、CD31 陰性、CEP8≥3 倍體，CTEC 陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為DAPI 陽性、CD45 陰性、CD31 陽性、CEP8≥3 倍體。依據(jù)受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）確定CTC 和CTEC 的診斷截?cái)嘀担⒎譃殛栃越M和陰性組。

1.2.4 隨訪 采用電話或定期門診隨訪，UC 患者術(shù)后1年內(nèi)每間隔3 個(gè)月隨訪1 次，1～3年內(nèi)每間隔6個(gè)月隨訪1 次，內(nèi)容包括影像學(xué)和膀胱鏡檢查。檢查結(jié)果懷疑復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移患者，診斷以組織病理學(xué)為金標(biāo)準(zhǔn)。主要終點(diǎn)事件為無進(jìn)展生存（progression-free survival，PFS）期，為采集血液樣本至術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡的時(shí)間。隨訪截至2021年1月。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2分析，采用Kaplan-Meier 法和Log rank 法進(jìn)行生存分析，采用 Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析。以P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTC 和CTEC 的形態(tài)特征

在熒光顯微鏡下，CTC 為1 個(gè)圓形藍(lán)色熒光核，核內(nèi)有4 個(gè)紅色信號(hào)點(diǎn)，其中DAPI 陽性、CD45 陰性、CD31 陰性、CEP8 為4 倍體（圖1A）。CTEC 表現(xiàn)為1 個(gè)圓形藍(lán)色熒光核，核內(nèi)有7 個(gè)紅色信號(hào)點(diǎn)，可見核周成簇點(diǎn)狀綠色信號(hào)，其中DAPI 陽性、CD45 陰性、CD31 陽性、CEP8 為7 倍體（圖1B）。

圖1 熒光顯微鏡下CTC 和CTEC 陽性形態(tài)特征

2.2 CTC 和CTEC 截?cái)嘀档呐卸?/h3>

試驗(yàn)組中CTC 和CTEC 陽性率分別為74/100（74.0%）和66/100（66.0%），與對(duì)照組中的6/61（9.8%）和3/61（4.9%）進(jìn)行比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。CTC 的ROC 曲線AUC 為0.844，當(dāng)切點(diǎn)為0.5 時(shí)Youden 指數(shù)最大；CTEC 的AUC 為0.812，當(dāng)切點(diǎn)為0.5 時(shí)Youden 指數(shù)最大。因CTC 和CTEC 只能取整數(shù)，故以每7.5 mL 外周靜脈血中CTC 或CTEC 判定≥1 個(gè)為陽性指標(biāo)（圖2）。

圖2 試驗(yàn)組與對(duì)照組的CTC 和CTECROC 曲線分析

2.3 術(shù)前UC 患者的CTC 和CTEC 陽性率與臨床特征的關(guān)系

UC 患者的腫瘤最大徑＜3 cm 的CTC 陽性率為64.8%（35/54），最大徑≥3 cm 為84.8%（39/46），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023）；多發(fā)病灶患者的CTEC陽性率為80.5%（33/41），單發(fā)病灶為55.9%（33/59），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.011）；患者的CTC 陽性率與病理類型、分化程度、腫瘤T 分期、病灶數(shù)比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），CTC 和CTEC 陽性率與其他臨床特征比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表1）。

表1 100 例UC 患者的臨床特征與術(shù)前CTC 及CTEC 檢測情況的關(guān)系

表1 100 例UC 患者的臨床特征與術(shù)前CTC 及CTEC 檢測情況的關(guān)系 （續(xù)表1）

2.4 生存分析

100 例UC 患者中位隨訪時(shí)間為14（1～24）個(gè)月，其中25 例發(fā)生復(fù)發(fā)或死亡。單因素分析顯示腫瘤T分期、病灶數(shù)、CTC 組、CTEC 組與PFS 具有顯著性相關(guān)。將單因素分析中有意義的臨床因素納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析，CTEC 組為患者PFS的獨(dú)立預(yù)后因素（P=0.05，表2～3）。

表2 影響UC 患者預(yù)后的Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型單因素分析

CTC 和CTEC 陽性組中位隨訪時(shí)間分別為12.0個(gè)月和12.5 個(gè)月，分別短于陰性組的20.0 個(gè)月和16.5 個(gè)月。Kaplan-Meier 法分析顯示，腫瘤T3～4期、CTC 和 CTEC 陽性組的術(shù)后PFS 顯著短于腫瘤T1～2期、CTC 和CTEC 陰性組（P＜0.05），采用Log rank 法分析顯示CTEC 組與PFS 相關(guān)性最大（P=0.002）。將CTC 組和CTEC 組中同時(shí)陽性的患者視為陽性，其余患者視為陰性，結(jié)果顯示與PFS 具有顯著性相關(guān)（P＜0.001，圖3）。

表3 影響UC 患者預(yù)后的Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析

圖3 Kaplan-Meier 法分析術(shù)前各因素對(duì)患者術(shù)后PFS 的影響

3 討論

循環(huán)罕見細(xì)胞（CRC）主要由CTC 和CTEC 組成[4]。研究發(fā)現(xiàn)，從原發(fā)病灶脫落的腫瘤細(xì)胞可發(fā)生局部浸潤、游走進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)、定植靶器官、外滲和遷移，最終形成新的微小轉(zhuǎn)移病灶，而腫瘤的進(jìn)展取決于血管生成，CTEC 是促進(jìn)腫瘤血管生成的重要生物標(biāo)志物[8]。盡管持續(xù)有腫瘤細(xì)胞從病灶脫落進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)中，但其中絕大部分會(huì)因機(jī)體的免疫力和血流剪切力或氧化應(yīng)力而被清除[9]。因此，腫瘤患者外周血中的CTC 和CTEC 含量極低，CTC 幾乎在每1 億個(gè)外周血細(xì)胞中僅有1 個(gè)[10]，檢測方法的靈敏性顯得尤為重要。本研究采用SE-iFISH 技術(shù)是一種新型的檢測手段，結(jié)果顯示CTC 靈敏度為74.0%，CTEC 靈敏度為66.0%。Qi 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，基于葉酸受體α（FRα）技術(shù)檢測膀胱癌外周血中的CTC 靈敏度為70%。Flaig 等[12]研究顯示，CellSearch 技術(shù)檢測UC患者的CTC 陽性率僅為27.27%。因此，SE-iFISH 技術(shù)對(duì)UC 患者的診斷性能更佳，可能因?yàn)闄z測過程中不受腫瘤細(xì)胞大小、血液滲透壓以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響[7]。本研究進(jìn)一步分析UC 患者臨床特征與CTC 和CTEC 陽性率的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，病理類型、腫瘤最大徑、分化程度、病灶數(shù)和腫瘤T 分期與CTC 陽性率進(jìn)行比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中腫瘤T分期越高，患者外周血中的CTC 檢出率亦越高，這可能與T3～4期患者更易發(fā)生進(jìn)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與年齡、性別、浸潤程度、是否血尿進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究對(duì)CTEC 陽性率分析發(fā)現(xiàn)，僅病灶數(shù)與CTEC 陽性率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.011），可能與CTEC 促進(jìn)腫瘤血管生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

Lin 等[4]研究顯示，CTEC 與CTC 的相互作用可能在腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和形成過程中有重要的作用。Strijbos 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，采用多種技術(shù)檢測162 例去勢(shì)抵抗性前列腺癌患者的CTC 和CTEC 水平，CTEC數(shù)目增加組與總生存期（overall survival，OS）下降有關(guān)，CTEC 數(shù)目≥5 個(gè)的患者同樣為預(yù)測OS 降低的重要因素，Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析顯示CTC和CTEC 均為患者OS 獨(dú)立因素。Rink 等[14]采用CellSearch 系統(tǒng)檢測術(shù)前100 例膀胱癌患者，23 例CTC 陽性患者中14 例復(fù)發(fā)，而77 例CTC 陰性患者中僅10 例復(fù)發(fā)，Kaplan-Meier 法分析顯示CTC 陽性與腫瘤的復(fù)發(fā)相關(guān)，并且是腫瘤復(fù)發(fā)和總死亡率的獨(dú)立預(yù)測因素。本研究的中位隨訪時(shí)間為14（1～24）個(gè)月，CTC 和CTEC 陽性組UC 患者的中位隨訪時(shí)間明顯短于陰性組，生存分析結(jié)果顯示與PFS 具有顯著性相關(guān)，提示CTC 和CTEC 在疾病的進(jìn)展方面具有預(yù)測價(jià)值，CTC 或CTEC 陰性患者與陽性患者相比，發(fā)生不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，對(duì)患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)分層具有重要的臨床意義。Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析表明，CTEC 是UC 患者唯一的獨(dú)立預(yù)后因子，CTEC 陽性患者的腫瘤復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險(xiǎn)比是CTEC陰性患者的4.471 倍。未來CTEC 可能成為UC 患者預(yù)后的有力監(jiān)測指標(biāo)。

綜上所述，本研究通過對(duì)CTC 和CTEC 檢測，不僅論證其在預(yù)測UC 患者預(yù)后的作用，也為將來從分子和細(xì)胞層面揭示腫瘤血管生成、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，完善患者的臨床診療策略起著重要作用。因受限于試驗(yàn)樣本量和隨訪時(shí)間的影響，仍需進(jìn)行前瞻性、多中心、長時(shí)間隨訪進(jìn)一步完善。